التعبير خارج الرحم هو أسلوب واحد لتوضيح دور microRNAs في نمو الدماغ. ومع ذلك، واستهداف مناطق محددة باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضة هو التحدي. هنا، وتبين لنا وسيلة فعالة لمناطق الدماغ المتوسط بطني وظهري electroporate انتقائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط الفرخ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الرنا غير الترميز لاعبين إضافية في تنظيم التعبير الجيني. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من المجالات المحددة يوفر أداة فريدة للسيطرة المكاني والزماني للخارج الرحم التعبير الرنا الميكروي. ومع ذلك، وهياكل الدماغ مثل المخ الأوسط بطني بطني هي صعبة نوعا ما للوصول إلى أي تلاعب. هنا، علينا أن نظهر وسيلة فعالة ل electroporate ميرنا في الدماغ المتوسط البطني باستخدام أقطاب البلاتين رقيقة. يقدم هذا الأسلوب وسيلة يمكن الاعتماد عليها لبالنقل مناطق معينة من المخ الأوسط وأداة مفيدة لفي الدراسات المجراة.
المقدمة
الاعتراف الرنا صغيرة غير الترميز كلاعبين إضافية للتعبير الجين أطلقت التعقيد جديدة لتنظيم الجيني البرمجة / الجينات. أنواع مختلفة من الرنا غير الترميز لها أهمية وظيفية في الخلايا العصبية، بما في ذلك الصغيرة غير الترميز الرنا 1-4. MicroRNAs (مير أو ميرنا) على سبيل المثال تظهر ملامح التعبير متميزة وتغيير في العقول النامية 5. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من افراخ الدجاج يوفر فرصة فريدة للسيطرة الزمانية والمكانية في التعبير الجيني وإسكات خلال التنمية.
هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة لأداء التعبير خارج الرحم من ميرس في مناطق معينة من الدماغ المتوسط الفرخ في البيضة باستخدام التثقيب الكهربائي 6-10. لضمان وجود تأثير طويل الأمد لهذه الرناوات الصغيرة غير الترميز في الخلايا، تم استنساخ تسلسل الحمض النووي من ميرس في ناقلات أحادية أو ثنائية cistronic. لفي التثقيب الكهربائي البيضة، مير تحتوي على الخامسيتم حقن ector في الأنبوب العصبي الدماغ المتوسط من خلال تعريض الجنين بعد إجراء نافذة صغيرة في قشرة البيضة. لبالنقل مناطق معينة من الدماغ المتوسط بالإضافة صغيرة (الأنود) وناقص (الكاثود) وتوضع أقطاب البلاتين في مواقف معينة. لترنسفكأيشن الدماغ المتوسط البطني، يتم وضع القطب الموجب تحت الدماغ المتوسط بطني اليسار والكاثود فوق النصف الأيمن من الدماغ المتوسط قبل تطبيق الحالي. يتم إغلاق فتحة في قشر البيض مع الشريط ويتم تحضين الأجنة لطالما المطلوبة لأي تحليل. هذا الأسلوب وقد وصفت في الأصل من قبل موراماتسو وآخرون. 6 وتحسينها من خلال Momose وآخرون. 8 لترنسفكأيشن منطقة معينة.
نظرة عامة التخطيطي.
- يتعرض الجنين في البيضة من خلال خفض نافذة صغيرة في اله قشر البيض.
- يتم حقن ناقلات المنحل (ق) في الدماغ المتوسط باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة.
- قطبين - وضعت بالتوازي أو تحت وفوق الجنين - توليد حقل كهربائي نابض.
- الحقل الكهربائي يخلق زمنيا المسام في غشاء الخلية، والتي تسهل الدخول إلى الخلية بواسطة الحمض النووي المشحونة سلبا (أو RNA) تنجذب إلى القطب الموجب 11،12.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. متطلبات والبيضة التثقيب الكهربائي
- إعداد بناء ناقلات: وقد صممت مير الشعور والعقاقير الاشعال بعد تعليمات من AMBION، صلب وligated في APAI / EcoRI هضمها pSilencer U6.1 النواقل. بعد التحول الناجح كانت تزرع واحد من الحيوانات المستنسخة الناتجة عنها، وكان معزولا pSilencer البلازميد بواسطة طريقة تحلل القلوية باستخدام Quiagen ميدي إعداد عدة.
- الأقطاب الكهربائية: أقطاب يمكن شراؤها بسهولة أو أن يبنى 13. نستخدم أقطاب عصامي من سلك البلاتين (Φ = 0.2، 0.25، أو 0.5 مليمتر في القطر) أو في بعض الحالات وحتى أصغر سلك التنغستن القطب (Φ = 0.1 ملم) 8 اعتمادا على المنطقة التي نريد ل electroporate. لتجنب الحارقة من الأنسجة، ونحن نستخدم كقاعدة وأقرب إلى الأنسجة أرق الأقطاب. ل electroporation واسعة من المخ الأوسط، ونحن نستخدم 0.5 مم أسلاك البلاتين ملحوم إلى أنبوبي النحاس / الفولاذ المقاوم للصدأرمح وثابتة لحامل الكهربائي مع مسافة 3-5 مم (الشكل 1). ل electroporate مجالات محددة، ونحن نستخدم 0.25 ملم الأنودات سلك البلاتين 0.2 ملم وسلك البلاتين أو 0.1 ملم لالتنغستن القطب السالب مع المسافة التقريبية من 1 ملم أو أقل.
- حلول: هل الحلول التالية جاهزة:
- تعقيمها قارع الأجراس الدجاج، ودرجة الحموضة 7.5 (9.0 غرام كلوريد الصوديوم، 0.42 ز بوكل، 0.24 غرام CaCl2، تذوب في الماء المقطر 1 لتر).
- برنامج تلفزيوني (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 0.24 غ KH 2 PO4، 1.44 ز نا 2 هبو 4، تذوب في 1L المقطر H 2 O).
- سريع الأخضر: محلول المخزون 10 ملغ / مل H 2 O المقطر
- الحبر تجفيف بطيئة (أقل اللك وبالتالي التسمم أقل للجنين). ملاحظة: مرشح مزدوج اللون الأزرق تعلق على مصباح الألياف البصرية كما هو موضح في كانتو-سولير وأدلر 14 يعزز التباين ويمكن القضاء على الحاجة لحقن الحبر.
الشكل 1. الرسم التخطيطي من الأقطاب الكهربائية وحامل القطب. كان ملحوم (A، B، C) سلك البلاتين إلى جانب واحد من أنبوبي رمح الفولاذ المقاوم للصدأ. تم حفر ثقب في الجانب الآخر من رمح أنبوبي بالتالي أن المقابس دبوس يمكن يلائمه (A) تم ربط الأحمر والأسلاك زرقاء اللون لشمعات دبوس. في الطرف المقابل تم تركيب السلك إلى موصلات الموز التي تعمل مع المقابس الكهربائية من electroporator. (A، C) عازمة سلك البلاتين في ملاكا من 90 درجة. هناك طبقة من طلاء الأظافر عزل رمح فوق منحنى.
2. الاستعدادات قبل مباشرة في البيضة التثقيب الكهربائي
- إعداد المواد التالية:
- تمييع الحبر مع الدجاج قارع الأجراس 01:06، إضافة محلول مضاد حيوي مضاد فطري (100X من Gibcس) 1:100.
- إعداد الحل ناقلات: 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي محددة في H 2 O تستكمل مع الأخضر سريع (1:20).
- تعقيم الملقط، مقص، إبرة التنغستن الأقطاب ومع الايثانول 70٪.
- سحب بال micropipettes للحقن الحمض النووي من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (طول القطر الخارجي لل: 100 مم × 0.9 مم). نستخدم ساحبة بسيطة PUL-1 (WPI، برلين) مع الإعدادات هو مبين في الجدول رقم 1.
- تعيين المعلمات من electroporator كما هو مبين في الجدول رقم 2.
| المعلمات | القيم |
| حرارة | 350 |
| سحب | 100 |
| سرعة | 50 |
| تأخير | 200 |
الجدول 1. إعدادات لPUL-1
| المعلمات | القيم |
| تردد | 50 هرتز |
| تأخير | 20 - 50 ميللي ثانية * |
| عرض | 20 ميللي ثانية |
| الجهد | 8-25 V * |
| نبض | 3-5 مرات |
| * اعتمادا على قطر الكهربائي والمسافة. من فضلكتأخذ ذلك في الاعتبار عند تغيير أحد المعلمات. | |
الجدول 2. إعدادات لتحفيز نبض
- إعداد افراخ الدجاج ل electroporation:
- احتضان بيض الدجاج المخصب على الجانب يعد لها عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 65٪ لمدة 39 ساعة للحصول على الأجنة بين همبرغر وهاميلتون (سمو) مراحل 15 9-11. يستقر الجنين في أعلى جزء من البيض، لذلك يجب وضع علامة عليه مع خط قلم رصاص.
- تطهير البيض مع الايثانول 70٪.
- يخترق البويضة في الجانب الأوسع، حيث يجب أن يكون تجويف الهواء.
- إزالة 1-2 مل من بياض البيض. وهذا فصل الجنين من قشر البيض.
- التشيلو الشريط قشر البيض لتجنب شظايا قذيفة تسقط على الجنين. استخدام زوج من مقص لقطع نافذة صغيرة في قشر البيض حول خط قلم رصاص.
- حقن قليلا من الحبرتحت المنطقة المعتمة لتصور الجنين.
- اجراء خفض في الغشاء المحي مع إبرة التنغستن شحذ لتحقيق إمكانية الوصول بشكل أفضل من الجنين للحقن الحمض النووي و electroporation.
3. التثقيب الكهربائي والحضانة
- إضافة بضع قطرات من محلول دافئ رينغر على الأجنة. وهذا يقلل من الأجنة، ومنع ارتفاع درجة الحرارة، وتمسكه من الأقطاب الكهربائية إلى الأنسجة وتوفير وسيلة للتيار بين القطبين.
- حقن محلول ناقلات في تجويف الأنبوب العصبي في الدماغ المتوسط المستوى. إذا كان لديك ناقلات التعبير الحمض النووي لا يحتوي على الجين مراسل (مثل EGFP)، إضافة قليلا أقل تركيزا مراسل ناقلات الجينات (1 ميكروغرام / ميكرولتر مير معربا عن ناقلات إلى 0.9 ميكروغرام / ميكرولتر مراسل ناقلات الجينات) في حل الحمض النووي. وهذا يضمن أن تتعرف على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في وقت لاحق 8. ونحن نستخدم ما يسمى متجه pCAX، هدية عينية جيئة وذهابام C. كرول 13.
- لترنسفكأيشن واسعة من الدماغ المتوسط، وضع أقطاب اليسار واليمين من الجنين في ذروة الدماغ المتوسط. يجب أن تكون المسافة بين الأقطاب حوالي 3-5 ملم. الإعدادات الأخرى هي 15V، 20 ميللي ثانية البقول و 50 ميللي ثانية تأخير لسمو 10. تغيير موقف القطبين قليلا على طول (DV) محور ظهراني بطني من الدماغ المتوسط ويؤكد على ترنسفكأيشن واسعة من الخلايا أكثر ترنسفكأيشن محور DV.
- لترنسفكأيشن بطني، وإضافة بعض قارع الأجراس لرفع الرأس من غشاء الصفار ووضع الأنود تحت الدماغ المتوسط البطني. إذا لم يرتفع رأسه دفع القطب تحت الغشاء الذي يفصل صفار البيض والجنين لتجنب الحارقة في الأنبوب العصبي. يجب وضع الكاثود فوق الدماغ المتوسط ظهراني أفقيا المعاكس إلى القطب الموجب. لا تلمس الأنبوب العصبي. نحن بالنقل النصف البطني الأيسر من الدماغ المتوسط لتجنب أي صعوبات مع التنمية القلب. المسافة بين الأقطابحوالي 1-0،5 ملم، وبقية الإعدادات يتم 10V، 20 عرض ميللي ثانية و 50 ميللي ثانية تأخير.
- تطبيق آخر قطرة من المالحة على رأس الأجنة لتبريده وإزالة فقاعات الهواء.
- ختم البيض مع الشريط واحتضان لمدة ساعة على الأقل 4؛ الحد الأدنى من الوقت اللازم لناقلات التعبير.
4. التثبيت من الأجنة الدجاج
- إزالة الأجنة من بيضها.
- الأجنة نظيفة تحت stereomicroscope وتقييم مدى ترنسفكأيشن مع المجهر ستيريو الفلورسنت.
- إصلاح الأجنة أكثر من ليلة في PFA 4٪ في 4 درجات مئوية. المضي قدما باجتزاء و / أو تلطيخ (الموقع التهجين، المناعية في) لتحليل التغييرات في المنطقة transfected.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مدى منطقة الدماغ المتوسط transfected مع مير مرئيا من خلال التعبير عن GFP من ناقلات مراسل حقن جنبا إلى جنب مع مير معربا عن ناقلات (الشكل 2). باستخدام أقطاب البلاتين التي يبلغ قطرها 0.5 ملم وضعت موازية لمحور AP من الخيوط الدماغ المتوسط عادة إلى ترنسفكأيشن من منطقة واسعة على طول وDV-AP-المحور، بما في ذلك الدماغ المؤخر، الدماغ المتوسط، وأحيانا الدماغ البيني (أرقام 2A وباء). حجم النتائج الأقطاب في الحقل الكهربائي واسعة تطبق على منطقة الدماغ، وبالتا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح هذا الفيديو وسيلة فعالة لبالنقل البلازميد إلى خلايا عصبية ظهارية من مناطق معينة من الدماغ المتوسط الفرخ. يمكن النبضات الكهربائية ذات الجهد المنخفض مستطيلة إدخال الحمض النووي في خلايا الأنبوب العصبي الفرخ في البيضة 6،16. ومع ذلك، غالبا ما يتم عرقلة دقة استهداف الحمض النووي للمجال الكهربائي واسعة، والتي ترتفع من خلال أقطاب كهربائية كبيرة نسبيا (Φ = 0.5 ملم). حاولنا معالجة هذه المشكلة عن طريق استخدام الأقطاب الكهربائية الصغيرة في قطر في أعقاب المبادئ ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
نحن نعترف K. Mikic، الذين ساهموا في المرحلة الأولى من هذا الفيلم وM. نيكولسكو للصورة مير. وأيد جيم هوبر من قبل الزمالة من IZKF من Universtitätsklinikum توبنغن، A. ألوين بريم اناند من قبل البرنامج ثروة من Universtitätsklinikum توبنغن.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الشعيرات الدموية الزجاجية البوروسيليكية | هارتنشتاين | الموديل: 0.9 مم | |
| مجتذب الشعيرات الدموية | الدقيقة WPI ، برلين | الموديل: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | الموديل: TSSIC | |
| مجهر مجسم - فلورة | LEICA | الموديل: MZFLIII | |
| مجهر مجسم | زايس | الموديل: Stemi | |
| الكاميرا والبرمجيات | زايس | الموديل: Axiocam MRc / Axiovision Re. 4.8 |
المراجع
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10(2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
