يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على

10.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50084

⸱

فبراير 14, 2013

 , 
1Plant Sciences Institute, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

في هذه المقالة

ملخص

وهناك طريقة لتحليل إمكانية وصول المذيب للمجموعة ثيول من بقايا السيستين من الذرة rayado فينو فيروس (MRFV)-الفيروسات مثل الجزيئات (VLPs)، يليه رد فعل عبر ربط الببتيد. الأسلوب يستفيد من توافر عدة مجموعات كيميائية على سطح VLPs التي يمكن أن تكون أهدافا لردود فعل معينة.

الملخص

محاكاة واستغلال الخصائص الفيزيائية والخصائص الفيروس والبدنية يبشر بالخير لتوفير حلول لبعض التحديات العالمية الأكثر إلحاحا. مجموعة الهائل وأنواع من الفيروسات بالإضافة إلى خصائصها المثيرة للاهتمام أن يحتمل فرصا لا نهاية لها لتقديم الطلبات في التكنولوجيات القائمة على الفيروس. الفيروسات لديها القدرة على الى جزيئات منفصلة مع شكل وحجم والنوعية التناظر، polyvalence، وخصائص ثابتة في مجموعة واسعة من ظروف درجة الحرارة ودرجة الحموضة الذاتي تجميع. ليس من المستغرب، مع مجموعة رائعة من هذه الخصائص، ويقترح الفيروسات للاستخدام في المواد الحيوية 9، اللقاحات 14 و 15، والمواد الالكترونية، وأدوات كيميائية، والحاويات الإلكترونية الجزيئية 4، 5، 10، 11، 16، 18، 12.

للاستفادة من الفيروسات في تكنولوجيا النانو، يجب تعديلها من أشكالها الطبيعية لنقل وظائف جديدة. هذا التحدي العلاقات العامةلا يمكن أن يؤديها من خلال عدة آليات صوتك بما في ذلك التحوير الوراثي للجينوم الفيروسي وربط جزيئات أجنبية أو كيميائيا المطلوب إلى مجموعات الجسيمات المتفاعلة الفيروس 8. القدرة على تعديل فيروس يعتمد بالدرجة الأولى على خصائص الفيزيائية والمادية للفيروس. وبالإضافة إلى ذلك، والتعديلات الجينية أو الفيزيائية تحتاج إلى القيام بها دون أن يؤثر ذلك سلبا على بنية الفيروس الأصلي وظيفة الفيروس. الذرة rayado فينو فيروس البروتينات معطف (MRFV) في الإشريكية القولونية المنتجة VLPs مستقرة وخالية من التي استقرت البروتين البروتين الذاتي التجمع ويمكن استخدام التفاعلات وذلك في التطبيقات المستندة إلى تقنيات الفيروس 8. تم فحص VLPs المنتجة في مصانع التبغ بوصفها سقالة التي يمكن أن مجموعة متنوعة من الببتيدات عرض تساهميا 13. هنا، نحن تصف خطوات ل1) تحديد أي من المذيبات cysteines الوصول إليها في قفيصة الفيروسات المتاحة لmodifiالموجبة، و 2) bioconjugate الببتيدات إلى تعديل capsids. باستخدام الأصلي أو إدخال mutationally-مخلفات الأحماض الأمينية ومستوى التقنيات اقتران، تم عرض تشكيلة واسعة من المواد الموجودة على سطح من الفيروسات النباتية مثل، فيروس تبرقش بروم 3، قرنفل فيروس البرقشة 12، اللوبيا داء الاخضرار البرقشة فيروس 6، فسيفساء التبغ فيروس 17، اللفت الأصفر فيروس فسيفساء 1، وMRFV 13.

البروتوكول

1. التلقيح وتنقية الفيروسات من النباتات VLPs benthamiana نيكوتيانا

  1. توج T7-إنتاج نسخ من RNA فيروس البطاطا X (PVX) القائم على البلازميدات ناقلات تحمل MRFV البرية من نوع (وزن) والسيستئين-تحور البروتين معطف (CP) الجينات 12، باستخدام Ambion في T7-mMessage mMachine كيت.
  2. لكل رد فعل نص T7، تطعيم توسيع اثنين من يترك تماما N. benthamiana مع 10 ميكرولتر واحتضان ردود فعل النباتات لمدة 10 أيام في الاحتباس الحراري، في الرطوبة 60٪ لمدة 16 ساعة مع ضوء (25،000-30،000 لوكس) عند 25 درجة مئوية و 8 ساعة مظلمة في 20 ° C.
  3. الحصاد ر N. benthamiana الأوراق المصابة بالفيروسات 10 أيام آخر التلقيح (نقطة في البوصة)، وزن الأنسجة النباتية (50 غرام) ومكان على الجليد.
  4. تجانس المواد النباتية في الخلاط بحضور 100 مل من محلول مبرد بنسبة 0.5 العازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5 (2 مل من استخدام المخزن المؤقت في كل غرام من الأنسجة النباتية).
  5. تصفية جناسة إلى 3 طبقات من cheeseclأوراسكوم تليكوم القابضة وتوضيح بواسطة الطرد المركزي في 27000 XG لمدة 30 دقيقة. نقل طاف في اسطوانة تخرج المبردة، وقياس مستوى الصوت، ثم نقل إلى الدورق ومعقمة مبردة. تجاهل بيليه.
  6. معالجة طاف بإضافة 10٪ البولي ايثيلين جلايكول 8،000 (PEG 8،000)، يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في C ° 4، واحتضان ل45 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية لترسيب جزيئات الفيروسات مثل (VLPs)-PEG المصفوفة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في العينة 27000 XG لمدة 20 دقيقة في C ° 4 و إزالة طاف.
  8. معالجة بيليه بإضافة 8 مل قدره 0.05 عازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5 تحتوي على 2٪ تريتون X-100. دوامة أجهزة الطرد المركزي أنابيب جيدا للافراج عن بيليه. نقل بيليه وعازلة لكأس معقمة مبردة. شطف الأنابيب مباشرة مع 2 مل من نفس المخزن المؤقت وإضافته إلى كوب. تحريك التعليق في 4 درجات مئوية حتى يتم حل الكريات (عموما 1 ساعة).
  9. توضيح بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 27000 XG، تجاهل بيليه، و فrocess طاف بواسطة الطرد المركزي عند 140،000 XG لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  10. إعادة تعليق بيليه في 1 مل العازلة 0،05 M نا السيترات، ودرجة الحموضة 5.5 و وضع تعليق على قمة التدرج السكروز 10-40٪ 0،05 المحرز في المخزن المؤقت نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5.
  11. أجهزة الطرد المركزي التدرج لمدة 3 ساعة على 140،000 XG في 4 درجات مئوية.
  12. تسليط الضوء على الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي وجمع الفرقة تشتت الضوء العلوي في 4 سم من أعلى الأنبوب، تمييع مع 0.05 عازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ساعة على 140،000 XG في 4 ° C.
  13. إعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من الماء المعقم وتخزينها في C ° 4 لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  14. Quantitate تركيز VLPs عن طريق إجراء فحص البروتين برادفورد. العائد من VLPs بين 1 و 3 ميكروغرام / غرام من الأنسجة النباتية.

2. فلوريسئين-5-maleimide وضع العلامات من ردود الفعل VLPs

  1. إعداد الحل 1 ملم فلوريسئين-maleimide-5 (427.37 جم / مول) في 50 ملي الفوسفاط الصوديومه العازلة، ودرجة الحموضة 7.0؛ 1 ملم EDTA. خلط باستخدام الدوامة والتحقق من حل كامل. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  2. إضافة فلوريسئين-5-maleimide لVLPs المنتجة في الخطوة 1 والمزيج. استخدام فائض 25-أضعاف ضرس فلوريسئين-maleimide-5 لكمية من المولي sulfhydryls. عموما، باستخدام 30 ميكرولتر من VLPs في تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر و 60 ميكرولتر من محلول فلوريسئين-5-maleimide تعطي نتائج مقبولة.
  3. احتضان لمدة 2 ساعة رد فعل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في C. ° 4
  4. إنهاء رد فعل من خلال إضافة dithiothreitol (DTT) إلى تركيز النهائي من 50 ملي.
  5. إزالة غير رد فعل فلوريسئين باستخدام عمود الدوران إزالة الملوحة (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في XG 1500 في درجة حرارة الغرفة.
  6. لSDS-PAGE التحليل، إضافة 10 ميكرولتر من 2 × SDS-PAGE العازلة عينة Laemmli إلى 10 ميكرولتر من كل رد فعل. تخزين البروتين المسمى محمية من الضوء في C ° 4 لمدة تصل إلى شهر واحد أوفي ذات الاستخدام الواحد مأخوذة في -20 ° C مدة تصل إلى 3 أشهر.

3. وضع العلامات وتحديد رد الفعل التأسيس البيوتين

  1. استخدام الأعمدة تدور تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) لتنفيذ تبادل العازلة من الماء إلى الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 7.0 درجة الحموضة من إنتاج VLPs في الخطوة 1.
  2. إعداد محلول المخزون من 20 ملي maleimide-البيوتين-PEG2 عن طريق إضافة ميكرولتر 190 من PBS في وزن لا maleimide---PEG2 البيوتين ومزيج من pipetting صعودا وهبوطا.
  3. إضافة maleimide-PEG2-البيوتين إلى VLPs والمزيج. استخدام فائض يساوي 10-fold ضرس كاشف عن حلول VLPs ≤ 2 ملغ / مل.
  4. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة.
  5. إزالة غير رد فعل maleimide-PEG2-البيوتين باستخدام عمود الدوران تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في XG 1500 في درجة حرارة الغرفة.
  6. تحديد الشامات من البيوتين في مولات VLPs باستخدام الكمي البيوتين بيرس كيت (الحرارية العلمية) وFOالنماذج التالية تعليمات الشركة الصانعة.

4. عبر ربط السيستئين VLPs-2 والببتيد F

  1. وتستخدم VLPs مما أدى إلى بقايا السيستين المتاحة للربط عبر في الخطوة 2 (2-السيستئين VLPs) في الخطوة التالية. إعداد محلول المخزون جديدة عبر ربط (28.63 ملم) عن طريق إذابة 10 ملغ من NHS-PEG4-maleimide رابط العرضي في 680 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
  2. حل ل17 (F)-الأمينية الببتيد حمض طويلة (LLPNMOKDKEACAKAPL) في 50 ميكرولتر من العازلة اقتران (1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم EDTA) بتركيز 0.1 ملم.
  3. إضافة 4 ميكرولتر من رابط العرضي إلى 50 ميكرولتر من حل الببتيد (البروتين NH2) في تركيز 1 انتهاء ملي (وهو الزائدة يساوي 10-fold المولي ل0.1 ملم حل الببتيد).
  4. احتضان لمدة 2 ساعة رد فعل في C. ° 4
  5. تنقية عبر ربط الببتيد باستخدام عمود تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) معايرتها مع العازلة اقتران (1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم EDTA) بواسطة الطرد المركزي عند 1500 XGلمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد مزيج يجمع بين رد فعل VLPs (البروتين-SH) وعبر ربط الببتيد (البروتين NH2) في نسبة المولي يحدد من قبل عدد من ثيول والأمينات المشاركة في تنشيط التفاعل والفرق في الوزن الجزيئي بين VLPs والببتيد.
  7. احتضان خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة في C. ° 4
  8. لتحليل لطخة غربية، خلط الناتج مترافق مع المنتج 01:01 عازلة Laemmli، وتغلي لمدة 10 دقيقة، والمضي قدما في SDS-PAGE على الزهر قبل 10-20٪ هلام تريس جليكاين (إينفيتروجن)، تليها الصعود إلى electroblotting غشاء النيتروسليلوز (إينفيتروجن). منع الأغشية مع 1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2 تحتوي على 0.05٪ توين-20 (PBS-توين) و 5٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم والتحقيق مع الببتيد محددة الأجسام المضادة تليها الفوسفاتيز الأجسام المضادة التي تحمل علامات الثانوية المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عابر التعبير عن الجينات الطافرة معطف MRFV (CP) البروتين في N. يوصف النباتات benthamiana في VLPs ناقلات القائم على إنتاج PVX في الشكل 1. يتم تضخيمه معطف MRFV معدلة الجينات البروتين بواسطة PCR ثم وضعت تحت سيطرة الترانسكربتي من المروج subgenomic CP تكرار في ناقلات القائم على PVX، pP2C2S 2، (هدية من Baulcombe D.، سينسبري المختبرات، نورويتش، إنجلترا)، وفي المختبر RNA RNA النسخ تنتج النصوص التي استخدمت بعد ذلك لتطعيم N. benthami...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة رد الفعل cysteines موجودة على سطح VLPs التي ينتجها النبات وكذلك على مجمعات البروتين الأخرى. Maleimides هي ثيول محددة الكواشف، التي تتفاعل مع جزيئات سلفهيدريل المحتوية على حرية تشكيل السندات أثير ثيولي مستقرة. هذا الأسلوب يعتمد على خصوصية maleimides للتفاعل مع مجموعات سلفهيدريل لم يشارك في التفاعل مع الأحماض الأمينية الأخرى. الحفاظ على هيكل الأصلي للVLPs مهم جدا من خلال العملية برمتها. في تطبيق وصفها، يتم تنفيذ ردود الفعل في ظروف المحلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يذكر من الأسماء التجارية للمنتجات التجارية في المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأميركية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
Thinwall، أنابيب فائقة الوضوح بيكمان 344059
mMESSAGE mMACHINE T7 كيت الحياة Tecnologies AM1344M
فلوريسئين-5-Maleimide تقنيات الحرارية العلمية الحياة 46130 F150 46130 هو من أجل بديل مع F150
بيرس كيت البيوتين الكمي الحرارية العلمية 28005
EZ-Maleimide لينك PEG2-البيوتين، لا وزن تنسيق الحرارية العلمية 21901
SM (PEG) ن Crosslinkers الحرارية العلمية 22107
10-20٪ هلام تريس جليكاين إينفيتروجن EC61352
Laemmli العازلة بيو راد 1610737
تريس العازلة جليكاين SDS تشغيل إينفيتروجن LC2675
تريس العازلة جليكاين نقل إينفيتروجن LC3675
النيتروسليلوز ساندويتش غشاء مرشح ورقة إينفيتروجن LC2001
الانجذاب الفوسفاتيز إعتبر تنقية جسم الأرنب لمفتش الحكومة Kirkegaard والمختبرات بيري 0751516
NBT / BCIP الفوسفاتيز الركيزة Kirkegaard والمختبرات بيري 508107

المراجع

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تشبيك الببتيداتاستراتيجيات الاقتران الحيويالفصل الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS Page)لطخة ويسترنتعديل السطح
تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.