ومقايسة المذنب هو وسيلة فعالة للكشف عن الانقطاعات منفردة ومزدوجة حبلا، بما في ذلك قلوي قابل للتغيير المواقع وDNA-DNA/DNA-protein عبر وصلات على الحمض النووي في خلايا جميع بما في ذلك الخلايا العصبية قرن آمون. الأسلوب يستفيد من الهجرة التفاضلية من الحمض النووي في المجال الكهربائي بسبب الاختلافات في كمية الحمض النووي من التلف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وهناك عدد من العقاقير تستهدف مسارات إصلاح الحمض النووي وحمل الخلية قتل عن طريق إنشاء الحمض النووي من التلف. وهكذا، تم العمليات مباشرة لقياس الحمض النووي من التلف تقييم على نطاق واسع. الطرق التقليدية وقتا، طويلا مكلفة، وتتطلب موارد كثيفة الخلايا تكرار. في المقابل، ومقايسة المذنب، هلام خلية واحدة مقايسة الكهربائي، هو أسرع وغير الغازية، وغير مكلفة، مقياسا مباشرا وحساسة من الحمض النووي من التلف والإصلاح. يمكن فيها إعمال جميع أشكال الحمض النووي من التلف وكذلك إصلاح الحمض النووي تصور على مستوى خلية واحدة باستخدام هذه التقنية القوية.
والمبدأ الذي يقوم عليه مقايسة المذنب هو أن أمر غاية في حين DNA الحمض النووي من التلف سليمة يعطل هذه المنظمة. ويتسرب DNA التالفة في مصفوفة الاغاروز وعندما تتعرض لمجال كهربائي، وDNA سالبة الشحنة يهاجر نحو القطب السالب الذي موجبة الشحنة. الكبيرة خيوط DNA غير التالفة ليست قادرة على الهجرة بعيدا عن النواة. DNA الضرريخلق شظايا أصغر DNA التي تسافر أبعد من DNA سليمة. المذنب الفحص، وهو برنامج تحليل الصور والتدابير ويقارن شدة الفلورسنت العام للDNA في نواة مع DNA الذي هاجر من النواة. إشارة الفلورسنت من DNA هاجر يتناسب مع الحمض النووي من التلف. أكثر إشراقا يعد الذيل يدل على زيادة DNA الحمض النووي من التلف. بعض المعلمات التي يتم قياسها هي اللحظة التي الذيل هو مقياس لكل من كمية الحمض النووي DNA وتوزيع في الذيل طول الذيل، والنسبة المئوية للDNA في الذيل. يسمح هذا الفحص لقياس إصلاح الحمض النووي وكذلك منذ قرار من الحمض النووي من التلف يعني إصلاح قد حدثت. الحد من الحساسية هو فواصل حبلا نحو 50 في 1،2 مضاعفا خلايا الثدييات. الخلايا تعامل مع أي وكلاء DNA الضارة، مثل إيتوبوسيد، يمكن استخدام كعنصر تحكم إيجابية. وبالتالي مقايسة المذنب هو إجراء سريع وفعال لقياس الحمض النووي من التلف.
البروتوكول
1. خلية ثقافة
- الخلايا العصبية وثقافة التعامل معهم حسب الحاجة.
- خلايا الحصاد في أنابيب مل 15: وسائل الإعلام الرشفة، وشطف مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، الكالسيوم والمغنيسيوم مجانا)، إضافة التربسين، وجمع في 15 مل أنابيب وتحييد التربسين مع وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل مناسب.
- تدور في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام.
- إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- تدور في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام والخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني جديد.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو لمكافحة صومعتك المفضل.
- وينبغي إعداد عينات الخلايا مباشرة قبل بدء الفحص.
- يجب التعامل مع جميع العينات في ضوء مظلمة أو أصفر لمنع تلف الحمض النووي من الأشعة فوق البنفسجية.
2. المذنب الفحص
1. الشريحة إعداد
- أذب 1٪ الاغاروز (1 جم / 100 مل في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA، TBE) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات.
- تراجع الشرائح في الاغاروز المنصهر والقضاء على الجانب تنظيف مع kimwipe. السماح للالاغاروز إلى الهواء الجاف لفيلم شفافة. ويمكن أن يتم ذلك مسبقا ويمكن تخزين الشرائح.
2. الفحص المذنب محايدة
- البرد حل تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، 100 مم EDTA درجة الحموضة 10، 10 ملي تريس قاعدة، 1٪ لوريل الصوديوم sarcosinate، وتريتون 1٪ X-100، الرقم الهيدروجيني 10) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- 2.2.2. تذوب 1٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز (1 جم / 100ML في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات. والاغاروز يحتاج إلى أن تبرد إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لتجنب تحريض الاصطناعي من ذيل المذنب. من الناحية المثالية، والاغاروز يحتاج إلى أن تبرد لمدة نصف ساعة قبل الاستخدام.
- 2.2.3. يخفف من التعليق الخلية بحيث هناك 100،000 خلية لكل مل. الجمع بين الخلية التي تحتوي على التعليق الاغاروز ذوبان نقطة منخفضة (عند 37 درجة مئوية) فينسبة 01:10 (ت / ت)، لفترة وجيزة الدوامة، وعلى الفور ماصة 50 ميكرولتر على الشريحة المذنب. استخدام جانب من تلميح ماصة لنشر تعليق الخلية بالتساوي فوق منطقة العينة. ينبغي لكل مجموعة العلاج تكون على الاقل في ثلاث نسخ.
- المكان الشرائح المسطحة في الثلاجة لمدة 30 دقيقة حتى تظهر دائرة في محيط الشريحة.
- Prechill الحل تحلل والشرائح يغرق في هذا الحل لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية (أو في الثلاجة).
- صب الخروج أو نضح الحل تحلل وإضافة 1X العازلة الكهربائي محايدة (تريس القاعدة، حمض البوريك، EDTA، 1X TBE). ترك الشرائح في هذا المخزن المؤقت لمدة نصف ساعة في الثلاجة.
- إضافة 1X العازلة prechilled الكهربائي متعادلة (TBE) في غرفة الكهربائي، والشرائح مكان في علبة الشريحة الكهربائي. محاذاة الشرائح بحيث تكون مسافة واحدة من الأقطاب الكهربائية.
- صب 1X العازلة محايدة الكهربائي يصل إلى 0.2 بوصة فوق الشرائح. سوف عازلة الفائض في جملةوحدة البائع مع الكهربائي.
- وضع السلطة امدادات التيار الكهربائي إلى 1 V لكل سم (قياس القطب الكهربائي ل) وتشغيل لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية (أو غرفة باردة) في الظلام.
3. القلوية المذنب الفحص
- البرد حل تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، 100 مم EDTA درجة الحموضة 10، 10 ملي تريس قاعدة، 1٪ لوريل الصوديوم sarcosinate، وتريتون 1٪ X-100، الرقم الهيدروجيني 10) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- تذوب ذوبان منخفضة 1٪ نقطة الاغاروز (1 جم / 100 مل في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات. ثم بارد في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- الجمع بين الخلايا في 1 مل X / 105 مع انخفاض ذوبان المنصهر الاغاروز نقطة (عند 37 درجة مئوية) في نسبة 01:10 (ت / ت)، لفترة وجيزة الدوامة، وعلى الفور ماصة 50 ميكرولتر على الشريحة المذنب. استخدام جانب من تلميح ماصة لنشر تعليق الخلية بالتساوي فوق منطقة العينة. ينبغي لكل مجموعة العلاج تكون على الاقل في ثلاث نسخ.
- تراجع المكانES شقة في الثلاجة لمدة 30 دقيقة حتى تظهر دائرة في محيط الشريحة.
- الشرائح تزج في حل تحلل prechilled وترك ب 4 ل 1 ساعة ليلة وضحاها في الظلام C °.
- إزالة الشرائح من حل تحلل، واستنزاف وشطف الشرائح مرة واحدة مع تحييد العازلة الباردة لمدة 5 دقائق لإزالة الأملاح والمنظفات المتبقية قبل الخطوة قلوي ينحل.
- الشرائح مكان في هلام غرفة مليئة الكهربائي الاحتياطي الكهربائي prechilled الطازجة (300 ملم هيدروكسيد الصوديوم، EDTA 1 ملم، ودرجة الحموضة> 13) لا يتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح. محاذاة الشرائح بحيث تكون مسافة واحدة من الأقطاب الكهربائية.
- اسمحوا الشرائح الجلوس في المخزن المؤقت القلوية لمدة 30 دقيقة في الظلام للسماح للاسترخاء من DNA والتعبير عن قلوي مسؤولا الضرر.
- وضع السلطة امدادات التيار الكهربائي إلى 1 V لكل سم (قياس القطب الكهربائي ل) وتشغيل لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية (أو غرفة باردة).
4. تحديد وستاining خلايا
- استنزاف فائض الاحتياطي الكهربائي
- تزج الشرائح في مرحلة ما قبل المبردة الماء المقطر لمدة 5 دقائق في RT.
- الشرائح تزج في مرحلة ما قبل المبردة الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق في RT.
- عينات الجافة بين عشية وضحاها. لا تعرض الشرائح للضوء الساطع. قد يتم تخزين العينات لمدة شهور في درجة حرارة الغرفة قبل أن يسجل هدفا في هذه المرحلة.
- وصمة عار في الشرائح عن طريق غمر الخضراء Sybr (1X مخففة في PBS) لمدة 20 دقيقة في الثلاجة.
- إزالة الشرائح والسماح لهم حتى يجف تماما في الظلام. سوف تصبح شفافة عندما الاغاروز جافة تماما.
4. الحصول على الصور والتحليل
- الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت لتعيين مرشح الأخضر (زايس AxioVision) وتحليل باستخدام البرمجيات الفحص المذنب (أدوات الادراك).
- انقر على "رأس المذنب" (نواة) والبرنامج يحسب المعلمات بما في ذلك لحظة والذيل متوسط كمية DNA فيالنواة.
- تحليل ما لا يقل عن 200 خلية في العلاج.
- تصدير البيانات إلى Microsoft Excel.
- يعني حساب حظة الذيل لكل مجموعة العلاج والبيانات مؤامرة حسب الاقتضاء.
5. ممثل النتائج
ويرد مثال على تحليل مقايسة المذنب على الخلايا العصبية في الشكل 2 والشكل 3. في هذه الحالة، تشعيع الخلايا العصبية يدفع الحمض النووي من التلف. كما تتعرض الخلايا إلى مجال كهربائي، ويهاجر DNA بمعدلات مختلفة بسبب الاختلافات في حجم والتي يتم تحليل في وقت لاحق باستخدام برنامج الفحص المذنب. كلما الحمض النووي من التلف، وأبعد من DNA يهاجر من النواة. هذا يقلل من شدة الفلورسنت في النواة التي يتم انتقاؤها في وقت لاحق من قبل البرنامج والنتائج في لحظة أعلى الذيل. الجدول 1 الجدول يصور ممثل من التحليل والفحص المذنب الشكل 4 يظهر تمثيلاالرسم البياني tative مقارنة الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية بعد الإشعاع التي تقاس على أساس مقايسة المذنب.
الشكل 1. الرسم البياني تدفق مقايسة المذنب. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. الصور الممثل من الخلايا العصبية (A) دون و(B) مع ذيل المذنب.
الرقم مقايسة المذنب 3. التحليل باستخدام برنامج الفحص المذنب. (A) المكتسبة لقطات الشاشة ممثل الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت كارل زايس وتحليلها باستخدام المذنبفحص البرمجيات. (B) النقر على نواة أو "رئيس المذنب" (دائري باللون الأخضر) يولد خريطة الفلورسنت والرسم البياني (دائري باللون الأصفر) وجدول البيانات (C) (دائري باللون الأحمر). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. الرسم البياني الممثل حصلت عليها بالتآمر لحظة الذيل يعني الحصول على الحمض النووي من التلف عن طريق تحليل الخلايا العصبية في المشع وغير المشع التي تستخدم محايدة مقايسة المذنب. كما هو متوقع، والإشعاع 3Gy (الأشعة السينية) يدفع الحمض النووي من التلف كما هو مبين من قبل لحظة متوسط ارتفاع الذيل في خلايا العصبية المشع. أظهرت هي اللحظة ذيل يعني (+ / - خطأ قياسي)، ** P <0.01.
الجدول 1. الجدول الممثل حصلت عليها تحليل مقايسة المذنب على الخلايا العصبية وغير المشع المشع. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ومقايسة المذنب لديه قدرة فريدة على تحليل الخلايا الفردية. هذا هو مفيد في تحديد المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا التي توضح الفرق استجابة للعوامل السامة للخلايا. عدد قليل من القيود العملية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. قد يكون عدد الخلايا التي يمكن تقييمها بشكل فردي تختلف تبعا للفرد. حجم العينة يحتاج إلى زيادة إذا كان هناك تباين في الحمض النووي من التلف ضمن السكان. قابلة للحياة وحيدة الخلية تعليق أمر حاسم بالنسبة لهذا الاختبار منذ جود الغالبة من الخلايا أفكارك نخرية أو ستضيف للخطأ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة IMPACT من قسم علاج الأورام بالإشعاع، جامعة ألاباما في برمنغهام مركز السرطان الشامل، ومؤسسة الأطفال مكافحة للسرطان، ومؤسسة غابرييل انجيل (لESY).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
| 1.5 مل أنابيب | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، وشركة | SC-200271 | |
| 10X TBE (تريس القاعدة، حمض البوريك، EDTA) | فيشر العلمية | BP13331 | |
| 15 مل أنبوب | فيشر العلمية | 0553851 | |
| الاغاروز | سيجما | A5093 | |
| رقائق الالومنيوم | فيشر العلمية | 01213101 | |
| فنجان | فيشر العلمية | FB102300 | |
| نبذ | الحرارية العلمية | 75004261PR | |
| المذنب الفحص البرمجيات | صورة المذنب IV الفحص تحليل النظم | ||
| أسطوانة | فيشر العلمية | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| غرفة الكهربائي | الحرارية العلمية | 09528101 | |
| الإيثانول | فيشر العلمية | A407P4 | |
| المجهر الفلورسنت | زايس محوري الرؤية | فإن أي المجهر الفلورسنت مع فلتر الخضراء تكفي | |
| عدادة الكريات | فيشر العلمية | 0267152 | |
| انخفاض ذوبان نقطة الاغاروز | Promega | V2111 | |
| ميكروويف | سيرز | ||
| الفوسفات مخزنة المالحة، والكالسيوم الحرة، والمغنيسيوم مجانا | HyClone | SH3025601 | |
| إمدادات الطاقة | BioRad | 1645050 | |
| ثلاجة | سيرز | ||
| حاكم | المواد الغذائية | ||
| انزلق | فيشر العلمية | 12550143 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما | S7653 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما | S5881 | |
| لوريل الصوديوم sarcosinate | فيشر العلمية | S529 | |
| Sybr الخضراء | إينفيتروجن | S7585 | |
| صينية | الجبهة الاسلامية للانقاذلها العلمية | 15242B | |
| تريس قاعدة | سيجما | T6066 | |
| تريتون-X 100 | سيجما | T8787 | |
| التربسين | HyClone | SH3023601 | |
| دوامة | فيشر العلمية | 02216108 | |
| ماء الحمام | فيشر العلمية | 154622Q |
المراجع
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
