يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس آلام جلدية اللمس في نموذج الفئران التهاب البروستاتا الجرثومي

16.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50158

⸱

يناير 16, 2013

 ,  , 
1Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

قد عدوى في البروستاتا يكون عاملا مساعدا في التوسط في آلام الحوض التهاب البروستات المزمن. وصفنا الإجراء لإعداد اللقاح البكتيري موحدة، تقطير من البكتيريا في مجرى البول من الفئران الذكور ومنهجية لقياس آلام جلدية في الفئران عن طريق اللمس مع مرور الوقت.

الملخص

Uropathogenic الإشريكية القولونية (UPEC) هي مسببات الأمراض التي تلعب دورا هاما في التهابات المسالك البولية والتهاب البروستاتا الجرثومي 1. لقد أظهرنا مؤخرا أن UPEC دورا هاما في بدء الألم الحوضي المزمن 2، سمة من سمات التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / CPPS) 3،4. يمكن للعدوى في البروستاتا بواسطة UPEC ذات الصلة سريريا بدء وتأسيس الألم المزمن من خلال آليات التي قد تنطوي على تلف الأنسجة والشروع في آليات المناعة الذاتية 5.

وثمة تحد لفهم الآلية المرضية لUPEC في البروستاتا هو عدم إمكانية الوصول النسبي للغدة البروستاتا للتلاعب. تستخدم لدينا سبق وصفها طريقة العدوى داخل الاحليل 6 إلى تقديم سلالة من UPEC السريرية في الفئران الذكور تؤسس عدوى الصاعد من البروستاتا. هنا، نحن تصف بروتوكولات لدينا لتوحيد باcterial اللقاح 7 فضلا عن إجراء القسطرة لتخدير الفئران الذكور تقطير من البكتيريا.

ويتميز في المقام الأول CP / CPPS عن وجود آلام جلدية اللمس 4. واستند اختبار السلوك على مفهوم فرط التألم الجلدية الناجمة عن الألم الحشوي المشار 8-10. التركيز في الأنسجة الحشوية العصبي يقلل الألم الجلدي عتبات السماح للاستجابة للمؤثرات مبالغ فيها غير مؤلمة عادة (آلام جلدية). استخدام القوة الطبيعي أن الجلد نتيجة في الاستجابات الشاذة التي تميل إلى الزيادة مع شدة الألم الحشوي الأساسي. وصفنا المنهجية في NOD / ShiLtJ الفئران التي تستخدم الألياف فري فون لقياس آلام جلدية مع مرور الوقت عن طريق اللمس استجابة لعدوى البكتيريا واحدة مع UPEC.

البروتوكول

1. البكتيريا التحضير للتلقيح ماوس

يجب القيام بما يلي في ظل ظروف معقمة.

  1. تأخذ واحدة 17 × 100 ملم أنابيب البولي بروبلين مع قبعات وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام لوريا الطازجة (LB) مرق. نصائح باستخدام تعقيمها، واتخاذ بعض البكتيريا الجلسرين المجمدة الأسهم من سلالة CP1 2 و نقل كمية صغيرة من الثقافة في أنبوب يحتوي على سائل الإعلام LB. استبدال غطاء أنبوب الأوكسجين بحيث لا يزال قادرا على إدخال الأنبوب - الثقافة تحتاج إلى أن تنمو في الظروف الهوائية. أنبوب المكان عند 37 درجة مئوية في حاضنة في 220 دورة في الدقيقة تهتز بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي، نقل 5 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب جديد مع 3 مل سائل الإعلام LB وتنمو في ظل ظروف ثابتة في ليلة وضحاها في حاضنة C. ° 37
  3. في اليوم 3 نقل 40 ميكرولتر من الثقافة في أنبوب 50 مل AA يحتوي على 40 مل كل وسائل الإعلام LB. مكان بين عشية وضحاها في 37 ° C حاضنة ثابت.
  4. تشغيل أجهزة الطرد المركزي وتعيين لC. ° 4مرة واحدة وصلت درجة الحرارة الطرد المركزي النهائي، ونقل كل ثقافة 40 مل في أنبوب الطرد المركزي 40 مل Nalgene.
  5. وزن أنابيب الطرد المركزي لتحقيق التوازن - ضبط مستوى الصوت مع وسائل الاعلام LB حسب الحاجة. تدور أنابيب في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
  6. إزالة بعناية طاف بيليه وتعليق بلطف البكتيرية في 40 مل العقيمة PBS.
  7. كرر الخطوة 1.5 مع PBS.
  8. نضح قبالة طاف ووقف البكتيريا في PBS العقيمة 500 ميكرولتر. نقل الحل في أنبوب 1.5 مل microfuge. يستغرق 10 ميكرولتر من التعليق وتخفيف سنة 990 ميكرولتر من الجليد الباردة PBS. استخدام الطيف لقراءة OD 420 نانومتر لتحديد حجم اللازمة لتلقيح. لتحديد حجم مناسب من الجليد الباردة PBS تعليق بيليه في: خذ 420 نانومتر OD عدد (في مل) وطرح الحجم المقدر للالسابقين البكتيرية [بيليه. OD 420 نانومتر = 0،545، 0،075 بيليه تقريبا مل. 0،545 حتي 0،075 0،470 =].
  9. إزالة 10 ميكرولتر من التعليق البكتيرية وديالعود سنة 990 PBS الجليد الباردة ميكرولتر. قراءة OD 420 نانومتر. والهدف من ذلك هو تحقيق نانومتر 420 OD قيمة لتعليق مخفف من 1،000 ± 0،010. إذا كان عدد تخفيف الخاص بك هو أعلى من هذا الهدف، إضافة المزيد من الحجم إلى تعليق واتخاذ آخر القراءة. إذا كان الرقم أقل من 0.990 تدور ثم أسفل التعليق وتكرار القراءة OD 420 نانومتر حتى الحصول على القراءة المطلوبة.

2. عدوى الحيوان

تم شراء الفئران (5 إلى 7 أسابيع من العمر، وعشرة في كل مجموعة) من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME).

  1. الفئران هي تخدير عن طريق الاستنشاق من 1-4٪ isoflurane في غرفة زجاجي ويتم رصد حتى راقد.
  2. يتم أخذ الماوس واحد في وقت واحد لتقطير من البكتيريا عن طريق قسطرة مع البولي ايثيلين (PE10) قسطرة إبرة مثبتة في تعديل G 30 من حقنة هاميلتون الزجاج (طول 1،5-2،0 سم). يتم إدراج قسطرة لمحور الإبرة. الماوس هو PLACإد على سطحه الظهري تحت التخدير الحفاظ باستخدام مخروط الأنف.
  3. القضيب من الفأرة هو مقذوف من ضغط لطيف وكميات من مواد التشحيم ليبرالية على مسحات القطن يستخدم لتزييت مدخل مجرى البول القضيب.
  4. 10 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة هو عرض تحتوي على 1 × 10 8 البكتيريا إلى مجرى البول من الفئران تخدير بعد القسطرة.
  5. يتم الاحتفاظ الفئران في حالة تخدير لمدة 15 دقيقة في غرفة زجاجي بعد إدخال البكتيرية للسماح التصاق البكتيريا ومنع التبول على الفور.
  6. يتم وضع الفئران في أقفاص مرة أخرى ورصد للساعة ال 24 المقبلة.

3. اختبار السلوك

تم اختبار الفئران قبل الإصابة (خط الأساس) وعلى أيام 3 و 7 و 14 و 21 و 28 بعد الإصابة. تم اختبار فرط التألم المشار آلام جلدية واللمس باستخدام خيوط فري فون تطبيقها على البطن وص 11،12 أخمصيegion من مخلب هند 13. وكان perfomed اختبار في وقت محدد من اليوم، يعمل منهجية موحدة واحدة اختبار مجرب من جميع الحيوانات. واستخدم اختبار أعمى من مجموعات لمكافحة القيود المفروضة على السلوك القائم على اختبار الألم في النماذج الحيوانية. تم حساب طبقت خمس الفردية فون خيوط فراي مع قوات تبلغ 0.04، 0.16، 0.4، 1.0 و 4.0 غرام (Stoelting، الولايات المتحدة الأمريكية) في البطن وتكرار الردود الانسحاب.

  1. بعد فترة من التأقلم و 30 دقيقة، يتم وضع الفئران في غرف فردية زجاجي (6 × 10 سم X12) المحرز في منزل مع الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة الطابق السلك.
  2. تم اختبار فرط التألم المشار آلام جلدية واللمس باستخدام الخمسة فون خيوط فراي. تم تطبيق كل خيوط لثانية 1-2 مع فاصل زمني بين التحفيز من 5 ثوانى للمرة 10 المجموع، تم اختبار والشعر بترتيب تصاعدي القوة.
  3. يتم تطبيق كل خيوط لمنطقة أسفل البطن في المنطقة المحيطة في البروستاتا وكان هناك حرص على تحفيز مناطق مختلفة داخل هذه المنطقة لتجنب الحساسية أو "يختتم" الآثار. تم تطبيق النظام في زيادة خيوط القوة لفترات ثانية 1-2 مع لا يقل عن 5 ثوانى بين التحفيز ليصبح المجموع 10 مرات.
  4. وتعتبر ثلاثة أنواع من السلوك ردا ايجابيا على تحفيز خيوط: 1) تراجع حاد في البطن. 2) لعق أو الخدش الفوري للمنطقة من التحفيز خيوط، 3) القفز.
  5. تم حساب تواتر استجابة بأنه النسبة المئوية للاستجابة الإيجابية (من أصل 10، على سبيل المثال 5 ردود 10٪ 50 =) وأفيد البيانات في نسبة متوسط ​​تردد استجابة ± SE
  6. يتم استبعاد الحيوانات مع أكثر من 25 ردود إيجابية من إجمالي خط الأساس للدراسة.
  7. تم اختبار اللمس آلام جلدية على المنطقة الأخمصية للهند مخلب باستخدام خيوط فري فون مع قوات تبلغ 0.04، 0.16، 0.4، 1.0 و ز 4.0. تم تقييم متوسط ​​عتبة انسحاب 50٪ (5) باستخدام أعلى إلى أسفلتطبيق طريقة الاختبار حيث بدأت خيوط مع 0،04 ز عموديا على السطح الأخمصي للهند مخلب حتى خيوط تميل قليلا. تم اختبار خيوط بترتيب تصاعدي حتى لوحظ وجود استجابة إيجابية. وعرف استجابة إيجابية للخيوط والانسحاب إما حادة أو مخلب من لعق مخلب من الاختبار. عندما تم تسجيل استجابة إيجابية تم تطبيق خيوط أضعف المقبل، وإذا لوحظ وجود استجابة سلبية، ثم تم تطبيق خيوط أقوى المقبل.
  8. تم استعراض التجارب والمنهجية الموصوفة والتي وافقت عليها جامعة الحيوانية نورث وسترن الرعاية واستخدام اللجنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

درسنا NOD / ShiLtj وC57BL/6J ذكور الفئران لوجود الألم المزمن على عدوى بكتيرية. وتغرس الفئران الذكور (5 إلى 7 أسابيع من العمر) بمحلول ملحي أو البكتيريا في مجرى البول (الشكل 1). أدى التحفيز الميكانيكي للمنطقة الحوض مع خيوط فري فون من الفئران C57BL/6J المالحة وغرست UPEC الفئران المصابة C57BL/6J تردد في الاستجابة التي لم تتغير خلال مدة 28 يوما من التجربة (الشكل 1). في المقابل، أظهرت الفئران المصابة NOD UPEC الردود على تحفيز الحوض التي كانت أكبر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التهاب في البروستاتا مع الماوس UPEC يسمح للفي النمذجة الجسم الحي من الأحداث التي قد تكون لهم علاقة في التسبب في التهاب البروستاتا الجرثومي، CP / CPPS أو كحدث المهيئة في الالتهابات المزمنة. الأساليب المذكورة لإعداد البكتيرية وتقطير التعادل على مجموعة كبيرة من المؤلفات حول نماذج UPEC في التهاب المسالك البولية الإناث 7،14. نموذج له تطبيق واسع لدراسة المرضية، واختبار اللقاحات المرشحة المحتملة وآليات التشكيل المناعي. القدرة على تتبع السلوك الألم بطريقة قابل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث من قبل منحة 1K01DK079019A2 (PT) من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
ثقافة أنابيب BD الصقر 352059
LB مرق ميلر EMD EM1.10285.0500
أنابيب الطرد المركزي Nalgene الحرارية 3118-0050
Isoflurane بتلر شين NDC 11695-6776-1
قسطرة إبرة 30G هاميلتون 91030
PE10 أنابيب BD intramedic 427400
فري فون الشعيرات Stoelting 58025-31

المراجع

  1. Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
  2. Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
  3. Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
  4. Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
  5. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  6. Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
  7. Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
  8. Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102(2011).
  9. Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232(2009).
  10. Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
  11. Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
  12. Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
  13. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  14. Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
  15. Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
  16. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  17. Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
  18. Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بكتيريا الإشريكية القولونية المسببة لالتهابات المسالك البوليةخيوط فون فرايألم الحوضفرط التألم المنقولالعدوى داخل الإحليلتقنية القسطرةاختبار سلوك الألم
قياس آلام جلدية اللمس في نموذج الفئران التهاب البروستاتا الجرثومي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.