هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي. هذا الأسلوب يعمل العيش ذبابة الفاكهة الأجنة كنموذج قوية لرصد البلعمة للخلايا أفكارك باستخدام وضع العلامات المحددة للخلايا أفكارك والبالعات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة لاحقة (إزالة الخلايا الميتة) أمر بالغ الأهمية من أجل التنمية طبيعي في جميع الكائنات الحية metazoan. إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية يرتبط ارتباطا وثيقا مع موت الخلايا؛ تعتبر الخلايا أفكارك unengulfed بالكاد في الجسم الحي في ظل ظروف طبيعية. من أجل فهم الخطوات المختلفة لإزالة الخلايا الميتة ومقارنة البالعات 'المهنية' - الضامة، والخلايا الجذعية إلى 'غير مهنية' - خلايا الأنسجة المجاورة المقيمين، في الجسم الحي التصوير المباشر لعملية قيمة للغاية. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة التخليص الخلية أفكارك في العيش أجنة ذبابة الفاكهة. لمتابعة ديناميات الخطوات المختلفة في البلعمة نستخدم علامات محددة للخلايا أفكارك والبالعات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رصد نظامين بلعمية في نفس الوقت: الضامة 'المهنية' و 'نصف profeالدبقية ssional 'في الجهاز العصبي المركزي النامية (CNS). الطريقة الموضحة هنا توظف الجنين ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للدراسات في الوقت الحقيقي من إزالة الخلايا الميتة.
المقدمة
القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة اللاحقة أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين وكذلك للتوازن الأنسجة في الكبار. البلعمة من الخلايا أفكارك أو إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية التي تسير في أربع خطوات: (1) تعيين البالعات إلى الخلية أفكارك ('العثور-ME')، (2) الاعتراف الخلية كهدف للالبلعمة ( 'أكل لي') و (3) الغمر، تليها (4) نضوج يبلوع وتدهور جسيم أفكارك 1-5. هناك نوعان من البالعات: الضامة 'المهنية' والخلايا الجذعية غير الناضجة، و 'غير مهنية' الخلايا المجاورة الأنسجة المقيمين، والتي هي حاسمة لإزالة الخلايا أفكارك أثناء تطوير metazoan 6،7.
ذبابة الفاكهة في التنمية، والقضاء على خلايا زائدة عن الحاجة من خلال موت الخلايا المبرمج يحدث في ثلاثة ممراحل عين، لأول مرة في منتصف إلى أواخر الجنين، ثم في منتصف خادرة، ومرة أخرى في الكبار في وقت مبكر. خلال مرحلة التطور الجنيني تتم إزالة الجسيمات أفكارك بواسطة البالعات 'المهنية'، الضامة، والأديم الظاهر و'غير مهنية' والدبقية 8،9.
في أعمالنا السابقة حددنا مستقبلات البلعمية، لمدة ستة ميكرون تحت (SIMU)، وهو ما يعبر عنه حصرا في الخلايا البلعمية خلال مرحلة التطور الجنيني. باستخدام المروج تليفون ولدت لدينا علامة محددة للسكان الخلية البلعمية (سيمو-cytGFP) والتي تمكننا من رصد الضامة، الأديم الظاهر والدبقية في وقت واحد في وضع الجنين ايف 8. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام علامات محددة للخلايا أفكارك في مراحل مختلفة من موت الخلايا المبرمج، ونحن قادرون على تتبع تحركات لإزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لمتابعة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي يجب أن يكون المسمى اثنين من السكان من الخلايا: الخلايا البلعمية والخلايا أفكارك.
بمناسبة السكان الخلية البلعمية نستخدم خط ذبابة الفاكهة التي تحتوي على علامة تليفون-cytGFP، التي تصف الخلايا البلعمية حصرا في الجنين: الضامة، والخلايا الدبقية الأديم الظاهر 8. يمكن للمرء استخدام علامات مختلفة للخلايا البلعمية، بما في ذلك خطوط تحتوي على السائق GAL4 كرية دموية محددة (CRQ-GAL4) أو الدبقية محددة GAL4 السائق (الريبو-GAL4) ومراسل الفلورسنت المشفرة جينيا تحت السيطرة UAS (UAS GFP-).
لرصد الخلايا أفكارك خلال إزالة الخلايا الميتة التي نستخدمها موت الخلايا المبرمج مختلفة / علامات البلعمة. Annexin V (المسابر الجزيئية) بمثابة مؤشر مبكر لخلايا أفكارك 10؛ Phiphilux (OncoImmunin) هي الفلورة كاسباس 3 الركيزة، التي يستخدم كأساس apopto في وقت لاحقجهاز الأمن والمخابرات علامة، وLysoTracker (المسابر الجزيئية) يعمل كعلامة يبلوع. نحن حقن هذه الكواشف باستخدام نظام حقن مكروي PicoPump PV 820.
1. يستعد
- الغراء هيبتان:
انبسط الشريط مزدوجة من جانب ووضع بقدر ما يمكنك في قارورة التلألؤ، وملء مع هيبتان، ختم قارورة مع parafilm، والصخور لمدة 24 ساعة. إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا. - نسمح الذباب لتضع على عصير العنب قبل تحسنت وحة آغار + الخميرة لصق لمدة 2 ساعة، ثم نقل لوحة إلى 25 درجة مئوية لمدة 10-12 ساعة (يعتمد على المرحلة المطلوبة) قبل حقن مكروي والوقت الفاصل بين التسجيلات من الأجنة حقن. نحن جمع أجنة من لوحات أجار الحفاظ على 25 درجة مئوية، وبالتالي توفير الأجنة من مرحلة 15 أو 16 من التنمية.
- إعداد إبرة:
لإعداد إبر للحقن، ونحن نستخدم "أداة سوتر 'ساحبة إبر وخيوط زجاجية رقيقة الجدران (أنابيب شعرية FHC). واندلعت غيض من تجميع الشعريةN ليبلغ قطرها 0.5-2 ميكرون. - ساترة مع الغراء:
تلميح باستخدام ماصة تفريق قطرة من الغراء هيبتان في سطر واحد في منتصف ساترة. اتركها لتجف لبضع ثوان. إعداد عدد قليل من هذه coverslips على.
2. تحضير الجنين
- جمع الأجنة من لوحات أجار ونقلها إلى مصفاة الخلية (علوم الحياة SPL) باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. ويقام على مصفاة كوب لجمع مياه الصرف الصحي.
- غسل الأجنة في مصفاة الخلية باستخدام المياه حتى يتم إزالة كافة عجينة الخميرة.
- تجف الماء الزائد عن طريق مسح السطح الخارجي للمصفاة باستخدام Kimwipes.
- وضع مصفاة الخلية في طبق بتري نظيفة وإضافة ما يكفي من مواد التبييض 50٪ لتغطية الأجنة في مصفاة الخلية. Dechorionate الأجنة لمدة 2 دقيقة في بعض الأحيان (2-3 مرات) التحريك لهم.
- شطف مع المياه على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة التبييض.
- وضع مصفاة الخلية في نظيفةطبق بتري وتغطية الأجنة مع الماء لمنع الجفاف.
- قبل البدء في إعداد الأجنة، تحميل 1 ميكرولتر من كاشف المطلوب في اثنين من الإبر (أحيانا إبرة يمكن انسداد). يستغرق حوالي 5 دقائق للسائل للوصول إلى رأس الإبرة.
- قطع قطعة مستطيلة من العنب آغار عصير ووضعها على شريحة المجهر. نقل الأجنة dechorionated من طبق بيتري إلى قطعة أجار باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة.
- تحت المجهر تشريح فلوري حدد بشكل صحيح نظموا الأجنة معربا عن علامة GFP باستخدام فرشاة الطلاء الرطب وتضع كل جنين على مقربة من حافة قطعة أجار في صف واحد تلو الآخر (الشكل 1A). ينبغي أن توضع الأجنة مع جانبهم بطني حتى لالبلعمة التصوير بواسطة الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
- إعداد حوالي 10 الأجنة في صف واحد.
- نعلق الأجنة إلى ساترة المغلفة في الوسط مع شريط من الغراء هيبتان (الشكل 1B، C ).
- وضع ساترة في غرفة الجفاف لمدة 5 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة والمبلغ الذي يتم حقنه).
- بعد تجفيف تغطية الأجنة مع زيت الهالوكربون 700 (سيجما) لتجنب المزيد من الجفاف.
- وضع ساترة على شريحة المجهر مع الأجنة مواجهة. قد كنت وضعت قطرة من الماء على الشريحة لمنع الانتقال من ساترة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن. موقع الحقن هو عادة على الجانب الوحشي في منتصف الجنين.
3. حقن الجنين
- إرفاق الإبرة إلى مياداة مجهرية.
- لكسر غيض إبرة وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية وضبط الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. تحرك بحذر جدا ساترة حتى يضرب رأس الإبرة ويكسر ذلك.
- مع التركيز على الأجنة، ضع الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرة السائل من إبرة. ذلك يعني تم غيض إبرةكسر جيدا.
- دون لمس حامل إبرة نقل الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين. نقل الجنين بعيدا والمضي قدما إلى المرحلة التالية حتى يتم حقن كل الأجنة.
4. التصوير
نحن صورة الأجنة على مجهر متحد البؤر المقلوب مع الهدف 40X أو 100X. ونحن نتطلع لوضع الجنين بشكل جيد مع الجهاز العصبي المركزي في الوسط، مما يدل على التعبير GFP قوي ووضع العلامات الجيدة من الخلايا أفكارك بعد الحقن.
للمرة تسجيلات انقضاء الأجنة الحية نختار عادة 5 أو 6 شرائح متحد البؤر (2 ميكرون سميكة لكل منهما). بعد ذلك، ونحن جعل الإسقاط من 3 شرائح (6 سماكة ميكرون) من أجل مراقبة الخلايا بأكملها.
نحن نستخدم علامات لخلايا أفكارك التي هي مستقرة ولا التبييض بسهولة. لتجنب التبييض نجعل التسجيلات في فترات من 60 ثانية GFP.
في بعض الحالات قد تبدأ الأجنة المتداولخلال ذلك الوقت من تسجيل الفيديو. ولذلك، فإننا نلقي نظرة مرة واحدة في حين لاخر على تسجيل من أجل وقف والبدء من جديد إذا لزم الأمر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتظهر إطارات ممثل عن فيلم التي وصفت الخلايا أفكارك مع Annexin V، ويطلق عليها الخلايا الدبقية، الأديم الظاهر والضامة مع تليفون-cytGFP في الشكل 2. كل الإطار هو إسقاط 3 شرائح 2 ميكرومتر لكل منهما.
يتم وضع الجنين من مرحلة 15 بشكل صحيح تبين CNS الجنينية في الوسط مع الدبقية المسمى كذلك (ز). الضامة (M)، التي هي في معظمها خارج الجهاز العصبي المركزي، وتبين قوية التعبير GFP حشوية. وصفت الخلايا الأ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إزالة الخلايا أفكارك هي المرحلة الأخيرة الحاسمة من موت الخلايا المبرمج، وهو ديناميكية للغاية. لذا دراسات الوقت الحقيقي من عملية ذات أهمية قصوى. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يتيح رصد إزالة الخلايا أفكارك في العيش النامية أجنة ذبابة الفاكهة. في هذا الإجراء، يجب أن تكون وضعت اثنين من السكان من الخلايا باستخدام علامات محددة: الخلايا أفكارك والبالعات. مراسل تليفون-cytGFP هو مناسبة لرصد الضامة البلعمة، الدبقية والأديم الظاهر في وقت واحد في نفس الجنين، hich ث يج...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل كوري إعادة الإدماج منحة ماري (IRG249084). ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kurant.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Projects | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Projectes | L-7528 | |
| زيت الهالوكربون 700 | Sigma | H8898 | |
| < قوية > المواد < / قوية > | |||
| أنابيب شعرية | FHC | 30-30-0 | |
| مصفاة الخلية | SPL | 93100 | |
| فرشاة | |||
المراجع
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
