مقالة منهجية

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات في الجسم الحي استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

DOI:

10.3791/50042

⸱

مارس 15, 2013

 ,  , 
1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences , 3Department of Physics, Jilin University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI 1.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC) لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لحساب عدد جزيئات البروتين التي تنتج في خلية واحدة خلال متتابعة، ويندوز غضون خمس دقائق. يتطلب المجهر مضان مع الإثارة ليزر كثافة قوة كيلوواط 0،5 حتي 1 ~ / سم 2، وهي حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن جزيئات البروتين واحد الفلورية في الخلايا الحية. مراسل الفلورية المستخدمة في هذا الأسلوب يتكون من ثلاثة أجزاء: سلسلة استهداف الغشاء، وهي سريعة النضج، بروتين فلوري الصفراء وتسلسل الاعتراف البروتيني. وتنصهر translationally مراسل لمحطة-N من البروتين من الفائدة. تزرع الخلايا على مرحلة المجهر التحكم في درجة حرارته. كل خمس دقائق، وتصوير جزيئات نيون داخل الخلايا (وشارك في وقت لاحقمن خلال تحليل الصور unted مضان) وبعد ذلك photobleached بحيث يتم عد البروتينات حديثا فقط ترجمت في قياس المقبل.

ويمكن تحليل الصور مضان الناتجة عن هذه الطريقة عن طريق الكشف عن البقع الفلورية في كل صورة، وتكليف لهم لخلايا فردية ومن ثم تعيين الخلايا لالأنساب الخلية. يتم حساب عدد من البروتينات التي تنتج داخل نافذة الوقت في خلية معينة بقسمة كثافة مضان متكاملة من البقع من جزيئات الشدة متوسط ​​الفلورسنت واحدة. استخدمنا هذا الأسلوب لقياس مستويات التعبير في حدود 0-45 الجزيئات في واحدة 5 دقائق الوقت في Windows. تمكين هذه الطريقة لقياس الضوضاء لنا في التعبير عن CI قامع λ، ولها العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى في بيولوجيا الأنظمة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. سلالة الهندسة سير العمل

  1. إدراج تسلسل الترميز (أ) تسلسل غشاء الترجمة، (ب). بروتين سريع النضج والفلورسنت (ج) تسلسل الاعتراف البروتيني N-محطة لوالإطار مع بروتين من الفائدة (على سبيل المثال عامل النسخ) كنا الغشاء استهدفت TSR-2 و فينوس مراسل تنصهر إلى البروتيني تسلسل الاعتراف اليوبيكويتين (UB) لحساب عدد من عاثية أعرب λ قامع جزيئات البروتين CI. تفاصيل عن الكيفية التي شيدت البروتين الانصهار TSR-فينوس-UB-CI، لتحل محل البرية من نوع الترميز CI المنطقة وإدماج بناء في E. ويرد وصف كروموسوم القولونية باستخدام λ ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر نتائج نموذجية من تجربة تتبع CoTrAC إنتاج CI قامع λ في أرقام 4 و 5. في هذه التجربة، تم تصوير 12 المستعمرات على فترات 5 دقائق. في كل نقطة زمنية، وautofocused أولا مستعمرة مركزية والتصوير داخل المنطقة. المقبل، وتركز على موقف تخزين / تركيزا وتم الحصول عليها صورة brightfield. وtranslocated ثم المرحلة من 0.5 ميكرومتر ~ على طول محور Z-الانتقال من الطائرة brightfield التنسيق إلى الطائرة التي تفصل بين شطري الخلايا (دون المرحلة التباين أو الفرق المقاب.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للطريقة CoTrAC يمكن تعميمها لقياس إنتاج بروتينات أخرى حيث N-C-التقليدية أو محطة اندماج بروتين فلوري قد وقف نشاط البروتين. استراتيجية CoTrAC ثلاثة مزايا فريدة على الطرق الحالية. الأولى، وشارك في متعدية الانصهار يضمن أن يتم إنتاج جزيء واحد لمراسل الفلورسنت لكل جزيء من البروتين من الفائدة، مما يسمح عد دقيق لإنتاج البروتين في الوقت الحقيقي. ثانيا، مراسل غشاء استهداف TSR-فينوس تمكين الكشف عن جزيء واحد من الصحفيين الفلورسنت، مما يتيح الكشف عن البروتينات التي أعرب عنها في مستويات من.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا أي الإفصاحات.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعود الفضل في بلازميد معربا عن pCG001 في Ubp1 بيكر روهان في مدرسة جون كورتين للأبحاث الطبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مارس من الدايمات البحث المنح 1-FY2011 مارس من الدايمات جائزة باسل كاتب أوكونور الباحث بحوث # 5 FY20 وNSF جائزة CAREER 0746796.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
الاغاروز (درجة حرارة انصهار منخفضة) Lonza 50100
ملي-Q H 2 O
5 × أملاح M9 وصفة التالية صفها في 9
20٪ نسبة الجلوكوز
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM حل الأحماض الأمينية إينفيتروجن 11130-051
التحكم في درجة حرارته النموغرفة
المرحلة محول 		Bioptechs FCS-2
الهدف سخان Bioptechs نموذج يعتمد على الهدف المجهر
Microaqueduct الشرائح Bioptechs 130119-5
النظارات غطاء الصغيرة VWR 40CIR-1 قد يكون من الصعب المصدر؛ متاحة أيضا من Bioptechs
تغطية الزجاج / الشريحة طوقا Bioptechs FCS2 0.75 مم
مضان المجهر مختلف الإعداد سبيل المثال: المتماسك إنوفا 308C الأرجون ليزر ايون، أوليمبوس IX-81 المجهر، أوليمبوس PlanApo 100X 1،45 NA الهدف، Metamorph البرمجيات يجب أن يكون الإثارة الليزر، المرحلة الآلي XYZ، برامج التشغيل الآلي قادرة على ضبط تلقائي للصورة والتصوير كتابتها، والبصريات قادرة على resolvinالبروتينات الفلورية واحد ز
كاميرا EM-CCD مختلف الإعداد سبيل المثال: أندور Ixon DU-898 يجب أن يكون انخفاض مستوى الضجيج بما فيه الكفاية للكشف عن البروتينات الفلورية واحد فوق خلفية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
  2. Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CoTrAC E coli

مقالات ذات صلة