ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد اكتسب نضح على أساس decellularization الجهاز كله مؤخرا الاهتمام في مجال هندسة الأنسجة كوسيلة لخلق مواقع محددة السقالات المصفوفة خارج الخلية، إلى حد كبير مع الحفاظ على بنية الأصلية هي السقالة. حتى الآن، وقد استخدمت هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم، بما في ذلك القلب والرئة والكبد و1-5. وقد اعتمدت أساليب decellularization السابقة لأنسجة الأوعية الدموية وشبكة دون الوصول إليها بسهولة عند التعرض لفترات طويلة من النسيج إلى حلول من المنظفات، والأحماض، أو العلاجات الأنزيمية كوسيلة لإزالة المكونات الخلوية والنووية من البيئة المحيطة خارج الخلية 6-8. ومع ذلك، فإن فعالية هذه الأساليب يتوقف على قدرة الحلول لتتخلل نسيج عبر نشرها. في المقابل، نضح من الأجهزة من خلال النظام الأوعية الدموية الطبيعية على نحو فعال خفض المسافة نشرها وتيسير النقل من decellularizatiعلى وكلاء في الأنسجة والمكونات الخلوية من الأنسجة. هنا، نحن تصف طريقة لdecellularize تماما قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء التاجية. أسفرت عن بروتوكول القلب خارج الخلية decellularized تماما مصفوفة (C-ECM) سقالة مع هيكل ثلاثي الأبعاد للقلب سليمة. استخدام أسلوب لدينا سلسلة من الإنزيمات، والمنظفات، والأحماض بالإضافة إلى يشطف مفرط التوتر وناقص التوتر للمساعدة في تحلل وإزالة الخلايا. استخدام بروتوكول حل لفصل الخلايا التربسين من المصفوفة تليها حلول تريتون X-100 deoxycholate والصوديوم للمساعدة في إزالة المواد الخلوية. بروتوكول يستخدم أيضا وصف سرعات نضح من أكبر من 2 لتر / دقيقة لفترات طويلة من الزمن. ضمان معدل تدفق عالية، إلى جانب التغييرات حل يسمح النقل من وكلاء للأنسجة دون التسبب في تلوث الحطام الخلوية وفعالة الشطف من الأنسجة. الطريقة الموضحة إزالة جميع المواد النووية من ناتيهاء الأنسجة القلبية الخنازير، وخلق مواقع محددة القلب ECM سقالة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
البروتوكول
1. إعداد الأنسجة وتجربة الإعداد
- حصاد الخنازير الجهاز مباشرة بعد القتل الرحيم من منشأة مسلخ أو البحث وشطف الدم الزائد. تقليم قلب من الدهون الزائدة والأنسجة، والحفاظ على الشريان الأورطي والأذين سليمة. تقليم بعيدا الدهون لفصل الشريان الرئوي من الشريان الأورطي. إذا كان هناك أي تخفيضات في الأنسجة، وتجاهل بشكل مناسب.
- التفاف كل قلب على حدة في ورقة المجمد وتخزين جميع الأنسجة في الفريزر -80 ° C لمدة لا تقل عن 24 ساعة لضمان التجميد الكامل.
- عندما جاهزة للاستخدام (عادة أقل من 3 أشهر)، ذوبان الجليد سليمة 1 قلب الخنزير المجمدة في الماء 1 نوع المغمورة بين عشية وضحاها في كوب L 4 في C. ° 4
- بعد إذابة قلب تماما، بات قلب الجافة، تزن القلب، وتسجيل الوزن. وينبغي قلب السوق خنزير تزن حوالي 375-450 الوزن ز.
- الاتصال أنابيب حجم Masterflex 18 إلى النهاية "ل¼ المخفض الشائكة. أدخل المخفض الشائكة وأنابيب داخل الشريان الأورطي. المشابك خرطوم 2 أو مكان الرمز البريدي العلاقات آمنة حول الأبهر، أسفل الجذع العضدي الرأسي. والمخفض وأنابيب يجب أن تبقى فوق الصمام الأبهري، وبالتالي يمكن perfused الشرايين التاجية (الشكل 1).
- استخدام حقنة مل 30 أو 60 لملء الأنابيب بالماء I نوع. إدراج أنابيب داخل خرطوشة من مضخة الأسطوانة Masterflex في منتصفه تقريبية. يغرق نهاية تدفق للأنابيب في قاع كوب مملوء L 4 2.5 لتر من الماء وتأمين أنابيب.
- وضع القلب في كوب مملوء بالماء، ورئيس المضخة لإزالة فقاعات الهواء. إذا لاحظت فقاعات قادمة من الشريان الأورطي حيث يتم إدراج أنابيب، قد تحتاج إلى الشريان الأورطي أو أعادت العلاقات مع تأمين إضافية. ختم محكم المهم للحفاظ على الضغط الكافي أثناء عملية decellularization (الشكل 2).
- ضع الكأس التي تحتوي على L 4 3 L لنان 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪3 الحل على اثارة وحة والحارة إلى 37 درجة مئوية في إعداد عملية decellularization.
2. يشطف النسيج
- تعيين مضخة لمعدل التدفق من 400 مل / دقيقة، وضمان أن يتم تحديد حجم أنابيب الصحيح. مسح القلب مع النوع الأول 15-25 دقيقة للمياه. كما بدأت المضخة، يجب قلب تنتفخ ومنفرش الدم من البطينين. ينبغي الاستعاضة حل الطازج كل 5-10 دقيقة، أو حسب الحاجة على أساس كمية من الدم من القلب إزالة. إذا لم يتم effused الدم من القلب، وضبط أنابيب والمشابك حسب الضرورة.
- التخزين المؤقت وقف ضخ ونقل القلب إلى دورق منفصل مليئة المالحة الفوسفات 2X (PBS). بعد الأنبوب المغمور في الحل، وبدء ضخ زيادة معدل تدفق إلى 700 مل / دقيقة. يجب أن تبقى في قلب حل لمدة 15 دقيقة، وتغيير كل 5 دقائق الحل. كل تغيير يتطلب حل المضخة إلى أن يتوقف مؤقتا بينما يتم نقل الأنسجة وأنابيبإلى دورق جديدة.
- نقل القلب إلى النوع الأول الماء لمدة 10 دقيقة وزيادة معدل تدفق إلى 750 مل / دقيقة.
3. Decellularization والحل الإرواء
- نقل القلب إلى دورق يحتوي على 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في 37 ° C. زيادة سرعة مضخة إلى 1،200 مل / دقيقة وتبدأ المضخة. استخدام قضيب تحريك وضعت في أسفل الكأس تعميم الحل في الدورق. يجب أن تبقى في القلب 0.2٪ حل EDTA/0.05٪ 3٪ Trypsin/0.05 نان في C ° 37 ليصبح المجموع ثلاث ساعات. بعد 1 ساعة، زيادة سرعة مضخة إلى 1،500 مل / دقيقة. بعد ساعة إضافية، زيادة سرعة مضخة إلى 1،800 مل / دقيقة. تتعرض الأنسجة ببطء لزيادة سرعات نضح إلى حالة الأنسجة ومنع تمزق الأوعية. سوف تنتفخ وقلب مزدوج تقريبا في حجم أثناء هذه الخطوة من البروتوكول. سوف النسيج يفقد لونه الطبيعي، تتقدم من الأذينين إلى قمة أنحاء اله بروتوكول (الشكل 3).
- بعد كل نضح الحل، يتم تنفيذ الخطوة الثانية شطف لإزالة الأنقاض الخلوية، والمخلفات الكيميائية، والمساعدات تحلل الخلايا. كل شطف يتكون من 10 دقيقة في شطف المياه من النوع الأول تليها 10 دقيقة شطف بمحلول PBS 2X في درجة حرارة الغرفة. كل غسل يتكون من إزالة الحل من الكأس الأصلية، مضيفا شطف الحلول، وتعميم سائل الإرواء في دورق يحتوي على القلب المغمورة. بعد حل 0.2٪ Trypsin/0.05٪ 3٪ EDTA/0.05 نان، يروي المياه في 1900 مل / دقيقة ثم يروي 2X PBS في 1950 مل / دقيقة.
- نقل القلب إلى حل من 3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،000 مل / دقيقة وحل يروي لمدة ساعة. إزالة الحل من الدورق واستبدالها مع حل جديد، زيادة سرعة مضخة إلى 2100 مل / دقيقة، ويروي الحل الطازجة لمدة ساعة ونصف إضافية، ليصل إجمالي الوقت في3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 حتي 2،5 ساعة.
- شطف الأنسجة في الماء I نوع في 2150 دقيقة / مل وPBS 2X في 2180 مل / دقيقة لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- نقل القلب إلى حل الصوديوم Deoxycholate 4٪ في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،200 مل / دقيقة وحل يروي لمدة 3 ساعة.
- شطف الأنسجة في الماء I نوع و2X في PBS في 2200 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد تغيير الحلول 5-10 دقيقة في كل حل. ويمكن تقسيم الخطوات الموضحة نضح خلال الأيام متعددة قبل تنفيذ الخطوة شطف مرتين وتخزين أنابيب المرفقة مع القلب بين عشية وضحاها في 4 و C ° المغمورة في المياه I نوع.
- في اليوم التالي، تنفيذ حد أدنى 5 شطف بالماء I نوع في 750 مل / دقيقة، تليها 5 دقائق شطف PBS 1X في 1500 في مل / دقيقة. ثم قد البروتوكول أن تستمر في معدل التدفق الوارد وصفها في الحل المناسب.
4. التطهير والمعالجة النهائية
- نقل قلب لperac 0.1٪ETIC حمض / 4٪ محلول الإيثانول وحل يروي ل 1.5 ساعة في 2200 مل / دقيقة.
- يتم تنفيذ جميع يشطف النهائية للنسيج في 2200 مل / دقيقة. يروي النسيج مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل من قبل اثنين من 5 دقائق في الماء I نوع. ويتكرر هذا المسلسل من يشطف مرة أخرى من أجل استكمال إجراءات نضح الحل.
- تحويل قبالة مضخة وإزالة القلب من حل لتصريف القلب. قطع العلاقات من الشريان الأورطي، وإزالة جميع الأنابيب، ووضع القلب في كوب فارغ لاستنزاف لمدة 1 ساعة. سوف السائل الزائد يجب أن يتم بشكل دوري ينضب. وضع وسادة القلب على ماصة لاستنزاف تماما القلب (الشكل 4).
- بعد إزالة معظم الماء، سجل وزن المصفوفة خارج الخلية القلب (C-ECM). ويمكن توقع أن يخسر قلب حوالي 20-25٪ من وزنه الأولي خلال عملية decellularization.
- تشريح البطينين الأيمن والأيسر، وكذلك الحاجز البطيني للquantificati DNAعلى تجهيز والنسيجية من أجل تأكيد decellularization كاملة من النسيج (الشكل 5).
- تجميد C-C ° ECM في -80 على الأقل 2 ساعة قبل تجفيد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تأثير على قلوب الخنازير decellularization كله يختلف بطبيعة الحال بسبب الاختلافات في حجم والضغوط وترتيب السفينة. ولذلك، فإن تكوين الدقيق للالسقالات المصفوفة خارج الخلية المستمدة لن تكون هي نفسها من القلب الى القلب. والانتهاء من البروتوكول وصف تسفر عن القلب الذي يظهر بيضاء أو شفافة، مما يدل على فقدان المواد الخلوية. ومع ذلك، يتم قبول على نطاق واسع التي يمكن أن تعتبر نسيج "decellularized" على أساس مزيج من معلمات قليلة الكمية أكثر 8. وهناك بروتوكول decellularizati...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وحددت الدراسة الحالية منهجية متسقة وفعالة decellularization من قلب الخنزير. كان بروتوكول تعديل لتقرير نشر سابقا 1، وشملت يعد التعرض لتدفق وزيادة الضغط، التي وفرت المزيد من النتائج للتكرار. التقى الأنسجة الناتجة decellularized كافة المعايير المنشورة لdecellularization ناجحة من الأنسجة 2. وأجريت تغييرات متكررة الحل للحد من انبعاث المواد الخلوية للأنسجة، وتقليل مدة التعرض لكل عامل decellularization للحد من الآثار السلبية على ECM. خلال المراحل الأولى من البروتوكو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وكان الدكتور جيلبرت على المجلس الاستشاري العلمي في ACell، وشركة في حين يجري القيام به الدراسة، وأصبح مؤخرا نائب الرئيس للبحوث والتنمية. ACell، وشركة تبيع البولية مصفوفة المثانة وليس لديه مصلحة تجارية في هذه الدراسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه بروغان ضيف، ويفر ميشيل، وكريستين ليبرت. تم توفير التمويل لهذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R03EB009237، فضلا عن منح التدريب NIH-06 T32EB001026 من المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية وT32HL076124 05-.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف / المواد | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| التربسين | Gibco | 15090 | |
| EDTA | الصياد | BP120-500 | |
| نان 3 | سيجما | S2002-500G | |
| تريتون X-100 | سيجما | X100-1L | |
| 10X PBS | الصياد | BP399-20 | |
| الصوديوم Deoxycholate | سيجما | D6750-500G | |
| البيروكسي حمض | Pfaltz وباور | P05020 | 35٪ CAS 79-21-0 # |
| الإيثانول | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex مضخة القيادة | كول Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex الأنابيب | كول Parmer | 96400-18 | حجم 18 |
| الشائكة المخفض | كول Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L بيكر | فيشر العلمية | 02-540T |
المراجع
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
