تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

Summary

نحن هنا وصف طريقة لتصور الشبكة الهيولية الباطنة المرتبطة mRNAs والثدييات في خلايا الأنسجة. هذا الأسلوب الذي ينطوي على permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما مع ديجيتونين لإزالة محتويات حشوية تليها الفلورسنت في الموقع التهجين لكشف الجزء الأكبر إما بولي (A) مرنا أو المحاضر محددة.

Abstract

في حقيقيات النوى، أكثر من الرنا المرسال (mRNAs و) التي تكود يفرز ويتم ترجمة البروتينات الغشاء على سطح الشبكة الإندوبلازمية (ER). ومع ذلك، يمكن تصور هذه mRNAs وأن يكون تحديا. هذا صحيح خصوصا عندما فقط جزء صغير من مرنا هو ER-المرتبطة بها ويتم توزيعها على عرقلة هذا عضية من النصوص (أي "الحرة") غير المستهدفة. من أجل رصد ER المرتبطة mRNAs و، وقد وضعنا طريقة التي تعامل بها مع خلايا التعرض قصيرة إلى حل استخراج ديجيتونين أن permeabilizes انتقائي غشاء البلازما، وبالتالي يزيل محتويات حشوية، مع الحفاظ في نفس الوقت على سلامة ER . عندما يقترن هذا الأسلوب مع الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH)، يمكن للمرء تصور واضح محدد mRNAs وER بواسطة المجهر الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول يتم تقييم درجة ER-جمعية إما معظم النصوص (A) أو بولي mRNAs محددةوكميا حتى. في هذه العملية، يمكن للمرء أن استخدام هذا الفحص للتحقيق في طبيعة التفاعلات مرنا-ER.

Introduction

في حقيقيات النوى، ويفرز ترميز مرنا يمكن استهداف البروتينات الغشاء إلى ER شارك في translationally من الجسيمات ^1،2 إشارة الاعتراف ويمكن الحفاظ على ER عن طريق التفاعل المباشر بين ريبوسوم وtranslocons خلال ترجمة ^3،4. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن توجيه mRNAs والمحافظة على ومستقلة ER إما ريبوسوم أو ترجمة غير واضح حتى وقت قريب جدا. حاولت الدراسات السابقة لمعالجة ما إذا كان هناك ارتباط ترجمة المستقلة مرنا مع ER باستخدام تقنيات تجزئة الخلوية. لأن هناك حاجة إلى ظروف قاسية الكيميائية لتنأى ريبوسوم من الحويصلات المشتقة ER، والتي قد تعطل الحساس يحتمل مرنا-ER تكوين الجمعيات، وكانت هذه الدراسات غير حاسمة، وتوفير الأدلة ^....

Protocol

1. إعداد مواد لاستخراج

1. إعداد خلايا
   1. خلايا البذور زراعة الأنسجة على حمض المعالجة coverslips مدة لا تقل عن يوم واحد قبل التجربة. نستخدم COS-7 أو U2OS، حيث أن هذه الخطوط تظهر اثنين من خلية إنتاج قوية من البروتين يفرز ولها ER محددة جيدا. نلاحظ أن لتحقيق كفاءة عالية الاستخراج، الخلايا يجب أن لا تتجاوز 80٪ confluency على ساترة في يوم التجربة.
   2. إذا كان يتم التحقيق في مرنا خاصة الخارجية، وتقاس الخلايا بعد يوم وا....

Results

لتحديد النسبة المئوية للمرنا وهذا هو ER-المرتبطة بها، COS-7 الخلايا التي تم transfected مع البلازميدات التي تحتوي على الفوسفاتيز القلوية المشيمة (ALPP) أو السيتوكروم P450-8B1 (CYP8B1) تم استخراج إما مع ديجيتونين ثم ثابتة، أو ثابتة مباشرة (انظر الشكل 1، قارن "Unextracted السيطرة" على "انتزعت السيطرة"). وكميا مضان غير النووية في كل من عينات وحساب جزء من ER المرتبطة مرنا (الشكل 2). البيانات المتوفرة لدينا تبين بوضوح أن لكلا ALPP.......

Discussion

توطين التحت خلوية mRNAs وإلى مواقع مختلفة، من خلال التفاعل مع النصوص البروتينات توطين مرنا، هو ظاهرة واسعة الانتشار مهمة لفرز الصحيح من البروتينات إلى وجهتها النهائية، وبالنسبة للضبط التعبير الجيني لمتطلبات محلية من التحت خلوية المنطقة ^19،20.

باستخدام مقايسة الموصوفة هنا، فإننا النظر في مسألة ما إذا كان يمكن الحفاظ على mRNAs والتي تكود بروتينات إفرازية على ER في وجود أو عدم وجود ريبوسوم أو الترجمة. في .......