Method Article

المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

DOI:

10.3791/50143

⸱

August 20th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن لشرح استخدام برنامج الإعداد ميكروفلويديك بسيطة، التي يمكن من خلالها تعقب خلايا الخميرة في مهدها واحدة طوال حياتها بأكملها. رقاقة ميكروفلويديك يستغل الفرق بين حجم الخلايا الأم وابنتها باستخدام مجموعة من micropads. عند تحميل، محاصرون الخلايا تحت هذه micropads، لأن المسافة بين micropad وغطاء زجاجي يشبه القطر من خلية الخميرة (3-4 ميكرون). بعد إجراء التحميل، يتم مسح مستنبت بشكل مستمر من خلال رقاقة، مما يخلق ليس فقط بيئة ثابتة ومحددة في كافة مراحل التجربة برمتها، ولكن أيضا الإحمرار خارج الخلايا الوليدة الناشئة، التي لا يتم الاحتفاظ تحت منصات نظرا لحجم أصغر بهم. الإعداد يحتفظ الخلايا الأم بكفاءة حتى أنه في تجربة واحدة تصل إلى 50 الخلايا الفردية يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل لمدة 5 أيام، إذا لزم الأمر، أو لفترة أطول. وبالإضافة إلى ذلك، الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة تسمح عاليةالدقة التصوير من الخلايا أثناء عملية الشيخوخة بأكمله.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبرعم الخميرة هو كائن نموذجا هاما للشيخوخة البحوث 1. حتى دراسة مؤخرا تنسخي الشيخوخة في خلايا الخميرة كانت عملية شاقة تتطلب طريقة تشريح، في كل برعم التي تم إزالتها يدويا من الخلية الأم 2،3. لحل هذه المشكلة، قدمنا ​​مؤخرا إعداد ميكروفلويديك رواية قادرة على تتبع الخلايا الأم الفرد طوال حياتهم بأكملها عمر 4.

في رقاقة لدينا ميكروفلويديك، محاصرون خلايا الخميرة تحت لينة micropads القائمة على المطاط الصناعي (انظر الشكل 1). استمرار تدفق المتوسطة يغسل بعيدا الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا وتوفر الخلايا مع المواد المغذية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج وإعداد قالب رقاقة السيليكون

يتم إنشاء رقائق ميكروفلويديك من قالب رقاقة السيليكون التي تنتجها الطباعة الحجرية الناعمة. هذه الرقائق يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة لإنتاج رقائق ميكروفلويديك. فإنه من المستحسن أن يتم تنفيذ إنتاج رقاقة منها من قبل مجموعة متخصصة في على microfluidics 6.

يرصد الرقاقة في عملية ضوئيه من خطوتين باستخدام اثنين من طبقات مختلفة من مقاومة للضوء سلبي، SU-8 7. يتم استخدام الطبقة السفلية لتوليد منطقة محاصرة خلية (SU-8 2002؛ ارتفاع 3-4 ميكرون)، في ح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، يتم تحميل الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك مباشرة من ثقافة منتصف الأسي. للتأكد ما إذا كان التوزيع العمري للخلايا المحاصرين في رقاقة ميكروفلويديك هي مماثلة لتلك الثقافة قبل التحميل، وكانت ملطخة الخلايا مع راصة القمح مترافق إلى FITC (WGA-FITC) لتصور ندوب برعم. كما يمكن أن يرى في الشكل (3)، لا تنحاز لانحباس الخلايا تحت micropads للرقاقة ميكروفلويديك إلى خلايا سن معينة.

يمكن ببساطة تن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو أداة هامة في رواية الشيخوخة البحوث، لأنها تتيح الجيل بسيطة ومؤتمتة من الخميرة تنسخي البيانات العمر في تركيبة مع استمرار ارتفاع القرار التصوير. هذه الصفات هي تحسينات كبيرة على مدى الإمكانات التجريبية للطريقة تشريح الكلاسيكية، ولكن هناك عدد قليل من القيود من الطريقة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار.

علما أن تحديد عمر تنسخي يمكن أن تتأثر كفاءة الإبقاء على الخلايا الأم: كل خلية أبقى ت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر Schippers لورا لكتابة النسخة الأولى من بروتوكول التحميل الخليوي وماركوس دي Goffau وجيلي Zampar لتسجيل الأشكال التضاريسية الميتوكوندريا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments الألومنيومبلاستيكي يمكن التخلص منه

REAGENTS< / strong>
DC Sylgard 184 المطاط الصناعي Mavom bv1060040تحتوي هذه الحزمة على قاعدة PDMS وعامل معالجة PDMS.
أطباق بتري زجاجية 120/20 مم VWR International391-2850
غطاء نظارات 22x40 مم CBN Labsuppliers BV190002240
Tough-Tags Sigma-AldrichZ359106
رقائق
كوب
ماصة مصلية 5 مل VWR International612-1245
شريط سكوتش VWR International819-1460
معجون Baysilone (سيليكون GE Bayer) Sigma-Aldrich85403-1EA
أنابيب التجويف الصغيرة ، 0.012 "معرف × 0.030" OD كول بارمرEW-06417-11يشار إليها باسم أنابيب رقيقة
Tygon microbore Tubing ، 0.030 "ID x 0.090" OD Cole ParmerEW-06418-03يشار إليها باسم الأنابيب السميكة
مشرط VWR International233-5334
50 مل محاقن Luer-Lok BD300137
5 مل ، طرف لور VWR International613-1599
ملاقط VWR International232-2132
20 بذرة مقياس لور Instech SolomonLS20
مرشحات الحقن (حجم المسام 0.20 & mu; م) Sigma-Aldrich16534K
قابس قسطرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 20 ga x12 مم Instech SolomonSP20 / 12
أطباق بتري VWR International391-0892
EQUIPMENT< / strong>
منظف الأوزون للأشعة فوق البنفسجية NOVA ScanPSD-UVT
مضخة هارفارد 11 جهاز النخبة هارفارد70-4505
SU-8 قالب السيليكون الرئيسي (رقاقة) عصامي ؛ لمزيد من التفاصيل اتصل بالمؤلف المقابل
Balance Sartorius corporationED4202S
مضخة فراغ KNF NeubergerN022 AN.18
Desiccator VWR International467-2115
لوحة ساخنة VWR International460-3267
اختياري: حامل معدني لزجاج الغطاء (22x40 مم) عصامي. للحصول على التفاصيل ، اتصل بالمؤلف المراسل
(Fluorescence) المجهر مع هدف 60x ، والتركيز التلقائي ، وقدرات الفاصل الزمني ويفضل أن تكون مرحلة نيكون Eclipse Ti-E الآلية (التحكم الآلي XY)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
  2. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  3. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Budding Yeast AgingMicrofluidic ChipYeast Cell TrackingReplicative LifespanContinuous MicroscopyMother Daughter SeparationPDMS Chip FabricationFluorescence MicroscopyMitochondrial MorphologyLifespan Curve Analysis

Related Articles