مقالة منهجية

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

DOI:

10.3791/50072

⸱

فبراير 7, 2013

 ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف لفحص النمو المكورات العنقودية الذهبية باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد المغذيات المتاحة. هذا الاختبار يحدد دور العوامل البكتيرية المشاركة في الهيموغلوبين المستمدة من اكتساب الحديد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. المذهبة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي تتطلب الحديد لتنفيذ وظائف الأيض الحيوية وتسبب المرض. الخزان الأكثر وفرة من الحديد داخل الإنسان هو المضيف الهيم، والذي هو العامل المساعد من الهيموغلوبين. للحصول على الحديد من الهيموجلوبين، S. المكورات يستخدم نظام محكم المعروفة باسم المحدد سطح الحديد التنظيم (ISD) نظام 1. مكونات أول نظام ISD ربط الهيموغلوبين المضيف، ثم استخراج واستيراد الهيم، وأخيرا تحرير الحديد من الهيم في السيتوبلازم البكتيري 2،3. وقد تم تشريح هذا المسار من خلال العديد من الدراسات في المختبر 4-9. علاوة على ذلك، كانت مساهمة نظام ISD للإصابة أظهرت مرارا وتكرارا في نماذج الماوس 8،10-14. إنشاء مساهمة منظومة ISD إلى الهيموغلوبين المستمدة من اقتناء الحديد والنمو وقد ثبت أن تكون أكثر تحديا. معقدة المقايسات النمو باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد الحديد بY عدم استقرار الهيموجلوبين المتاحة تجاريا، وتلوث الحديد حرة في المتوسط ​​النمو، وسمية المرتبطة chelators الحديد. هنا نقدم طريقة التي يتغلب هذه القيود. مستعدة عالية الجودة من الهيموغلوبين في الدم الطازجة ويتم تخزينها في النيتروجين السائل. وتستكمل الهيموغلوبين في تنقية الحديد تستنفد المتوسطة محاكاة البيئة الحديد للفقراء التي تواجهها مسببات الأمراض داخل المضيف الفقاريات. عن طريق تجويع S. المكورات من الحديد حرة والمكمل مع نموذج التلاعب الحد الأدنى من الهيموغلوبين نحن لحث على النمو بطريقة تعتمد اعتمادا كليا على القدرة على ربط الهيموغلوبين، واستخراج الهيم، من خلال تمرير الهيم المغلف الخلية البكتيرية وتتحلل الهيم في السيتوبلازم. وسوف يكون هذا الاختبار مفيدا للباحثين تسعى إلى إلقاء الضوء على آليات اكتساب الحديد في hemoglobin-/heme-derived S. المكورات وربما غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية الهيموجلوبين من الدم الطازج

  1. الحصول على الدم البشري الطازج تستكمل مع مضاد للتخثر. إبقاء الدم على الجليد أو عند 4 ° C خلال تنقية.
  2. أجهزة الطرد المركزي في الدم لمدة 20 دقيقة في ز X 1،500. وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) تكون في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه بلطف في الجليد الباردة محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ (W / V). تكرار الطرد المركزي ويغسل 3 مرات.
  3. إعادة تعليق بيليه في 1 حجم الجليد الباردة ملي تريس، ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدينا تنقية الهيموجلوبين الإنسان من حلالة دموية مع HPLC (البروتوكول خطوة 1.7). ويظهر الشكل 1 سجلت الامتصاصية من شطافة في موجات نانومتر 280 و 410. كان جزء 5 جمعها والتخلص منها وكسور أخرى. عادة يتم الحصول على غلة 5-15 ملليغرام من الهيموغلوبين في الملليمتر الواحد من شطافة. تم تحليل الهيموجلوبين تنقيته بواسطة SDS-PAGE في مكررة كانت ملطخة وإما لبروتينات المواد الهلامية أو نقلها إلى النيتروسليلوز وimmunoblotted (البروتوكول خطوة 1.10، الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحديد من المغذيات الأساسية اللازمة للكائنات من جميع ممالك الحياة 15. في الفقاريات، وعزلها الحديد لتجنب السمية الناجمة عن هذا العنصر. هذا تنحية يخفي أيضا من غزو الميكروبات الحديد في عملية تعرف باسم الحصانة الغذائية 16. وردا على ذلك تطورت مسببات الأمراض الاستراتيجيات التي تحايل على الحصانة الغذائية. إحدى هذه الآليات تعتمد على الهيموجلوبين، والذي هو المصدر الأكثر وفرة من الحديد داخل المضيف 17. ويرد الهيموجلوبين داخل خلايا الدم الحمراء. لا بد من الافر.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث من قبل الولايات المتحدة المنح العامة للخدمات الصحية وAI69233 AI073843 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. EPS هو زميل ويلكوم بوروز في التسبب في الأمراض المعدية. وقد تم تمويل KPH من قبل الأحياء الدقيقة الجزيئية الخلوية والتدريب منحة البرنامج 5 T32 A107611-10.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
HPLC عمود أنيون تبادل فاريان PL1551-3802
Drabkin كاشف سيجما D5941-6VL
الهيموغلوبين القياسية بوانت العلمية H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex شكل الصوديوم 100 سيجما C7901
EDDHA LGC معايير محدودة ANC 001
الهيموجلوبين الأجسام المضادة سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، وشركة SC-21005
تريبسيني الصويا أجار BD 236920

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).
    3. <....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة