مقالة منهجية

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

DOI:

10.3791/50159

⸱

يوليو 11, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت أبحاث البروتينات تعقيد رائعة من proteomes حقيقية النواة بالتفصيل لم يسبق لها مثيل. وهو الآن فكرة مقبولة عموما أن البروتينات في خلايا موجودة في الغالب لا ككيانات منعزلة، بل ممارسة النشاط البيولوجي في الجمعية مع العديد من البروتينات الأخرى، في البشر عشرة أو أكثر، وتشكيل خطوط التجميع في الخلية لمعظم إن لم يكن جميع الوظائف الحيوية. 1 ، يتطلب 2 معارف وظيفة والهندسة المعمارية لهذه الجمعيات multiprotein تقديمها في الجودة والكمية كافية لتحليل مفصل. قلة من العديد من مجمعات البروتين في الخلايا، ولا سيما في حقيقيات النوى، ويحظر استخراجها من مصادر الأم، ويتطلب إنتاج المؤتلف. وقد ثبت التعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) أن يكون مفيدا بشكل خاص لإنتاج بروتينات حقيقية النواة، النشاط الذي عادة ما يعتمد على معالجة ما بعد متعدية التي غالبا ما يمكن لنظم التعبير الأخرى المستخدمة بشكل شائعلا يدعم. 3 BEVS استخدام باكولوفيروس المؤتلف في التي تم إدراج الجينات في المصالح لتصيب مزارع الخلايا الحشرات التي بدورها تنتج البروتين في الاختيار. MultiBac هو BEVS التي تم مصممة بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة التي تحتوي على العديد من الوحدات الصغرى. 4 شرط أساسي وحيوي لكفاءة الإنتاج من البروتينات والمجمعات هم بروتوكولات قوية لجميع الخطوات المتبعة في تجربة تعبير مثالي يمكن تنفيذها في إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) ويليه أيضا من قبل المستخدمين غير المتخصصين مع سهولة نسبية. منصة MultiBac في مختبر علم الأحياء الجزيئي الأوروبي (EMBL) يستخدم إجراءات العمل الموحدة لجميع الخطوات المتبعة في تجربة التعبير معقدة multiprotein، بدءا من الإدراج من الجينات إلى الجينوم baculoviral هندسيا الأمثل لخصائص إنتاج البروتين مغايرة للتحليل على نطاق صغير من البروتين العينات المنتجة. 5-8 المنصةيتم تثبيت في وضع الوصول مفتوحة في EMBL غرونوبل، ودعمت العديد من العلماء من الأوساط الأكاديمية والصناعة لتسريع المشاريع البحثية المعقدة البروتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم النشاط البيولوجي من قبل جمعيات البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي تعمل في تناسق لتحفيز الوظائف الخلوية. ومن بين الأمثلة البارزة للآلية التي المحاضر المعلومات الوراثية الموجودة في الحمض النووي RNA إلى رسول. في البشر، وأكثر من 100 البروتينات معا في عملية تحديد وتنظيم لنسخ الجينات، وتشكيل المجمعات multiprotein كبيرة مع 10 وأكثر الوحدات الصغرى بما في ذلك الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة مثل TFIID، TFIIH وغيرها. 9 أمثلة أخرى هي الريبوسوم، تتكون من العديد من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي، وهذا يحفز تخليق البروتين، أو مجمع المسام النووية التي هي المسؤولة عن رحلات مكوكية الجزيئات الحيوية من خلال الغلاف النووي في حقيقيات النوى. A تشريح المعمارية والكيميائية الحيوية مفصل أساسا كافة الأجهزة المتعددة المكونات في الخلية هو أمر حيوي لفهم وظيفتها. استجلاء بنية بدائية النواة وeukarريبوسوم yotic، على سبيل المثال، شكلت الأحداث السمة المميزة الرضوخ البصيرة لم يسبق لها مثيل في كيفية هذه الآلات الجزيئات الاضطلاع بوظائفها المحددة لها في الخلية. 10،11

ويمكن الحصول على ريبوسوم في نوعية وكمية كافية لدراسة مفصلة من قبل تنقية المواد الذاتية من الخلايا المستزرعة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ما يصل إلى 30٪ من كتلة الخلوية تتكون من الريبوسومات. الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني هو بالفعل أقل وفرة من حيث الحجم، والعديد من ألف لتر من الخميرة الثقافة كان لا بد من معالجتها للحصول على عرض مفصل الذرية من هذا المجمع الأساسية المركزية لنسخ 12 والغالبية العظمى من المجمعات الأساسية الأخرى هي إلا موجودة في كميات أقل من ذلك بكثير في الخلايا الأم، وبالتالي لا يمكن تنقيته بشكل كاف من مصدر المواد الأصلية. لتقديم مثل هذه المجمعات في متناول التحليل البنيوي والوظيفي مفصلة يتطلب إنتاج مغاير باستخدام المؤتلف الشركة المصرية للاتصالاتchniques.

كان إنتاج البروتين المؤتلف لها تأثير كبير على بحوث علوم الحياة. تم إنتاج العديد من البروتينات recombinantly، وهيكلها وظيفة تشريح بدقة عالية. وقد اتخذت برامج الجينوميات الهيكلية الاستفادة من توضيح من الجينوم للعديد من الكائنات الحية لمعالجة ذخيرة منتج الجين من الكائنات بأكملها في وضع الإنتاجية العالية (HT). وهكذا فقد تم تحديد الآلاف من هياكل البروتين. حتى الآن، كان النظام الأكثر استخداما بغزارة لإنتاج البروتين المؤتلف E. وقد وضعت القولونية، وكثير من النظم التعبير وصقلها على مر السنين لإنتاج مغاير في هذا المضيف. البلازميدات بإيواء عدد كبير من الوظائف لتمكين إنتاج البروتين في E. القولونية ملء كتالوجات كامل من مقدمي الخدمات التجارية.

ومع ذلك، E. القولونية ديه بعض القيود التي تجعل من غير مناسبة لإنتاج العديد من البروتينات وحقيقية النواة في عمجمعات البروتين مفصلي مع العديد من الوحدات الصغرى. ولذلك، أصبح إنتاج البروتين في المضيفين حقيقية النواة على نحو متزايد الأسلوب المفضل في السنوات الأخيرة. A مناسبة بصفة خاصة نظام لإنتاج بروتينات حقيقية النواة هو تعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) التي تعتمد على باكولوفيروس المؤتلف تحمل الجينات مغاير لتصيب مزارع الخلايا الحشرات المزروعة في المختبر. نظام MultiBac هو BEVS وضعت في الآونة الأخيرة والتي يتم تفصيلها بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة مع العديد من الوحدات الصغرى (الشكل 1). وقدم MultiBac الأولى في عام 2004. 13 منذ إطلاقها، وقد MultiBac تم صقلها باستمرار، ومبطنة تيار لتبسيط التعامل مع، وتحسين نوعية الهدف البروتين، وجعل النظام عموما الوصول إلى المستخدمين غير المتخصصين من خلال تصميم إجراءات التشغيل القياسية كفاءة (إجراءات العمل الموحدة). وقد تم تنفيذ 4 MultiBac في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم، في ميلانademia والصناعة. في EMBL في غرونوبل، وضعت برامج الوصول عبر الوطنية في المكان من قبل المفوضية الأوروبية لتوفير التدريب الخبير في منصة MultiBac للعلماء الذين يرغبون في استخدام هذا النظام لدفع عجلة الإنتاج أبحاثهم. تم توضيح بنية ووظيفة عدة مجمعات البروتين التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها باستخدام عينات المنتجة مع MultiBac. 4 في ما يلي، وتتلخص الخطوات الأساسية لإنتاج MultiBac في البروتوكولات كما هي الحال في عملية في منشأة MultiBac في EMBL غرونوبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جنبا إلى جنب Recombineering (TR) لإنشاء بنيات التعبير متعددة الجينات

  1. التخطيط لاستراتيجية شاركت في التعبير. أسلوب التصميم لإدخال الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة والموافقون. ينبغي تجميع الوحدات الفرعية الفسيولوجية المحتملة للمجمع الخاص معا على الموافقون وجهات مانحة محددة. استخدام وحدة الضرب تتكون من نوكلياز داخلية الزاجل (HE) - أزواج BstXI على الجمع بين أشرطة الكاسيت التعبير على المانحة الفردية والبلازميدات القابل 7،8 إنشاء كافة البنى ذات الصلة في سيليكون والتحقق من صحة استراتيجية جيدا قبل الشروع في العمل التجريبي. على سبيل المثال، يجب فحص الجينات في المصالح لا يحتوي على سعادة أو تقييد مواقع أخرى ووجود الصحيح إطارات القراءة المفتوحة (ORFS) ينبغي التحقق من صحتها. تنظر في طلب الجينات الاصطناعية الأمثل لمكافحة الحشرات استخدام كودون الخلايا وهيكلها الثانوي مرنا لتحسين مستويات إنتاج البروتين وكذلك إزالة أي EXIاللدغة سعادة المواقع من الجينات في المصالح. النظر في وضع الكلمات تنقية استنادا إلى بيانات من الأدبيات حول N-أو مرنة أو يتعرض C-مصطلحات من البروتينات التي تختارها. النظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein التي تهدف إلى إنتاج عدة مفارز البروتين في مجمع الخاص بك إذا المبالغ النسبية للبروتينات الفردية تحتاج إلى رقابة بسبب قضايا رياضيات الكيمياء في المجمع. 4 إعداد مفصلة "كيف ل" وثيقة (ينصح الكتاب مختبر الإلكترونية) التي تحتوي على جميع الخطوات التجريبية المتوقعة من المشروع المؤدية إلى بناء متعددة الجينات كاملة (ق). إنشاء ملفات إلكترونية من البلازميدات جنة المساواة العرقية، LoxP تنصهر على سبيل المثال باستخدام برنامج جنة المساواة العرقية، ACEMBLER والتي يمكن تحميلها من الصفحة الرئيسية لمجموعة بيرجر ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / لجنة المساواة العرقية-acembler ).
  2. إدراج الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة مختارة ويقبلون باستخدام إنزيمات التقييد ويغاز، أو، بدلا من ذلك، باستخدام أساليب مستقلة ربط البروتوكولات نشرت بعد. 5،6،14 إذا كان لديك الوصول إلى مناولة السائل محطة العمل، وإذا كنت تخطط لعدد كبير من بنيات إلى أن تتولد ( على سبيل المثال لنهج اندماجي) النظر في استخدام الروبوتات البرامج النصية وضعها وتنفيذها من قبل مجموعة بيرجر (الشكل 2). 14،15 إذا كان التعامل مع السائل محطة العمل غير متوفرة، التشغيل اليدوي باستخدام أطباق التلازن يسمح الإدراج الجينات في HT مثل الموضة.
  3. القيود التي تفرضها الحاجة إلى السيطرة على حساب العناصر المتفاعلة من مفارز أعربت قد تتحقق. في حالة stoichiometrically مستويات التعبير متوازن من مفارز الفردية للبروتين معقد، والنظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein إلى فستؤدي عدة مفارز من مجمع الخاص والبروتيني محددة (على سبيل المثال التبغ حفر فيروس زين البروتيني) في ORFS واحدة كبيرة متباعدة من قبل قمواقع بروتين pecific. 4،8 النظر المشترك، معربا عن polyproteins واحد أو عدة أشرطة مع تعبير واحد إذا كان لديك مجمع كبير جدا مع العديد من مفارز وتتراوح الأوزان الجزيئية على نطاق واسع من مفارز الفردية. تنظر شارك في التعبير عن العديد من الجينات التي تكود لنفس البروتين في polyprotein أو عن العديد من أشرطة الكاسيت التعبير متطابقة إذا كان متميزا بطابع أن البروتين منخفض العائد الإنتاج. 4،13
  4. التحقق من صحة كافة بنيات المانحة ومتقبل المستنسخة عن طريق تعيين قيود (اختياريا في الإنتاجية العالية) والتسلسل. انتقل إلى دمج مجموعات المانحين ومتقبل من قبل لجنة المساواة العرقية-LoxP إعادة التركيب لتوليد بنيات التعبير متعددة الجينات من خيار. التحقق من صحة تنقية البلازميدات الانصهار القابل الجهات المانحة عن طريق تعيين تقييد، استخدام تسلسل الإلكترونية التي أنشأتها لجنة المساواة العرقية-ACEMBLER أو برامج مماثلة كمرجع.
  5. تخزين المانحون تنقيته والتحقق من صحتها، يقبلون اندماج المانحين ومتقبل في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. الأرشيف ررasmids وتسلسلها (مايكروسوفت إكسل، فايل ميكر، وغيرهم) بعناية للاستخدام في وقت لاحق.

2. مركب الجيل الفيروسة العصوية متعددة الجينات، والتضخيم، والتخزين

  1. دمج نواقل نقل متعددة الجينات في الجينوم baculoviral MultiBac بواسطة تحويل الى DH10 الخلايا إيواء الجينوم الفيروسي وظائف مطلوبة من أجل Tn7 تبديل. لاحظ أن الجينوم baculoviral Multibac يمكن تحميلها مسبقا مع جينات معينة من الفائدة (YFP علامة، المحرمين، الخ) في موقعها LoxP الخاصة (هندسيا في جينوم البعيدة إلى موقع المرفق Tn7) من قبل لجنة المساواة العرقية في الجسم الحي رد الفعل الذي يسبق Tn7 التكامل. 13 بعد Tn7 والتحول، ويتم اختيار الخلايا مع الفيروسة العصوية مركب يحتوي على جينات من الاهتمام من خلال فحص أزرق / أبيض (الناجحة Tn7 النتائج تبديل في فقدان α-تكامل من β-غالاكتوزيداز، وبالتالي، مع المستعمرات الصحيح Tn7 تبديل تبقى بيضاء على انتقائية علىلوحات غار تحتوي على X-غال) والجينوم هو أعدته تحلل القلوية والايثانول / هطول الأيزوبروبانول. 5،6
  2. ترنسفكأيشن وإنتاج فيروس الأولي. مكان 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة في غطاء العقيمة. من مراحل سجل Sf21 الحشرات خلية ثقافة، والبذور من aliquots من الخلايا في الآبار وبالنقل عن طريق إضافة الجينوم baculoviral تنقيته وكاشف ترنسفكأيشن مختلطة في وسائل الإعلام والثقافة كما هو موضح. 6 الحصاد فيروس الأولي بعد 48-60 ساعة عن طريق إزالة وسائل الإعلام ( جودة عالية، وانخفاض عيار الفيروس V 0، عادة 3 مل لكل بئر). تكملة وسائل الإعلام الجديدة، واختبار لإنتاج البروتين (وإذا كان موجود علامة YFP، لمضان) بعد 2-3 أيام إضافية. 6،7
  3. التضخيم من الفيروس، وانخفاض وزارة الداخلية نظام. استخدام V 0 الفيروس لنقل العدوى 25-50 مل من الخلايا في مرحلة السجل (كثافة الخلية <1X10 6 خلايا لكل مل) في الصغيرة (100-250 مل) مخروطي شاكر قوارير المهتاجعلى الهزازات منصة مدارية (الشكل 3). عد الخلايا وتقسيم كل ساعة 24 حتى تتوقف الخلايا عن مضاعفة (اعتقال الانتشار). وأضاف خلايا يجب مضاعفة (على الأقل) مرة واحدة (وزارة الداخلية <1)، وإلا تكرار التجربة مع حجم أصغر من V 0: اتباع نظام منخفضة وزارة الداخلية (تعدد عدوى أي عدد جزيئات الفيروس في الخلية). عادة، يتم استخدام 3 مل من V 0 لتصيب 25 مل من Sf21 خلايا الحشرات في مناطق ذات كثافة من 0.5x10 6 خلية / مل. وهذا أمر ضروري لمنع ضار على التضخيم والسيارات حذف الفيروس الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجينات مغاير من الفائدة. الحصاد V 1 فيروس (25-50 مل) بعد 48-60 ساعة من قبل التكوير الخلايا وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. تكملة مع وسائل الإعلام الجديدة واختبار لYFP وإنتاج البروتين عن طريق إزالة الخلايا 6 1X10 كل 12 أو 24 ساعة، التكوير والتحقق من صحة إنتاج البروتين والبروتين علامة (YFP) إشارة. 6، أسهب فيروس (إلىV 2) مرة أخرى إذا وتهدف كميات أكبر في التعبير عن طريق إصابة ما يصل الى 400 مل الخلايا في 2 L شاكر قوارير مع V 1 فيروس احترام فوق أدنى مستوى وزارة الداخلية نظام (خلايا يجب مضاعفة مرة واحدة على الأقل بعد الإصابة مع V 1). اختبار صارم إنتاج البروتين والبروتين إشارة علامة خلال التضخيم لتجنب تراكم الفيروسات معيبة لم تعد تحتوي على الجينات الخاصة بك من الفائدة. 5-7 استخدام الكريات الخلية تتراكم في كل خطوة التكبير بالفعل لإقامة بروتوكولات تنقية للمجمع البروتين المعبر عنه من الفائدة.
  4. تخزين BIIC من فيروس الإنتاج. ونحن نوصي بشدة لتخزين V 2 فيروس مثل فيروس الإنتاج باستخدام BIIC (B-I aculovirus nfected أنا nsect ج ells) طريقة، لمنع تعديلات (على سبيل المثال فقدان الجينات في المصالح) من الفيروس المؤتلف والحفاظ على التعبير عالية مستوىق 16 بيليه الخلايا المصابة لوحظ 24 ساعة بعد إلقاء القبض الانتشار - في هذه المرحلة خلايا تحتوي على جزيئات فيروسية كاملة قبل أن يتم الإفراج عنهم (عن طريق الناشئين) في وسائل الإعلام. إزالة وسائل الاعلام ومأخوذة تجميد الخلية بيليه في النيتروجين السائل وتخزينه إلى أجل غير مسمى. 7،16

3. إنتاج البروتين والتجهيز النهائي

  1. اصابة (ص) الثقافات كبيرة والرصد YFP. استخدام V 1، V 2 أو مأخوذة BIIC المجمدة لتصيب مزارع الخلايا أكبر للأشواط الإنتاج (عادة 400 مل في 2 L قوارير). الانضمام إلى الأقل زارة الداخلية نظام (ضبط حجم الفيروس المستخدمة للعدوى مثل تلك الثقافة المصابة الزوجي مرة واحدة على الأقل). تكبير حجم ثقافة المصابة إذا لزم الأمر عن طريق ضرب عدد من قوارير. إذا البروتين علامة YFP هو الحاضر، سحب على فترات 1X10 6 خلايا محددة، بيليه وليز الخلايا ورصد تطور إشارة YFP حتى يتم التوصل إلى هضبة دائرة الهجرة والجنسيةicating أقصى إنتاج البروتين المؤتلف. ويمكن قياس مستويات YFP في مستوى جيد 96 قارئ لوحة قادرة على تسجيل إشارات مضان (على سبيل المثال TECAN SPECTRAFluor). حصاد الخلايا في هذه المرحلة. الكريات خلية تخزينها في -20 درجة مئوية (قصيرة الأجل) أو -80 ° C (طويل الأجل).
  2. تحلل الخلايا وتجزئة. ليز الخلايا عن طريق الأسلوب المفضل لديك من خيار، مصممة خصيصا لمتطلبات البروتين الخاص (تجميد ذوبان الجليد، صوتنة، الصحافة الفرنسية، وغيرهم). 5-7 العصارة الخلوية يجزئ ونوى واختبار لوجود البروتينات اهتمامك. وضع بروتوكولات تنقية استنادا إلى نتائج لتبسيط تنقية البروتين. النظر في تطبيق إجراءات تمرغ لاستخراج البروتين الخاص بك من الكسر النووية في ظل ظروف بوكل عالية إذا البروتينات الخاصة بك الموجودة في النواة. 7،18
  3. تنقية البروتين (الصغيرة الحجم، وعلى نطاق واسع). لاحظ أن كميات صغيرة في كثير من الأحيان (10 أو 25 مل) من زراعة الخلايا هي سوfficient للحصول على الكريات خلية لتنقية كميات كبيرة من البروتينات اهتمامك نظرا لارتفاع مستويات الإنتاج عادة أو عالية جدا من البروتينات مغايرة في نظم خلايا الفيروسة العصوية / حشرة (غالبا 10-100 ملغ من البروتين لكل L ثقافة وأكثر من ذلك). بالتزامن مع الدقيقة تنقية (لوحات multiwell، طرق microtip، GE للرعاية الصحية نظام ÄKTAmicro، وغيرهم) فمن الممكن الحصول على بيانات البيوكيميائية والنشاط وغالبا أيضا كمية كافية من البروتينات والمجمعات المطلوب على نطاق ونانولتر تبلور عالية الإنتاجية (HTX ). النظر في استخدام المعادن تنقية تقارب (Clonetech تاكارا تالون، QIAGEN NiNTA معدنية راتنجات خالب) وبنسبة ضئيلة من الحامض الاميني (6-10 بقايا) علامة على مفارز المكشوفة من البروتين الخاص المعقدة لتسهيل تنقية، بالتزامن مع التبادل الأيوني وحجم الاستبعاد اللوني في الصغيرة وحدات التخزين باستخدام على سبيل المثال ÄKTAmicro أو صغيرة الحجم آلة مماثلة تنقية (الشكل 4 ). غيرها من خطوات تنقية تقارب وتبادل (IEX) الخطوات أيون بالإضافة إلى تنقية تقارب مع به بنسبة ضئيلة من الحامض الاميني أو العلامات الأخرى (الاختيار من ضريبة السلع والخدمات، MBP، CBP، وغيرهم) يمكن وينبغي النظر فيها، وفقا للخصائص الكيميائية الحيوية للبروتينات المصالح والتفضيلات الفردية. النظر في وضع علامات الوحيدات أكثر من واحد مع تقارب به لتعزيز كفاءة تنقية. تركز المجمعات البروتين النقي الخاص ووضع بروتوكولات تخزين مثل تجميد مع أو بدون الجلسرين. وضع معايير لمراقبة الجودة التي يمكن تطبيقها standardly (المقايسات النشاط، اختبارات الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية) لتقييم دفعة إلى دفعة الاختلاف من البروتينات الخاصة بك تنقيته.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض قوي شارك في التعبير عن البروتينات مغاير من قبل النظام MultiBac المحرز في 1D الشكل (تحقيقات أخذ 48 ساعة بعد اصابة ثقافة الخلية تعليق). نطاقات البروتين بإفراط (overexpressed) بشكل واضح ملحوظ في استخراج خلية كاملة (SNP) والمحللة تطهيرها (SN). نوعية وكمية من المواد إنتاج البروتين غالبا ما تكون كافية لتمكين تحديد هيكل مجمعات البروتين، مثل الإنقسامية نقطة تفتيش معقدة MCC هو مبين في الشكل 1E 17

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيديو الأداة الإضافية طلقات في الشكلين 2 و 3 توضيح العملية برمتها من جيل الروبوت بمساعدة من [كدنا] التعبير متعددة الجينات يبني كل وسيلة لإصابة مزارع الخلايا الحشرات لإنتاج البروتين. وقد تم تطوير الكواشف الجديدة (البلازميدات والفيروسات) والبروتوكولات قوية لتمكين خط أنابيب الاعتماد على إجراءات العمل الموحدة. وقد تم تنفيذ خط الانابيب بالكامل بوصفها تكنولوجيا منصة في EMBL في غرونوبل. وقد تم الوصول إلى منصة MultiBac من قبل العديد من العلماء من الأوساط ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IB هو المخترع على براءة اختراع وطلبات براءات الاختراع بالتفصيل أجزاء من التكنولوجيا وصفها هنا.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر كريستوف Bieniossek، سيمون Trowitzsch، دانيال فيتزجيرالد، يويشيرو تاكاجي، كريستيان Schaffitzel، تقول السيدة إيفون، تيموثي ريتشموند وجميع أعضاء سابقون وحاليون من المختبر بيرغر طلبا للمساعدة والمشورة. وكانت منصة MultiBac وتطوره والدعم السخي من قبل وكالات التمويل بما في ذلك المؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (SNSF)، ووكالة الوطني للبحوث (ANR) والمركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) والمفوضية الأوروبية (EC) في إطار برامج (FP) 6 و 7. يتم توفير الدعم من أجل الوصول عبر الوطنية من مشاريع FP7 EC-P CUBE ( www.p-cube.eu ) وBioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). واعترفت وزارة الفرنسية للعلوم وخاصة لدعم منصة MultiBac في EMBL من خلال INVESTISSEMENT D'أفينير مشروع FRISBI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bluo-GalInvitrogen15519-028 (1 جم) Tetracycline
EuromedexUT2965-B (25 جم)1,000X عند 10 مجم / مل
KanamycineEuromedexEU0420 (25 جم)1,000X عند 50 مجم / مل
GentamycineSIGMAG3632 (5 جم)1,000X عند 10 مجم / مل
IPTGEuromedexEU0008-B (5 جم)1,000X عند 1 متر
Cre-recombinaseNew England BioLabsM0298
X-Treme GENE كاشف التعداء HPRoche06 366 236 001
Hyclone SFM4 InsectThermo ScientificSH 30913.02
6 آبار لوحة فالكوندومينيك دوتشر353046
2 مل ماصة فالكوندومينيك دوتشر357507
5 مل ماصة فالكوندومينيك دوتشر357543
10 مل ماصة فالكوندومينيك دوتشر357551
25 مل ماصة فالكوندومينيك دوتشر357535
50 مل ماصة فالكوندومينيك دوتشر357550
أنبوب 50 مل فالكوندومينيك دوتشر352070
أنبوب 15 مل فالكوندومينيك دوتشر352096
1.8 مل نانتدومينيك دوتشر55005
100 مل قوارير شاكر بايريكسدومينيك دوتشر211917
250 مل قوارير شاكر بايريكسدومينيك دوتشر211918
500 مل قوارير شاكر بايريكسدومينيك دوتشر211919
2 لتر قوارير شاكر بايريكسدومينيك دوتشر211921
Certomat Orbital Shaker + هضبةSartorius4445110 ، خزان النيتروجين السائل 4445233
ديوار 35 لترخزانة السلامة البيولوجية فيشر ScientificM76801
أسرعمجهر بصري SodiproFASV20000606
Zeiss451207
خلايا
الحشرات Sf21خلايا الحشرات Hi5InvitrogenB855-02
Tecan freedom EVO تعمل بتشغيل Evoware plusTECAN
10 & mu ؛ ل نصائح موصلة (أسود) ،TECAN10 612 516
200 & ل نصائح موصلة (أسود)TECAN10 612 510
حوض يمكن التخلص منه للكواشف ، 100 ملTECAN10 613 049
twin.tec PCR لوحة 96 ، حوافEppendorf0030 128.648
96 قاع بئر V ،صقر BD
96 لون لوحة عميقة طبيعي ، PP)فيشرM3752M
PS ، 96 بئر قاع مسطحGreiner655101
96 لوحة ديبويل حراري علميAB-0932
24 كتلة بئر RBQiagen19583
DpnI إنزيم تقييدNEBR0176L20 U / uL
NEBuffer 4 10XNEBB7004S
2X phusion mastermix HFFinnzymeالمرجع F-531L
2X phusion mastermix GCFinnzymeالمرجع F-532L
DGLB 1.5Xمحلي الصنع7.5٪ جلسرين ، 0.031٪ بروموفينول أزرق ، 0.031٪ زيلين سيانول FF
سلم كتلة الحمض النووي العالي للهلام الإلكترونيتقنيات الحياة10496-016
كتلة الحمض النووي المنخفض للهلامتقنيات الحياة10068-013
هلام إلكتروني 48 1٪ agarose GPLife TechnologiesG8008-01
مجموعة البلازميد Nucleo Spin- robot-96Macherey Nagel740 708.24
طقم تنظيف PCR ، Nucleospin Robot-96 ExtractMacherey Nagel740 707.2
Gotaq green master mixPromegaM7113
T4 DNA polymerase ،Novagen70099-3
DTT 100 mMالمؤهل
اليوريا 2 مEDTA محلي الصنع
500 ملم درجة الحموضة 8.0محلي الصنع
(ميلر) 500 جمأثينا ES103
غير معقم 353263 صفيحة سلم الإلكتروني من LIC مرق LB

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  2. Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
  3. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  4. Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
  5. Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  6. Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20(2008).
  7. Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
  8. Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
  9. Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
  10. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
  11. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
  12. Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
  13. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
  14. Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  15. Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
  16. Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
  17. Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
  18. Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MultiBac Baculovirus

مقالات ذات صلة