الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

ملخص

ويقدم وسيلة سريعة للكشف عن سرطان الجلد باستخدام معدلات الزرد نموذج الورم الأصليين. فإنه يستفيد من ناقلات miniCoopR الذي يسمح للتعبير عن الجينات المرشحة سرطان الجلد في الخلايا الصباغية. يتم وصف طريقة للحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد، ومقايسة الغزو، بروتوكول للتلوين الأجسام المضادة الخلايا الصباغية نطاق وفحص زرع سرطان الجلد.

الملخص

وقد أسفرت دراسات الجينية من السرطانات البشرية ثروة من المعلومات حول الجينات التي تتغير في الأورام ^1،2،3. وثمة تحد الناشئة عن هذه الدراسات هو أن يتم تغيير العديد من الجينات، وأنه يمكن أن يكون من الصعب التمييز تغيرات جينية تكون الأورام التي دفعت من تلك التي نشأت بالمناسبة خلال التحول. لرسم هذا التمييز فإنه من المفيد أن يكون هناك مقايسة التي يمكن قياس كميا تأثير جين متغير على بدء الورم وغيرها من العمليات التي تمكن الأورام أن تستمر ونشر. هنا نقدم وسيلة سريعة لفحص أعداد كبيرة من معدلات سرطان الجلد مرشح في الزرد باستخدام نموذج الورم الأصليين ⁴ أن يشمل الخطوات المطلوبة لبدء سرطان الجلد والصيانة. A كاشف رئيسي في هذا الاختبار هو متجه miniCoopR، الذي أزواج نسخة من النوع البري من مواصفات mitfa عامل الخلايا الصباغية إلى عبارة كاسيت إعادة التركيب في أي من المرشحين ميلويمكن إعادة تجميع الجينات أنوما ^5. الناقل miniCoopR لديه minigene الإنقاذ mitfa الذي يحتوي على المروج، فتح الإطار القراءة و3'-غير مترجمة المنطقة من الجين mitfa من النوع البري. لأنها تتيح لنا لجعل البنى باستخدام كامل طول إطارات القراءة المفتوحة للمعدلات سرطان الجلد مرشح. ويمكن بعد هذه الحيوانات المستنسخة الفردية يتم حقنها في تيراغرام خلية واحدة (mitfa: BRAF ^V600E)؛ P53 (LF)؛ الأجنة الزرد mitfa (LF). يحصل دمج ناقلات miniCoopR من Tol2 بوساطة transgenesis ⁶ و ينقذ الخلايا الصباغية. لأن تقترن ماديا إلى minigene الإنقاذ mitfa، يتم التعبير عن الجينات المرشحة في الخلايا الصباغية انقاذ، والبعض منها سوف تتطور الى تحويل والأورام. ويمكن قياس تأثير الجين مرشح على بدء سرطان الجلد القتامي الخلية وخصائص منحنيات البقاء على قيد الحياة سرطان الجلد باستخدام خالية من المقايسات غزو، وتلطيخ الأجسام المضادة وفحوصات الزرع.

البروتوكول

1. الكشف عن المعدلات بداية ظهور سرطان الجلد

1. إنشاء بوابة دخول الحيوانات المستنسخة الأوسط من خلال تضخيم PCR كامل طول الإطار القراءة مفتوحة من الجينات ذات الاهتمام (GOI) وإعادة توحيد pDONR إلى 221 باستخدام BP clonase II (إينفيتروجن). استخدام التكنولوجيا متعددة المواقع بوابة (إينفيتروجن) لp5E_mitfa أعد تجميع، pME_GOI، Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ و miniCoopR ⁵ إلى وضع الجينات ذات الاهتمام تحت المروج mitfa في ناقلات miniCoopR (الشكل 1A).

النتائج

تم حقن الأجنة الزرد mitfa (LF) مع الناقل الذي يحتوي على الجين الورمي miniCoopR سرطان الجلد SETDB1 5 أو EGFP، كل منها تحت سيطرة المروج mitfa؛ P53 (LF)؛: واحد خلايا تيراغرام (BRAF ^V600E mitfa). وقد تم اختيار الأجنة مع الانقاذ الخلايا الصباغية وسمح لتنضج. في 2 أشهر من العمر مع الحيوانات الانقاذ تم تحديد الخلايا الصباغية أكبر من 4 مم ^2. تم فحص الحيوانات أسبوعيا لالميلانينية. وأظهرت منحنيات حدوث الأورام للبالغين أن الجي.......

المناقشة

طريقة miniCoopR تمكن التعبير عن الجينات ذات الأهمية في الخلايا الصباغية الزرد. هذا النهج يستفيد من حقيقة أن هذا الجين يعمل الزرد mitfa الخلايا بشكل مستقل. لهذا السبب، الخلايا الصباغية انقاذهم من قبل الناقل miniCoopR من المؤكد أن تحتوي على الجينات أي minigene والاهتمام الذي يقترن جسديا. الخلايا الصباغية انقاذ واضحة للعيان ويمكن الحصول عليها في الحيوانات التي تم حقن وحيدة الخلية الأجنة. يتم تحديد درجة محددة من الخيمرية، ويمكن تجاوز هذه الحيوانات وسجل لقطع الورم أو ظهور الخص.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
الكواشف بوابة إعادة التركيب	إينفيتروجن
miniCoopR			المرجع 5
Mitfa الأجسام المضادة			المرجع 5
FITC الضد الماعز المضادة للأرنب مفتش	إينفيتروجن
Vectashield	ناقلات مختبرات	H-1000
كاسبر اسماك الزرد			المرجع 9
701N 10 ميكرولتر الحقنة	هاميلتون / فيشر	14-824	ونبسب؛
40 ميكرون فلتر	BD فالكون / فيشر	352340
FBS	إينفيتروجن	26140079