يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

12.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50145

⸱

مارس 12, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

في هذه المقالة

ملخص

ويرتبط ضعف KV قناة مع عدم انتظام ضربات القلب. من أجل دراسة الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب مثل نستخدم بروتوكول منهجية لعزل cardiomyocytes الأذيني البطيني من التبعية وكيلو فولت الفئران خروج المغلوب قناة فرعية. ويمكن بعد ذلك على الفور cardiomyocytes المعزولة أن تستخدم للدراسات الكهربية الخلوية، والكيمياء الحيوية أو المناعي (IF) المقايسات.

الملخص

الجينات ترميز KCNE لأسرة صغيرة من الوحدات الصغرى كيلو فولت الإضافية التي تشكل مجمعات قناة مغايرة التغصن مع مفارز قناة ألفا كيلو فولت لتعديل خصائصها الوظيفية. تم العثور على طفرات في الجينات KCNE في المرضى الذين يعانون من عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة QT طويلة و / أو الرجفان الأذيني. ومع ذلك، فإن الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى هذه الأمراض لا يزال بعيد المنال. في الدراسات السابقة قد تم في الغالب الخصائص الكهربية للمرض تسبب الطفرات في هذه الجينات درس في أنظمة تعبير مغايرة، ونحن لا يمكن أن يكون متأكدا مما إذا كان يمكن مباشرة آثار ذكرت أن تترجم إلى cardiomyocytes الأصلية. في المختبر لدينا ونحن بالتالي استخدام نهج مختلف. ندرس آثار مباشرة حذف الجينات في KCNE cardiomyocytes المعزولة من الفئران خروج المغلوب من الكهربية الخلوية - تقنية فريدة من نوعها التي وصفنا في هذا العدد من مجلة التجارب تصور. قلوب من geneticaورفعه بسرعة الفئران المهندسة وKCNE LLY وشنت على جهاز Langendorff من كيفية تركيب الكانيولا في الأبهر. لا بد مجانا كا 2 + في عضلة القلب بواسطة EGTA، ويتم تحقيق ذلك من التفكك myocytes القلب بواسطة رذاذ الوراء الشرايين التاجية مع وكالة متخصصة منخفضة CA 2 كولاجيناز العازلة التي تحتوي على +. ويمكن بعد ذلك الأذينين، مجانا الجدار البطين الأيمن والبطين الأيسر تكون مفصولة التقنيات المجهرية. وأضاف الكالسيوم ثم العودة ببطء إلى cardiomyocytes معزولة في خطوة متعددة تشمل إجراء الغسيل. ثم يتم cardiomyocytes الأذيني البطيني من ومظهر صحي مع عدم وجود تقلصات عفوية تعرض على الفور لتحليلات الكهربية بواسطة تقنية المشبك التصحيح أو التحليلات البيوكيميائية الأخرى في غضون الساعات ال 6 الأولى بعد العزلة.

البروتوكول

1. تخدير الحيوانات وحصاد الجهاز

  1. تخدير الماوس عن طريق الحقن (IP) داخل الصفاق من الكيتامين (200 ملغ / كغ) وزيلازين (20 مغ / كغ).
  2. لanticoagulate ضخ 250 وحدة دولية IP الهيبارين لتجنب تشكيل تخثر الدم والجلطة.
  3. الانتظار حتى يتم التوصل إلى الخدر العميق، الذي يتميز رخاوة. للتحقق من ومنعكس رخاوة الاختبار، عن طريق لمس القرنية بلطف القرنية أو اختبار رد الفعل من قبل الطيران معسر الذيل.
  4. نقل الماوس على طاولة العمليات واصلاحها في موقف ضعيف.
  5. شق الجلد وجدار البطن تحت الخنجري وأداء بضع الصدر صدفي: تمديد خفض لكلا الجانبين على طول القوس الساحلية وقطع في وقت لاحق الضلوع في خط وسطي الإبطين، صرف صعودا القفص الصدري.
  6. فتح التأمور، موقع الأوعية الكبيرة. اضغط بلطف الذيلية قلب لعرض أفضل الشريان الأورطي. المشبك باستخدام ملقط الشريان الأورطي.
  7. وضع القلب في التقعر من زوج من ق cissors وتشريح جميع السفن التي تربط مع بعضها قطع واحد. تأكد من الحفاظ على جزء كبير بما فيه الكفاية من الأبهر الصاعد لكيفية تركيب الكانيولا Langendorff.
  8. نقل على الفور إلى رفعه القلب طبق بتري مليئة الجليد الباردة وقبل كسيجينيزيد حل 1 (عن حلول، انظر الجدول 1).

2. إعداد الإرواء القلب وLangendorff

  1. يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي مع قنية الصلب 1.8F. تأكد لتجنب انسداد الهواء.
  2. يحملق في الشريان الأورطي قنية مع خياطة الجراحية وتدفق التاجية مع 1 مل من محلول 1.
  3. الاتصال قنية مع جهاز Langendorff.
  4. تأكد من الوقت بضع الصدر لكيفية تركيب الكانيولا Langendorff لا يزيد على 120 ثانية لتجنب نقص التروية الموسعة / ضخه إصابة في عضلة القلب.
  5. يروي القلب مع 10 مل من الكالسيوم 2 + حل الحرة 2 (4 دقيقة مل /).
  6. يروي القلب مع حل كولاجيناز 3 لل8 دقيقة (4 مل / دقيقة).
جنيه "> 3. المجهرية التفكك العام للغرف القلب

  1. نقل القلب في طبق بتري قبل تحسنت 100-مم تحتوي على الكالسيوم منخفضة 2 + الحل 4.
  2. إزالة بعناية الأبهري وغيرها من الأنسجة غير القلب مع مقص وتخلص منه.
  3. منفصلة الأذينين والبطينين ومتابعة كل غرفة على حدة. إبقاء خلايا مغمورة في محلول 4. استخدام وحدات التخزين الصغيرة (أقل من 5 مل).

4. مزيد من التفكك لCardiomyocytes

  1. cardiomyocytes الأذيني:
    1. لتفريد cardiomyocytes الأذيني نقل الأذينين إلى منفصلة قبل تحسنت طبق الثقافة 100-ملم وفصل الأنسجة من خلال سحب برفق بعيدا مع ملقط الغرامة. ضمان التفكك شبه الكامل للنسيج.
    2. استخدام ماصة 1 مل مع الموسع النار مصقول ماصة بلاستيكية تلميح لتعليق الخلايا في 1 مل من محلول 5 لمدة 5 دقائق.
    3. فصل الخلايا من الحطام باستخدام عامل تصفية الخلية (200 ميكرون حجم فتحات الشباك).
      4. <لى> إضافة 5 مل 5 إلى حل من المعلقات الخلوية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة.
    4. ويتم تشغيل الخطوات التالية تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في في 5 مل من محلول 6.
    5. بعد الترسيب بواسطة الجاذبية لمدة 10 دقيقة في أنبوب 15 مل، الطرد المركزي ل1 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف. اعادة تعليق الخلايا اعتمادا على كميتها في 1-5 مل من محلول 6.
  2. البطين cardiomyocytes:
    1. تشريح المنطقة البطين الأيسر في المصالح مع ملقط الغرامة في 5 مل من محلول 4.
    2. تعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف حتى يتم فصل معظم الخلايا. نقل الخلية الحل بعد تصفية (200 ميكرون حجم فتحات الشباك) في أنبوب 50 مل، إضافة حجم 25 مل.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة.
    4. ويتم تشغيل الخطوات التالية تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة. إزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه في 25 مل منالحل 6 و الترسيب تسمح للخلايا لمدة 10 دقيقة.
    5. عد الخلايا وإزالة طاف، إضافة 25 - على خلايا 50 مل حل 6.

5. إعداد Cardiomyocytes للالكهربية الخلوية، والكيمياء الحيوية أو الدراسات IF

  1. للدراسات الكهربية، والحفاظ على myocytes في حل 6 في أنبوب 50 مل وتمنع الترسيب.
  2. لالبيوكيميائية الدراسات، على سبيل المثال التصوير الكالسيوم، myocytes لوحة على laminin المغلفة خلية طبق الثقافة (تركيز النهائي 20 ميكروغرام / مل في laminin PBS).
  3. لتلطيخ المناعي إعداد طبق لوحة الثقافة الخلية مع تغطية زلات الزجاج والمغلفة مع حل laminin (تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في laminin PBS).
    1. إزالة الحل قبل myocytes الطلاء. لوحة الخلايا والتحكم في كثافة الخلايا باستخدام المجهر.
    2. السماح للmyocytes الالتزام لتغطية زلة لمدة 1 ساعة عند 37 ° C في 2٪ CO 2، إزالة الحلوتبدأ على الفور مع بروتوكول تلطيخ الإجراء العادي.
    3. احتضان مع PFA، على سبيل المثال مثبت 4٪ في برنامج تلفزيوني (7.5 درجة الحموضة) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واتبع الخطوات مع PBS 3 الغسيل لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. لpermeabilize الخلايا والأجسام المضادة لمنع غير محددة ملزمة احتضان myocytes مع المصل 10٪، 0.3٪ تريتون، 0.2٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1 ساعة عند 37 ° C ويغسل كما هو موضح من قبل.
    6. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لملون مباين نواة وα-actinin دابي استخدام وphalloidin مترافق ملون تألقي (اليكسا فلور 488، إينفيتروجن).
    7. بعد غسل ونقل الغطاء ينزلق الزجاج بعناية على سيلاني الشرائح المجهر والخلايا تعامل تضمين في مضان المتوسطة المتزايدة.

6. الكهربية الخلوية

  1. أداء خلية كاملة التصحيح، المشبك التسجيلات على الصحائفعزل shly cardiomyocytes الأذيني البطيني وعند درجة حرارة الغرفة.
  2. نقل صحي cardiomyocytes الظهور في غرفة مليئة نضح وحدة تخزين محددة من حل حمام خارج الخلية. كلوريد الصوديوم 117 ملم، 4 ملم بوكل، 1 ملم KH 2 PO 4، 4 مم NaHCO 3، 1،7 ملم MgCl 2، 3 مم كوكلي 2، HEPES ملي 10، 10 ملم الجلوكوز، و 0.02 سم الأسماك الرباعية الأسنان ملي (TTX)، (درجة الحموضة 7.4) . استخدام هيدروكسيد الصوديوم لتعديل قيمة الرقم الهيدروجيني.
  3. استخدام المعدات المناسبة المشبك التصحيح (أي IX71 المجهر المقلوب، مكبر للصوت Multiclamp 700B، عملية استحواذ 1440A Digidata النظام وPC مع pClamp10.3 البرمجيات (الأجهزة الجزيئية)).
  4. استخدام ماصات التصحيح مع المقاومة من 3-5 MΩ عندما مليئة حل الخلايا التي تحتوي على 130 ملم بوكل، 2 ملم MgCl 2 و 11 ملي HEPES، 11 مم EGTA، 5 مم نا 2 ATP، 0.4 مم نا 2 GTP، 5 ملي نا 2 CP و 4.9 ملي CaCl 2 (الرقم الهيدروجيني 7.2). استخدام KOH لتعديل قيمة الرقم الهيدروجيني.
  5. استحضار الخارج K + التيارات دوخطوات الحلقة الجهد 4.5 ثانية لاختبار إمكانات بين -60 +50 وبالسيارات في 10-بالسيارات الزيادات المحتملة من عقد -70 بالسيارات بعد 20 ميللي ثانية إلى prepulse بالسيارات -40.
  6. تأكد من التيارات تسرب دائما <100 باسكال.
  7. لتشريح K + التيارات المختلفة استخدام مثبطات محددة مثل المعراة-4 (4-AP؛ Biomedicals ICN، إرفين، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)، Heteropodatoxin 2 (HpTx2؛ Alomone) أو رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA؛ سيغما). وينبغي إعداد حلول الأسهم في حل حمام خارج الخلية، وتطبيقها مباشرة على المنطقة المجاورة أقرب ممكن من الخلية عن طريق التسجيلات microtip بعد "الأساسي". وينبغي أن يسمح لمدة 2-3 دقيقة موازنة قبل تسجيلات "المخدرات".
  8. لتحليل تطبيع سعة الحالية في الخلايا الفردية لحجم الخلية (خلية كاملة السعة الغشاء). تحليل البيانات دون اتصال باستخدام البرمجيات pClamp10.3 (الأجهزة الجزيئية) أو برامج مماثلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أصبح عزل cardiomyocytes الفئران الكبار من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة وظيفة جينات معينة ذات أهمية في المختبر أداة قوية لزيادة فهم الفيزيولوجيا المرضية القلبية. ويستخدم حاليا من قبل هذه الطريقة عدد صغير فقط ولكن زيادة معامل العلوم الأساسية في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، يمكن عزل cardiomyocytes البطين الكبار الفئران يمكن أن تكون خادعة ويجب القيام به بدقة وبشكل متكرر من قبل أيدي ذوي الخبرة. ويظهر الشكل 1 طازجة cardiomyocytes نموذج معزولة الأذيني البطيني و....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مع تطور متزايد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا لدراسة وظيفة القلب وأمراض القلب المتعلقة حذف الجينات هناك أيضا اهتمام متزايد في وسائل متخصصة لدراسة الآثار المترتبة على حذف جين معين في المختبر. في مختبرنا ندرس أدوار عائلة من مفارز كيلو فولت المساعدة على قناة عودة الاستقطاب القلب. الجينات KCNE تضم أسرة مكونة من 5 جينات (KCNE1-5) التي تلعب أدوارا هامة في البطين الإنسان وعودة الاستقطاب الأذيني 11 و 15. KCNEs هي واحدة عبر الغشاء المجال كيل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، فريتز تيسين-ستيفتونغ وشاريتيه / MDC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة
سم الأسماك الرباعية الأسنان Alomone
4-المعراة Biomedicals ICN
Heteropodatoxin 2 Alomone
رباعي إيثيل الأمونيوم سيجما للمواد الكيميائية
كولاجيناز من النوع 2 ورثينجتون

المراجع

  1. Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
  2. Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
  3. Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
  4. Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
  5. Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
  6. Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
  7. Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
  8. Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
  9. Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
  10. McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
  11. Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
  12. Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
  13. Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
  14. Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
  15. Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
  16. Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
  17. Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
  18. Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
  19. Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
  20. Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

KCNE P Clamp
العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.