مقالة منهجية

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

DOI:

10.3791/4448

⸱

أكتوبر 14, 2012

 , 
1Department of Neuroscience, Tufts University, 2Neuroscience Program, Tufts Sackler School of Graduate Biomedical Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة توضح إجراءات إنشاء محور عصبي رواية العصبية و(الفلكية) الدبقية منصة شارك في الثقافة. في هذا النظام المشترك والثقافة، والتلاعب التفاعل المباشر بين محور عصبي واحد (واحد الخلية الدبقية) يصبح ممكنا، مما يسمح للتحليل الآلي للعصبون إشارات متبادلة لالدبقية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية المناسبة لتفاعل الخلايا الدبقية أمر بالغ الأهمية للعمل الفسيولوجية للجهاز العصبي المركزي (CNS). وتوسطت متطور هذا الاتصال ثنائي الاتجاه عن طريق محددة مسارات الإشارات العصبية بين الخلايا الدبقية و1،2. تحديد وتوصيف هذه المسارات إشارة ضرورية لفهم كيفية الخلايا العصبية لعلم وظائف الأعضاء الدبقية التفاعل CNS الأشكال. سابقا، تم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الثقافات المختلطة المستخدمة على نطاق واسع لاختبار وتميز بين مسارات الإشارات العصبية والخلايا الدبقية. ما تعلمناه من هذه الاستعدادات وغيرها من الأدوات في الجسم الحي، ومع ذلك، فقد اقترح أن يشير المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وقعت في كثير من الأحيان في حجرات داخل الخلايا العصبية المحددة (أي محور عصبي، التغصنات، أو سوما) 3. هذا يجعل من المهم لوضع نظام ثقافة جديدة تسمح فصل الأجزاء العصبية ويتناول على وجه التحديد التفاعل بين الخلايا الدبقية والعصبيةنال محاور عصبية / التشعبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النظام التقليدي ثقافة مختلطة غير قادر على التمييز بين العوامل القابلة للذوبان وإشارات الاتصال المباشر بين الخلايا العصبية وغشاء الخلايا الدبقية. وعلاوة على ذلك، فإن كمية كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في نظام المشاركة في الثقافة التقليدية تفتقر إلى القرار اللازم لمراقبة التفاعل بين محور عصبي واحد وخلية الدبقية.

في هذه الدراسة، ونحن تصف الرواية ومحور عصبي الدبقية نظام المشاركة في الثقافة مع استخدام منصة ميكروفلويديك الثقافة (MCP). في هذا النظام شارك في الثقافة، والمثقف الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في غرفتين منفصلتين التي ترتبط من خلال قنوات متعددة المركزية. في هذا المنبر الثقافة ميكروفلويديك، يمكن لعمليات الخلايا العصبية فقط (محاور عصبية خاصة) أدخل الجانب الدبقية عن طريق القنوات المركزية. في تركيبة مع وضع العلامات القوية بروتين فلوري، وهذا النظام يسمح الفحص المباشر للإشارة مسارات التفاعلات بين محور عصبي / شجيري والدبقية، فإن مثل هذاق محور عصبي بوساطة تنظيم النسخي في، الدبقية الاتجار مستقبلات الخلايا الدبقية بوساطة الخلايا العصبية في محطات، والخلايا الدبقية بوساطة نمو محور عصبي. قطر الدائرة الضيقة ليحظر أيضا بشكل كبير من تدفق المتوسطة الخلايا العصبية التخصيب الى غرفة الدبقية، وتسهيل التحقيق للتفاعل غشاء من البروتين مباشرة بين محاور عصبية / التشعبات والسطوح الدبقية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جمعية الثقافة ميكروفلويديك الدائرة (MCP)

  1. MCP (الشكل 1) هي الدوائر المفتوحة مصممة للثقافات مجزا من أنواع مختلفة من الخلايا 4. لديها عادة اثنين من مقصورات التي ترتبط من خلال القنوات المركزية (3 ميكرون في القطر). جمعية MCP مع الزجاج ذات قاع الأطباق ضروري لإعداد الثقافات واللاحقة تحليل التصوير.
  2. الأولى، ومعطف العقيمة ذات قاع زجاجي مع الأطباق Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) الذائب في بورات ثنائي الصوديوم (سيغما الدريخ، 10 ملي درجة الحموضة 8.5) وحضنت بين عشية وضحاها في C. ° 37
  3. في اليوم التالي، تم غسلها المغلفة الزجاج ذات قاع أطباق ثلاث مرات مع DDH 2 O ويجفف تحت غطاء محرك السيارة والدخان العقيمة. كانت الأطباق الزجاجية القاع ثم المغلفة مع مزيد من laminin (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) وتجفيفها تحت أشعة UV لمدة 1 ساعة. الأطباق المغلفة تكون جاهزة للاستخدام أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. هذه لطلاءإعادة طلاء الخلايا العصبية اللازمة لوالخلايا النجمية في الثقافة المشتركة.
  4. لتجميع منصة الثقافة، وضعت منصات الثقافة ميكروفلويديك على رأس من الأطباق الزجاجية ذات قاع المغلفة مع قنوات الاتصال المركزية على الجانب السفلي لتشكيل ختم مشددة. أضيفت الخلايا العصبية العادية أو وسائل الثقافة نجمية (من المناطق الطلاء الخلية) على كلا الجانبين (الشكل 1) في MCP تجميعها وحضنت لمدة 2-4 ساعات في C ° 37، لضمان عدم وجود تسرب بين MCP والزجاج قاع الطبق. لقد اختبرنا قبل الخلايا المتوسطة مع الطلاء لضمان عدم وجود تسرب. وينبغي جمعية MCP على صحن من الزجاج ذات قاع الطازجة قبل استخدامها.

2. إعداد الثقافة الخلايا العصبية ومحاور عصبية تحريض الخلايا العصبية في تجميعها MCP

  1. وأعدت طازجة القشرية مزارع الخلايا العصبية الجنينية من أدمغة فئران 14-16 يوما. وتتكون ثقافة المتوسط ​​الخلايا العصبية من neurobasal المتوسطة، 2٪ B27 neurobasaL الملحق، 2 مم الجلوتامين بإضافة 1٪ من GlutaMAX 100X، و 1٪ البنسلين-streptomysin. بعد تشريح مخ الفأر، تمت إزالة القشرة من السحايا تحت المجهر تشريح. ومفروم ثم الأنسجة مع شفرة حلاقة لجعل كتل الأنسجة الصغيرة من أجل زيادة مساحة السطح المعرض للالتربسين. وtrypsinized كتل الأنسجة (سيغما الدريخ، التربسين 0.05٪) لمدة 10 دقيقة في حمام مائي 37 ° C، وفصلها بعد ذلك بلطف بواسطة سحن مع ماصة باستور النار مصقول. تم تصفية الخلايا من خلال مصفاة فصل ميكرون 70 إلى جمع واضحة التعليق الخلية العصبية.
  2. كانت مطلية الخلايا العصبية (2-3 × 10 6 / مل، 150 ميكرولتر) على المناطق الطلاء الخلية على الجانب الأيمن (الشكل 1) من MCP تجميعها بحيث الخلايا العصبية يمكن أن نعلق في الخلية الاحتفاظ المنطقة (الشكل 1). كانت مطلية الخلايا العصبية الطازجة مع طلاء الخلايا العصبية التي المتوسطة وتستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (Hyclone) في اللوائح التنظيميةR المتوسطة الخلايا العصبية الثقافة. فقط لأن الخلايا العصبية التي تربط الخلايا في منطقة الاحتفاظ القابلة للنمو محاور عصبية في الجانب الآخر من MCP تجميعها من خلال القنوات المركزية، من المهم أن الكثافة العالية لوحة من الخلايا العصبية في منطقة الخلية الطلاء لضمان ما يكفي من الخلايا العصبية هي التي تعلق على خلية الاحتفاظ المنطقة. يظهر صورة ممثل كثافة عالية من محاور عصبية الخلايا العصبية في الشكل 2A.
  3. في اليوم التالي، تم استبدال المتوسطة الطلاء من قبل الخلايا العصبية الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة العادية. تم انجازه من قبل الشفط تغيير المتوسطة بعناية المتوسطة من الخلية المنطقة الطلاء للغرفة، ولكن ليس من الخلية المنطقة الإبقاء على MCP تجميعها. من أجل تجنب فقاعات الهواء في الخلية والاحتفاظ المنطقة الوسطى قنوات الاتصال وسوف فقاعات الهواء تمنع بشدة ثمرة محور عصبي ودخولها لاحقا في القنوات المركزية في MCP. وأضيف أيضا خلايا الدبقية عامل التغذية العصبية المشتقة (GDNF، 10-20 نانوغرام / مل) على الجانب (اليسار) أخرىللغرفة في نفس اليوم لتسهيل ثمرة تحريض محور عصبي 5 من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP (الشكل 2A). ويلاحظ أيضا قدر لا بأس به من عفوية دون ثمرة محوار GDNF من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP. ويلاحظ في كثير من الأحيان محاور عصبية التي تدخل في قناة المركزي 2-3 أيام بعد الطلاء. وبمجرد أن يدخل في محاور عصبية القناة الوسطى، وعادة ما يدخلون الجانب الآخر خلال يوم واحد. محاور عصبية سليمة عادة ما تكون لمدة أسبوع على الأقل بعد دخول الجانب الآخر.

3. إضافة إلى الخلايا النجمية مثقف MCP لإنشاء مجزأة المشارك ثقافة النظام

وأعدت الثقافات نجمية الأساسي من المخ P1-3 الماوس الجرو. الإجراء تفارق الدماغ مشابه للإجراء زنزانة انفرادية العصبية المذكورة أعلاه. كانت مطلية 1 الخلايا النجمية في صحن 10 سم التي تم مسبقا-المغلفة مع Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل). تم تغيير ثقافة المتوسط ​​نجمية (DMEM، و 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين-streptomysin) كل يوم لمدة اليومين المقبلين لإزالة الحطام. بعد ذلك، تم تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام.

  1. الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية ومتموجة و150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1x10 6 / مل) إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت فقط في الجانب الأيسر من وتجميعها MCP. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تدفق سوى الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحددها د مضانتم العثور نعم) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6.
  2. الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية متموجة و 150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1 × 10 6 / مل) تم إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت للتو الى اليسار جانب من MCP تجميعها. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تم العثور على تدفق فقط الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحدده الأصباغ مضان) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6.
  3. بعد إعادة الطلاء من الخلايا النجمية، محاور عصبية التي دخلت الجانب الأيسر من MCP تجميعها تتفاعل مباشرة مع النجمocytes عن طريق الاتصال المباشر إما محور عصبي أو إطلاق العوامل القابلة للذوبان. المناعية من astroglial GLT1 غشاء البلازما نقل الغلوتامات والعصبية تويولين βIII-أجريت لتصور التفاعل بين الخلايا النجمية ومحاور عصبية، وكما هو مبين في الشكل 2D-F.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوقت الفاصل بين التصوير من محور عصبي تحليل الناجم عن تفعيل الخلايا النجمية في المروج GLT1

الخلايا العصبية ومجزا نجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح فقط العمليات العصبية، محاور عصبية خاصة، للتفاعل مع انتقائي الخلايا النجمية. بعد نجاح إنشاء محور عصبي ونجمية (أو الخلايا الدبقية الأخرى) شاركت في الثقافة MCP تجميعها، يمكن دراسة أنواع مختلفة من محور عصبي الدبقية التفاعلات مثل؛ محور عصبي الناجم عن تفعيل جين astroglial تفع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية القائمة على MCP والخلايا النجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح تشريح الخلايا العصبية إشارات تفصيلية لمسارات دبق نجمي الخلايا عن طريق السماح فقط محاور عصبية تمرير القنوات المركزية والتفاعل مع الخلايا astroglial. ويمكن هذا النظام شارك في وضع مريح الثقافة مع الخلايا العصبية التقليدية والإجراءات الثقافة نجمية. وصفنا أيضا التطبيق العملي لهذا النظام المشترك من خلال توظيف الثقافة مراسل EGFP مقرها لإثبات محور عصبي التي تعتمد على تفعيل الخلايا النجمية في المروج GLT1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الدكتور جيفري روثشتين لتوفير BAC GLT1 الفئران EGFP والأجسام المضادة GLT1؛ تافتس مركز البحوث العصبية (NIH P30 NS047243؛ PI، روب جاكسون) لتوفير المرافق الأساسية قيمة؛ جديد كلية منحة التوظيف (NIH P30-02 5P30NS069254 ؛ PI، فيل هايدون) في علم الأعصاب تافتس الإدارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المصل البقري الجنين Hyclone SH30070.03 وبالنسبة للطلاء الخلايا العصبية للعصبون المتوسطة cutlure
المصل البقري الجنين سيغما الدريخ F4135 لثقافة المتوسط ​​نجمية
الدبقية مشتقة عامل الأعصاب R & D أنظمة 212-GD تطبيق 10-20 نانوغرام / مل إلى جانب الخلايا العصبية من غرفة
Dulbecco تعديل النسر المتوسط ​​ارتفاع نسبة الجلوكوز سيغما الدريخ 11995
70 مم مصفاة الخلية BD الصقر 352350
طبق زجاج معقمة أسفل شركة ماتيك
منصات الثقافة ميكروفلويديك Xona على microfluidics LLC SND150
6 آبار لوحة الثقافة Cellstar 657 160

مستنبت الخلايا العصبية

  • Neurobasal المتوسطة
  • 2٪ B27 الملحق Neurobasal
  • 2 الغلوتامات ملي بإضافة 1٪ 100X GlutaMAX
  • 1٪ البنسلين-streptomysin

الخلايا العصبية للخلية ثقافة المتوسط ​​الطلاء

  • Neurobasal المتوسطة
  • 2٪ B27 الملحق Neurobasal
  • 2 الغلوتامات ملي بإضافة 1٪ 100X GlutaMAX
  • 1٪ البنسلين-streptomysin
  • 5٪ مصل بقري جنيني SH30070.03

نجمية مستنبت

  • Dulbecco تعديل عصامGLE ارتفاع نسبة الجلوكوز المتوسطة
  • 10٪ الجنين مصل بقري F4135
  • 1٪ البنسلين-streptomysin

الجدول 1. المواد المستخدمة في محور عصبي ميكروفلويديك منصة القائمة على العصبية والخلايا الدبقية الثقافة نظام المشاركة في الثقافة.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
  2. Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
  3. Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
  4. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
  5. Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
  6. Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
  7. Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
  8. Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
  9. Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
  10. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
  11. Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GT One EGFP

مقالات ذات صلة