مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

ملخص

نحن تصف طريقة قوية لونين مناعي باستخدام خلايا T الأولية. تأسست هذه الطريقة على النهج القياسية، ولكن يستخدم مجموعة محددة من الظروف والكواشف التي تعمل على تحسين كفاءة لكميات محدودة من الخلايا. الأهم من ذلك، يتم تقديم وصفا مفصلا لمرحلة تحليل البيانات.

الملخص

لونين مناعي (رقاقة) هو وسيلة على نطاق واسع المستخدمة لتحديد تفاعلات البروتينات المختلفة مع الحمض النووي في لونين من الخلايا الحية. ومن الأمثلة على ذلك تسلسل محدد الحمض النووي ملزم النسخ العوامل، histones ودولهم تعديل مختلفة، والإنزيمات مثل بلمرة RNA والعوامل المساعدة، ومكونات إصلاح الحمض النووي. على الرغم من الوجود المطلق لها، هناك نقص يصل إلى التاريخ، منهجيات تفصيلية لكلا إعداد مقاعد البدلاء من المواد وتحليل دقيق يسمح المقاييس الكمية للتفاعل. ونظرا لهذا النقص في المعلومات، وأيضا لأنه، مثل أي مناعي، وظروف يجب إعادة الأمثل لمجموعات جديدة من الظروف التجريبية، ومقايسة الشذرة هو عرضة للنتائج غير دقيقة أو الكمي على نحو رديء.

مشتق بروتوكول لدينا في نهاية المطاف من العمل المنوي على عامل النسخ: التفاعلات الحمض النووي ^1،2، ولكن يشتمل على عدد من التحسينات لsensitivity واستنساخ للحصول يصعب أنواع الخلايا. وقد تم استخدام بروتوكول بنجاح ^3،4، على حد سواء باستخدام QPCR لقياس تخصيب الحمض النووي، أو باستخدام متغير شبه الكمي للبروتوكول أدناه.

يتم عمل هذا التحليل الكمي للمواد PCR-تضخيم حسابيا، ويمثل عاملا مقيدا في مقايسة. وتشمل الضوابط المهمة وغيرها من الاعتبارات استخدام الأجسام المضادة نمط إسوي المطابقة، وكذلك تقييم لمنطقة سيطرة الحمض النووي الجيني، مثل المنطقة بين الجينات وتوقع ألا تكون ملزمة للبروتين قيد الدراسة (أو المتوقع لا لإظهار التغييرات تحت الظروف التجريبية). وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام منحنى القياسية للمواد المدخلات لكل عينة الشذرة لاستخلاص المستويات المطلقة للتخصيب في المواد التجريبية. استخدام منحنيات معيار يساعد على مراعاة الاختلافات بين مجموعات التمهيدي، بغض النظر عن كيفية بعناية أنها مصممة، وأيضا كفاءة تختلفences في جميع أنحاء مجموعة من تركيزات قالب لمجموعة التمهيدي واحد. بروتوكول لدينا يختلف عن غيرها من الجهات التي تتوفر ^5-8 في أننا تغطية على نطاق واسع في مرحلة لاحقة، وتحليل.

البروتوكول

1. العزلة من الفأر CD4 السذاجة الطحال خلايا T

1. تضحية الماوس بطريقة إنسانية متسقة مع رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية (IACUC) بروتوكولات الاستخدام. تشريح الطحال ووضعه في طبق بتري تحتوي على 10 مل من DMEM مع FBS 10٪.
2. سحق الطحال باستخدام إنتهاء متجمد اثنين من الشرائح الزجاجية للافراج عن splenocytes. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية.
3. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة لجهاز للطرد المركزي السريرية مع قطر ال....

النتائج

ومناعي لونين (رقاقة) بروتوكول المعروضة هنا ضوابط لالاختلافات، إن وجدت، في كمية من الحمض النووي المستخدمة في PCR من خلال استخدام زوج التمهيدي أن يضخم منطقة غير منضم من الجينوم، وبالتالي بمثابة "مراقبة التحميل". في المثال هو موضح في الشكل (3)، وقد استخدمنا المنطقة الترميز من الفأرة Actb الجينات باعتبارها غير منضم المنطقة إلى البروتين لدينا من الفائدة وعامل موقع NFAT النسخ ملزم على الماوس IL2 المروج والمنطقة المستهدفة. بدلا من ذلك، المنطقة.......

المناقشة

وينص البروتوكول أعلاه وسيلة قوية من قياس بدقة تخصيب DNA من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام رقاقة. وأحد الأسباب الرئيسية لمتانة في هذا البروتوكول هو إدراج البيولوجية مكررات. يستخدم بروتوكول أعلاه ثلاث مكررات، إثراء للوالذي يحسب بشكل مستقل. ثم يتم حساب متوسط ​​مخرجات لتوفير درجة من تخصيب اليورانيوم والانحرافات المعيارية محسوبة لتوفير قدر من التباين. لكل عينة، ثلاثة التقنية مكررات تجرى أيضا للقضاء على التباين في التعامل مع العينة، PCR التضخيم، وما إلى ذلك كمية من التباين في.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فورمالديهايد	سيجما	F-8775	مخزن في RT
فوسفات	محلول ملحي Hyclone	SH30256.01	مخزن في 4 درجات ؛
أقراص مثبطات الإنزياز البروتيني	C Roche	04693116001	تخزينها عند 4 درجات ؛ C
بروتين G الخرز المغناطيسي	الزخارف النشطة	101945	تخزينها في 4 درجات ؛ C
RNase A (20 مجم / مل) EMD	Millipore	556746	يحفظ عند -20 درجة ؛ C
Proteinase K (20 مجم / مل)	روش	03115879001	يذوب في 50 ملي Tris-HCl ، 10 ملي CaCl 2< / sub> ، درجة الحموضة 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	يحفظ عند -20 درجة ؛ C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store عند -20 درجة ؛ يخزن C
1 M Glycine			في
Cell Solution Buffer (أنابيب 5 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 85 ملي كلوريد القدمين ؛ 0.5٪ NP-40)			يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ C
مخزن مؤقت للتحلل النووي (50 ملي تريس ، درجة الحموضة 8.1 ؛ 10 ملي مولار EDTA ؛ 1٪ SDS) يخزن			في المخزن
المؤقت للتخفيف RT ChIP (0.01٪ SDS ؛ 1.1٪ Triton X-100 ؛ 1.2 ملي EDTA ؛ 16.7 ملي تريس درجة الحموضة 8.1 ؛ 190 ملي كلوريد الصوديوم) يحفظ			عند 4 درجات ؛ ج
مؤقت منخفض الملح (0.1٪ SDS ؛ 1٪ Triton X-100 ؛ 2 ملي EDTA ؛ 20 ملي تروس درجة الحموضة 8.1 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم) يحفظ			عند 4 درجات ؛ ج
مخزن غسيل عالي الملح (0.1٪ SDS ؛ 1٪ Triton X-100 ؛ 2 ملي EDTA ؛ 20 ملي ملي ثلاثية الرقم الهيدروجيني 8.1 ؛ 600 ملي كلوريد الصوديوم) يحفظ			عند 4 درجات ؛
C LiCl المخزن المؤقت للغسيل (0.25 M LiCl ؛ 1٪ NP-40 ؛ 1٪ Deoxycholate الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ؛ 10 ملي مولار Tris pH 8.0) يحفظ			عند 4 درجات ؛ مخزن مؤقت
C TE (10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 1 ملي EDTA)			يحفظ عند 4 درجات ؛
C المخزن المؤقت للشطف (1٪ SDS ؛ 0.1 M NaHCO3< / sub>)			قم بإعداد
كلوريد			في RT
0.5 M متجر EDTA			في RT
1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 6.5			يخزن في RT
<قوي>جدول الكواشف المحددة< / قوي>
كلاي آدامز العلامة التجارية Nutator	Becton Dickinson	الموديل: 421105
حامل مغناطيسي	Promega	Z5342
Qiaquick PCR طقم تنقية	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	الموديل: S3000
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية	NanoDrop Technologies	ND-1000
كتلة التسخين	VWR	13259-030
الدوار	VWR	80085-692
جهاز طرد مركزي مبرد أعلى مقاعد	البدلاء بيكمان كولتر	نموذج: Allegra X-12R
أجهزة الطرد المركزي	الدقيقة Eppendorf	5415 D
<قوي>جدول المعدات < / قوي>

مخزن RT مخزن مخزن الصوديوم الطازج 5 M