يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات

9.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50042

⸱

مارس 15, 2013

 ,  , 
1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences , 3Department of Physics, Jilin University

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI 1.

الملخص

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC) لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لحساب عدد جزيئات البروتين التي تنتج في خلية واحدة خلال متتابعة، ويندوز غضون خمس دقائق. يتطلب المجهر مضان مع الإثارة ليزر كثافة قوة كيلوواط 0،5 حتي 1 ~ / سم 2، وهي حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن جزيئات البروتين واحد الفلورية في الخلايا الحية. مراسل الفلورية المستخدمة في هذا الأسلوب يتكون من ثلاثة أجزاء: سلسلة استهداف الغشاء، وهي سريعة النضج، بروتين فلوري الصفراء وتسلسل الاعتراف البروتيني. وتنصهر translationally مراسل لمحطة-N من البروتين من الفائدة. تزرع الخلايا على مرحلة المجهر التحكم في درجة حرارته. كل خمس دقائق، وتصوير جزيئات نيون داخل الخلايا (وشارك في وقت لاحقمن خلال تحليل الصور unted مضان) وبعد ذلك photobleached بحيث يتم عد البروتينات حديثا فقط ترجمت في قياس المقبل.

ويمكن تحليل الصور مضان الناتجة عن هذه الطريقة عن طريق الكشف عن البقع الفلورية في كل صورة، وتكليف لهم لخلايا فردية ومن ثم تعيين الخلايا لالأنساب الخلية. يتم حساب عدد من البروتينات التي تنتج داخل نافذة الوقت في خلية معينة بقسمة كثافة مضان متكاملة من البقع من جزيئات الشدة متوسط ​​الفلورسنت واحدة. استخدمنا هذا الأسلوب لقياس مستويات التعبير في حدود 0-45 الجزيئات في واحدة 5 دقائق الوقت في Windows. تمكين هذه الطريقة لقياس الضوضاء لنا في التعبير عن CI قامع λ، ولها العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى في بيولوجيا الأنظمة.

البروتوكول

1. سلالة الهندسة سير العمل

  1. إدراج تسلسل الترميز (أ) تسلسل غشاء الترجمة، (ب). بروتين سريع النضج والفلورسنت (ج) تسلسل الاعتراف البروتيني N-محطة لوالإطار مع بروتين من الفائدة (على سبيل المثال عامل النسخ) كنا الغشاء استهدفت TSR-2 و فينوس مراسل تنصهر إلى البروتيني تسلسل الاعتراف اليوبيكويتين (UB) لحساب عدد من عاثية أعرب λ قامع جزيئات البروتين CI. تفاصيل عن الكيفية التي شيدت البروتين الانصهار TSR-فينوس-UB-CI، لتحل محل البرية من نوع الترميز CI المنطقة وإدماج بناء في E. ويرد وصف كروموسوم القولونية باستخدام λ الأحمر إعادة التركيب 3، بالتفصيل في المرجع. 1.
  2. التحقق من جميع تعديلات من قبل التسلسل.
  3. تحويل ترميز البلازميد والبروتيني محددة لتسلسل الاعتراف المستخدمة أعلاه الى سلالة التعبير عن بروتين الفلورية ومراسل من الفائدةفي الانصهار متعدية. استخدمنا البروتيني Ubp1، الذي يشق مباشرة بعد محطة بقايا C-اليوبيكويتين 4.

2. خلايا الثقافة وإعداد نموذج

  1. اختيار واحد E. مستعمرة بكتيريا من الاهتمام من لوحة أجار يشوبه طازجة على 1 مل سائل الإعلام M9 الحد الأدنى من 5 تستكمل مع الأحماض الأمينية MEM 1X والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في درجة الحرارة المطلوبة في شاكر طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى OD 600> 1.0 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر).
  2. تمييع الثقافة في 1 مل المتوسطة M9 جديدة مع المضادات الحيوية المناسبة لOD ​​600 = 0.02. احتضان شاكر في في درجة حرارة مناسبة. ويمكن زيادة الكثافة الخلوية الأولية إذا لزم الأمر لدرجات الحرارة المنخفضة النمو.
  3. عندما OD 600 = 0،2-0،3 (عند 37 درجة مئوية مع زراعة الخلايا الأولية في OD 600 = 0.02، هذا سيستغرق ساعة 3-4)، البدء في إعداد جيل الاغاروز وحة (الخطوة 3).
  4. الخلايا على استعداد للتصوير عندما OD 600 = 0،3-0،4.
  5. 1 ثقافة مل نقل المحتضنة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5، الطرد المركزي في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في ميكروسنتريفوج الفوق.
  6. تجاهل طاف وإضافة 1 مل M9 المتوسطة الطازجة و resuspend بيليه بلطف.
  7. الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  8. كرر الخطوة 1.6 و 1.7. تجاهل طاف.
  9. إعادة تعليق بلطف وسائل الاعلام في 1 مل M9. ويمكن استخدام خلايا مباشرة للتصوير المجهر المخفف أو 10 - لأضعاف-100 لضمان الكثافة المنخفضة خلية للتصوير timelapse. نلاحظ أن كثافة منخفضة الخلية مهمة للتصوير timelapse الموسعة. وختم غرفة التصوير (الخطوة 4) أثناء التجربة. بسبب النمو المتسارع للخلايا، ويمكن تركيزات عالية من الخلايا الأولية تستنفد الأكسجين بشكل كبير داخل غرفة بعد نمو متواصل في لوحة هلام، والحد من الفلورسنت النضج البروتين والتي تؤثر في نمو الخلايا.

3. إعداد الحل الاغاروز

  1. وزن 10-20 ميلي غرامذوبان منخفضة درجة الحرارة الاغاروز في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. إضافة مناسبة المتوسطة M9 حجم الحد الأدنى من المضادات الحيوية دون حل لجعل الاغاروز 3٪.
  3. تسخين الحل الاغاروز لمدة 30 دقيقة في 70 درجة مئوية لإذابة، عكس الأنبوب للتأكد من أن الحل هو ذاب تماما ومتجانسة. يمكن سكب هلام لوحة في هذه المرحلة (الخطوة 4) أو يمكن تخفيض درجة الحرارة إلى 50 ° C واحتجز لعدة ساعات لاستخدامها لاحقا.

4. إعداد لوحة جل في الدائرة

  1. حوالي 50 دقيقة قبل التصوير، وشطف شريحة Microaqueduct بالماء.
  2. شطف الزجاج غطاء تنظيفها 1 (باستخدام طريقة التنظيف صارمة مثل التي وصفت في 6) وMicroaqueduct الشريحة مع الماء المعقم والجافة التي تهب مع الهواء المضغوط.
  3. وضع طوقا المطاط على الشريحة Microaqueduct بحيث يغطي مداخل ومنافذ على الجانب كوب من الشريحة Microaqueduct (يمكن تعديل هذه لتقديم الطلبات فيالذي perfused وسائل الإعلام من خلال العينة). تطبيق 50 ميكرولتر حل الاغاروز (الخطوة 3) إلى وسط الشريحة Microaqueduct.
  4. تتصدر حل الاغاروز مع تنظيفها، والزجاج غطاء الجافة.
  5. السماح للحل الاغاروز الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. وفي الوقت نفسه، يعد عينة الخلية (الخطوة 2).
  7. تقشر بعناية والزجاج غطاء من أعلى منصة هلام. إضافة ميكرولتر 1،0 زراعة الخلايا غسلها إلى الأعلى لوحة هلام. انتظر دقيقة 2 ~ للثقافة لتمتصه لوحة هلام. من المهم عدم الانتظار طويلا حتى يتسنى للسادة هلام overdries، ولكن لفترة كافية من الالتزام بشكل صحيح الخلايا إلى لوحة هلام. والوقت المثالي انتظار تختلف مع درجة الحرارة والرطوبة.
  8. أثناء انتظار، تجف آخر الزجاج غطاء precleaned.
  9. تغطية العينة مع غطاء زجاجي جديدة ضمان الانحياز جيدا الزجاج غطاء الشريحة وMicroaqueduct.
  10. تجميع غرفة درجة حرارة النمو تسيطر عليها باتباع إرشادات الشركة المصنعة.ويمكن الآن أن تستخدم للتصوير في المجهر (الخطوة 5).

5. التصوير واقتناء أفلام Timelapse

  1. بدوره على الليزر والمجهر باتباع إرشادات الشركة المصنعة (مثل الليزر قد تحتاج إلى استعد للساعة 0.5 ~ قبل التجربة).
  2. قفل الدائرة تجميعها لإدراج المرحلة على المجهر. تعيين درجة حرارة غرفة النمو وسخان الهدف عند 37 ° C درجة الحرارة أو غيرها من النمو المنشود.
  3. إذا التصوير فوق درجة حرارة الغرفة، سيتم التركيز أو هلام وسادة الانحراف عادة بشكل ملحوظ لدقيقة 15 ~ بعد التحول درجة الحرارة الأولية. في الممارسة العملية، استخدم هذا الوقت للعثور على مناطق المصالح وتعديل النصوص التصوير اللازمة لتجربة.
  4. العثور على خلايا المجهر وتخزين موقف كل خلية بعد ذلك تركز داخل منطقة محددة مسبقا التصوير والانحياز. ولا يمكن تصوير أكثر من خلية واحدة في كل مرة نافذة الصورة الاستحواذ. لtimelapse التصوير أكثر مأي أجيال، وضمان أن يتم فصل الخلايا في البداية المصورة من الخلايا الأخرى بما لا يقل عن بضع مئات من ميكرومتر حتى أن المستعمرات الأخرى لن تدخل المنطقة خلال التصوير النمو.
  5. ضبط كثافة الليزر الإثارة بحيث تقريبا كل photobleach جزيئات الفلورية في غضون 6 التعرض (الشكل 5).
  6. باستخدام برنامج نصي التصوير الآلي / مجلة، الحصول على البيانات باستخدام خوارزمية timelapse هو موضح في سير العمل التجريبي في الشكل 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتظهر نتائج نموذجية من تجربة تتبع CoTrAC إنتاج CI قامع λ في أرقام 4 و 5. في هذه التجربة، تم تصوير 12 المستعمرات على فترات 5 دقائق. في كل نقطة زمنية، وautofocused أولا مستعمرة مركزية والتصوير داخل المنطقة. المقبل، وتركز على موقف تخزين / تركيزا وتم الحصول عليها صورة brightfield. وtranslocated ثم المرحلة من 0.5 ميكرومتر ~ على طول محور Z-الانتقال من الطائرة brightfield التنسيق إلى الطائرة التي تفصل بين شطري الخلايا (دون المرحلة التباين أو الفرق المقاب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن للطريقة CoTrAC يمكن تعميمها لقياس إنتاج بروتينات أخرى حيث N-C-التقليدية أو محطة اندماج بروتين فلوري قد وقف نشاط البروتين. استراتيجية CoTrAC ثلاثة مزايا فريدة على الطرق الحالية. الأولى، وشارك في متعدية الانصهار يضمن أن يتم إنتاج جزيء واحد لمراسل الفلورسنت لكل جزيء من البروتين من الفائدة، مما يسمح عد دقيق لإنتاج البروتين في الوقت الحقيقي. ثانيا، مراسل غشاء استهداف TSR-فينوس تمكين الكشف عن جزيء واحد من الصحفيين الفلورسنت، مما يتيح الكشف عن البروتينات التي أعرب عنها في مستويات من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا أي الإفصاحات.

شكر وتقدير

ويعود الفضل في بلازميد معربا عن pCG001 في Ubp1 بيكر روهان في مدرسة جون كورتين للأبحاث الطبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مارس من الدايمات البحث المنح 1-FY2011 مارس من الدايمات جائزة باسل كاتب أوكونور الباحث بحوث # 5 FY20 وNSF جائزة CAREER 0746796.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
الاغاروز (درجة حرارة انصهار منخفضة) Lonza 50100
ملي-Q H 2 O
5 × أملاح M9 وصفة التالية صفها في 9
20٪ نسبة الجلوكوز
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM حل الأحماض الأمينية إينفيتروجن 11130-051
التحكم في درجة حرارته النموغرفة
المرحلة محول 		Bioptechs FCS-2
الهدف سخان Bioptechs نموذج يعتمد على الهدف المجهر
Microaqueduct الشرائح Bioptechs 130119-5
النظارات غطاء الصغيرة VWR 40CIR-1 قد يكون من الصعب المصدر؛ متاحة أيضا من Bioptechs
تغطية الزجاج / الشريحة طوقا Bioptechs FCS2 0.75 مم
مضان المجهر مختلف الإعداد سبيل المثال: المتماسك إنوفا 308C الأرجون ليزر ايون، أوليمبوس IX-81 المجهر، أوليمبوس PlanApo 100X 1،45 NA الهدف، Metamorph البرمجيات يجب أن يكون الإثارة الليزر، المرحلة الآلي XYZ، برامج التشغيل الآلي قادرة على ضبط تلقائي للصورة والتصوير كتابتها، والبصريات قادرة على resolvinالبروتينات الفلورية واحد ز
كاميرا EM-CCD مختلف الإعداد سبيل المثال: أندور Ixon DU-898 يجب أن يكون انخفاض مستوى الضجيج بما فيه الكفاية للكشف عن البروتينات الفلورية واحد فوق خلفية

المراجع

  1. Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
  2. Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
  3. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
  4. Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).
  6. Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
  7. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
  8. Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
  9. Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طريقة CoTrACمجهر الفلورةإنتاج البروتينالخلايا الحيةتحليل التبييض الضوئيالتصوير بالفاصل الزمنيمستعمرات E. coliالمراسل الفلوري
واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.