يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

30.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50168

⸱

أكتوبر 14, 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

في هذه المقالة

ملخص

معدل نمو الخلايا هو عملية تنظيم والمحددات الأساسية لعلم وظائف الأعضاء الخلية. زراعة المستمر باستخدام الكيموستات يمكن السيطرة خارجي من معدل نمو الخلايا بالتقادم المغذيات تسهيل دراسة الشبكات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وكيف تتطور هذه الشبكات لتحسين نمو الخلايا.

الملخص

خلايا تنظيم معدل نموها في استجابة لإشارات من العالم الخارجي. مع نمو الخلية والعمليات الخلوية المختلفة يجب أن تكون منسقة بما في ذلك تجميع الجزيئات، والتمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، والالتزام دورة انقسام الخلية. وناظم كيميائي، وهي طريقة للسيطرة على تجريبيا معدل نمو الخلايا، ويوفر وسيلة قوية لدراسة منهجية كيفية تأثير معدل نمو العمليات الخلوية - بما في ذلك التعبير الجيني والتمثيل الغذائي - والشبكات التنظيمية التي تتحكم في معدل نمو الخلايا. عندما يحتفظ به لمئات من الأجيال الكيموستات يمكن استخدامها لدراسة تطور التكيف من الميكروبات في الظروف البيئية التي تحد من نمو الخلايا. وصفنا مبدأ ناظم كيميائي الثقافات، وإظهار عملها وتقديم أمثلة من التطبيقات المختلفة. بعد فترة من الاهمال بعد بدء العمل بها في منتصف القرن العشرين، تلاقي المنهجيات الجينوم على نطاق ومع تجدد فيterest في تنظيم نمو الخلايا والأساس الجزيئي للتطور التكيف هو تحفيز نهضة في استخدام الكيموستات في الأبحاث البيولوجية.

المقدمة

وينظم نمو الخلايا من خلال شبكات معقدة من التفاعل عوامل وراثية وبيئية 1،2. تنظيم سياقاتها من نمو الخلايا يتطلب نهجا على مستوى النظام لدراستها. ومع ذلك، يتم الطعن في دراسة دقيقة من نمو الخلايا ينظمها صعوبة السيطرة تجريبيا المعدل الذي تنمو الخلايا. علاوة على ذلك، حتى في أبسط التجارب الظروف خارج الخلية هي في كثير من الأحيان ديناميكية ومعقدة كخلايا تغيير بيئتهم بشكل مستمر لأنها تتكاثر. يتم توفير حل لهذه المشاكل من قبل ناظم كيميائي: وسيلة لزرع الخلايا التي يمكن السيطرة التجريبية من معدلات نمو الخلايا في بيئات محددة، ثابتة والسيطرة عليها.

طريقة زراعة المستمر باستخدام ناظم كيميائي وصفت بشكل مستقل من قبل مونود 3 و 4 نوفيك وزيلارد في عام 1950. كما تصور في الأصل، وتزرع الخلايا في حجم ثابت من وسائل الإعلام وهذا هو يخدعالمخفف tinually بإضافة وسائل الإعلام الجديدة وإزالة في وقت واحد من وسائل الإعلام القديمة والخلايا (الشكل 1). إلى جانب المعادلات التفاضلية العادية (الشكل 2) وصف معدل التغير في كثافة الخلية (س) وتركيز المغذيات منظم النمو (ق) في السفينة ناظم كيميائي. الأهم من ذلك، هذا النظام من المعادلات تتنبأ واحد (صفرية) مستقرة ثابتة للدولة (الشكل 3) مع ضمنا ملحوظا أنه في الحالة المستقرة، ومعدل نمو محدد من الخلايا (أي ثابت معدل النمو الأسي) يساوي معدل الذي يتم تخفيفه ثقافة (D). من خلال تغيير معدل التخفيف من الممكن لإقامة السكان المطرد للدولة من الخلايا في معدلات نمو مختلفة وتحت ظروف مختلفة من قيود المغذيات.

كانت السيطرة التجريبية من معدل النمو باستخدام الكيموستات حاسمة لتطوير فهم كيف يمكن للتغييرات فسيولوجية الخليةمع معدلات النمو 5،6. ومع ذلك، أصبح هذا دعامة السابق الأساليب الميكروبيولوجية غامضة بشكل متزايد خلال انفجار في البحوث البيولوجيا الجزيئية في أواخر القرن العشرين. اليوم، تجدد الاهتمام في السيطرة النمو في كل من الميكروبات والكائنات الحية متعددة الخلايا وظهور أساليب الجينوم على نطاق وللتحليل على مستوى النظم جددت الدافع لاستخدام الكيموستات. هنا، نحن تصف ثلاثة التطبيقات التي تستفيد من مراقبة دقيقة لمعدلات نمو الخلية والبيئة الخارجية التي من الممكن فريد باستخدام الكيموستات. أولا، نحن تصف استخدام الكيموستات إلى التحقيق في كيفية وفرة الآلاف من الجزيئات الحيوية - وينظم coordinately مع معدل النمو - مثل النصوص ونواتج الأيض. الثاني، نحن تصف كيف يمكن استخدام الكيموستات للحصول على تقديرات دقيقة للاختلافات معدل النمو بين الأنماط الجينية المختلفة في بيئات محدودة المغذيات باستخدام التجارب المنافسة. الثالث، ونحن تصف كيفية الكيموستات يمكنأن تستخدم لدراسة التطور على التكيف من خلايا تنمو في بيئات فقيرة بالمغذيات ثابتة. هذه الأمثلة أمثلة الطرق التي الكيموستات يتم تمكين التحقيقات على مستوى نظم تنظيم نمو الخلايا، الجين عن طريق تفاعلات البيئة والتطور على التكيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لا يمكن أن تتحقق مبدأ زراعة المستمر باستخدام ناظم كيميائي في مجموعة متنوعة من التطبيقات. في جميع الكيموستات فمن الضروري أن يكون 1) وسائل للحفاظ على عقم جميع المكونات، 2) ثقافة مختلطة جيدا، 3) التهوية المناسبة للسفينة الثقافة و 4) وسيلة يمكن الاعتماد عليها من وسائل الإعلام بالإضافة إلى إزالة والثقافة. هنا، نحن تصف استخدام مفاعل حيوي Sixfors (Infors المؤتمر الوطني العراقي) باعتبارها ناظم كيميائي باستخدام الأساليب التي يمكن تكييفها بسهولة للالاجهزة البديلة.

1. تجميع السفن ناظم كيميائي

  1. بدوره على Sixfors باستخدام مفتاح رئيسي.
  2. شطف جيدا السفينة ناظم كيميائي، والتجمع، والنمام، وأنابيب المرفقة مع منزوع الأيونات (DI) المياه. تحقق من كل أنابيب والخواتم O-واستبدال أي تهالك أبحث قطعة.
  3. تأكد من قاعدة دعم محرك رمح تواجه صعودا في إناء من الزجاج والتي قطعت الجزء العلوي من حملة رمح في السكن على الجمعية النمام. تعيين stirreيجلس التجمع ص في الإناء الزجاجي ضمان السفلي من حملة رمح في دعم حملة رمح. استخدام المشبك لتأمين التجمع النمام إلى وعاء زجاجي.
  4. ملء وعاء مع حوالي 300 مل من الماء DI.
  5. تنزع الأغطية من الأوكسجين المذاب (DO 2) التحقيق والتحقق من مستوى بالكهرباء عن طريق فك غلاف القاع، والتأكد من أن الغلاف السفلي شغل في منتصف الطريق مع الحل بالكهرباء. Rescrew الغلاف السفلي وتضاف الى ميناء على متن السفينة ناظم كيميائي. المسمار حتى ضيق الإصبع.
  6. نلقي التحقيق الحموضة وإزالته من العازلة التخزين (3 M بوكل). إزالة الغطاء مسبار درجة الحموضة ونعلق على المخمر 1. باستخدام شاشة التحكم Sixfors، انتقل إلى القائمة المعلمة المخمر وحدد "معايرة درجة الحموضة". وضع مسبار درجة الحموضة في مستوى درجة الحموضة 7 العازلة وقراءة السجل كما عالية القراءة. كرر مع درجة الحموضة 4 العازلة والقراءة كما سجل أدنى قراءة. فصل مسبار درجة الحموضة من المخمر، ويغسل بالماء DI وإدراج الباحث التحقيقس الميناء على متن السفينة ناظم كيميائي. المسمار حتى ضيق الإصبع.
  7. وضع السفينة ناظم كيميائي في رف. ملاحظة على متن السفينة التي المخمر (1-6) كان على علاقة الرقم الهيدروجيني إلى التحقيق ومعايرة. وضع غطاء مسبار درجة الحموضة على تحقيق درجة الحموضة. باستخدام رقائق تغطية بإحكام الجزء العلوي من التحقيق قيام 2.
  8. احباط أضعاف خلال نهايات الأنابيب التي تعلق على سفينة ناظم كيميائي.
  9. كرر الخطوات من 1،2-1،8 لجميع السفن.
  10. تعقيم الأوعية بواسطة التعقيم لهم لمدة 15 دقيقة على دورة السائل.

2. إعداد وسائل الإعلام

  1. إنشاء مجموعة الحد من تركيزات للمادة مغذية التي تنمو الثقافات دفعة في تركيزات المغذيات المختلفة. المغذيات هو الحد في النطاق حيث كثافة الخلية النهائية هي وظيفة خطية من تركيز المغذيات الأولية (الشكل 4). تحديد تركيز المغذيات بشكل جيد ضمن نطاق محدود. أمثلة على تكوين وسائل الإعلام القياسية للدراسات مع Saccharomyceتتوفر ق الخباز في 7-11.
  2. الأوتوكلاف لالدامجانة زجاجة كبيرة الفارغة التي توج مع المكونات المطاطية التي تحتوي على مدخل الهواء ومخرج وسائل الإعلام بعد التأكد أولا أن نهاية الأنابيب وسائل الإعلام تتناول في احباط.
  3. في وعاء منفصل إعداد 10 L من وسائل الإعلام.
  4. نعلق مرشح كوب 500 مل إلى 100 مل زجاجة سائل الإعلام. إزالة عامل التصفية القطن مع ملقط معقم في الإيثانول ونعلق على الفور إلى ميناء الترشيح على الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام.
  5. إرفاق الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام إلى مصدر فراغ وتصفية تعقيم وسائل الإعلام عن طريق إضافته إلى كأس فلتر.
  6. عندما الترشيح من وسائل الإعلام كاملة، تغلق ميناء الترشيح مع الشبك المعدني.

3. هل معايرة 2 المسابر وإعداد ناظم كيميائي

  1. بعد أن تم تعقيمها الأوعية ناظم كيميائي وسمح لتهدئة مكان السفينة في سترة في الحرارة المقابلة. ربط التحقيق في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة التحقيق، والقيام 2 التحقيق. السماح للسفينة الجلوس مع السلطة لمدة لا تقل عن 6 ساعة للسماح للقيام 2 تحقيقات لاستقطاب.
  2. وضع نهاية كل أنبوب النفايات السائلة في وعاء جمع منفصلة. توصيل التيار الهواء عبر فلتر تعقيمها وبدوره على تدفق الهواء. الماء في كل سفينة ينبغي أن تتدفق من أنابيب مياه الصرف، مما يدل على أن جميع الأختام تتشكل بشكل صحيح.
  3. ضبط ارتفاع أنبوب مياه الصرف وفقا لحجم العمل المطلوب (مثلا 300 مل). نستخدم مسطرة التي تم وضع علامة مع مواضع أنبوب معايرة لأحجام عمل مختلفة.
  4. ربط الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام إلى وعاء ناظم كيميائي. استخدام الإيثانول من اجل الحفاظ على أنبوب ينتهي معقمة قدر الإمكان. الموضوع أنابيب مضخة من خلال مضخة والمشبك مفتوحة. اضغط يدويا حتى يبدأ ضخ وسائل الإعلام في التدفق إلى السفينة ناظم كيميائي. الإفراج عن أنابيب من المضخة، يجب أن تتدفق بحرية وسائل الإعلام في السفينة ناظم كيميائي. عندما تصل وسائل الإعلام أنبوب النفايات السائلة، أعد أنابيب لضخ والمشبك.
  5. بدء روnning البرنامج الأساسية مع مجموعة المكره إلى 400 دورة في الدقيقة ودرجة الحرارة التي حددت في 30 درجة مئوية.
  6. من أجل القيام معايرة 2 تحقيقات، وإيقاف العرض الجوي والتحول إلى غاز النيتروجين. الانتظار ساعة واحدة على الأقل وتسجيل قيمة الإجراء بأنه "منخفض للقراءة". التبديل إلى العرض الجوي (أي التي تحتوي على تركيز الأكسجين المحيطة)، وانتظر ساعة إضافية واحدة على الأقل، وقياس السجل ك "قراءة عالية".
  7. بدء تسجيل البيانات باستخدام برنامج ايريس.

4. تلقيح

  1. استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم الجزء العلوي من سفينة الثقافة.
  2. إزالة المسمار على رأس السفينة وماصة 1 مل من ثقافة بين عشية وضحاها في الإناء ناظم كيميائي. إعادة إحكام المسمار.
  3. تشير إلى وقت التلقيح في ايريس.
  4. انتظر ما يقرب من 24 ساعة للثقافات لتصل إلى مرحلة ثابتة في وقت مبكر. مع نمو الثقافة، والأوكسجين المذاب ودرجة الحموضة الانخفاض. في حالة وسائل الإعلام الحد من الجلوكوز، والأكسجين الذائب العودة إلى ~ 100٪ في فا ثابتةحد ذاتها. لقيود المغذيات الأخرى ستبقى الأوكسجين المذاب <100٪ في مرحلة ثابتة.

5. بدء مضخات وتحقيق الدولة ثابت

  1. يتم احتساب معدل التخفيف بقسمة معدل التدفق (تدفق وسائل الاعلام وكم في الإناء لكل ساعة) من حجم الثقافة. على سبيل المثال، وذلك باستخدام حجم 300 مل معدل التخفيف من 0.1 يعني أن 30 مل من وسائل الإعلام يضاف إلى ثقافة كل ساعة. لأن النظام هو تحت ضغط إيجابي تتم إزالة نفس الحجم من السفينة ضمان أن الثقافة هي المخفف بشكل مستمر. وهناك مجموعة من معدلات التخفيف (D) يمكن استخدامها التي لا يتجاوز معدل النمو الأقصى (μ ماكس) من الخلايا، أعلاه والتي سيتم غسلها الخلايا من ناظم كيميائي.
  2. اختيار إعدادات مضخة، التي تحدد عدد الثواني المضخة وخارجها، لإنشاء معدل التدفق المطلوب. المضخة توفر وسائل الإعلام بمعدل 0.11 مل ~ / ثانية.
  3. تعريف البرنامج باستخدام الباحث Sixforserface التي تحدد توقيت مضخة، ودرجة الحرارة وسرعة impellor. بدء تشغيل البرنامج.
  4. إفراغ أوعية جمع السائل وتسجيل الوقت.
  5. بعد ساعتين على الأقل، واستخدام اسطوانة تخرج لقياس مدى سائل الإعلام قد أزيلت من السفينة. وهذا يساوي وحدة التخزين التي تم إضافتها إلى السفينة ناظم كيميائي. حساب معدل التخفيف (D = V النفايات السائلة / V الثقافة / الساعة). ضبط إعدادات مضخة إذا كان معدل التخفيف حساب لا يطابق معدل التخفيف المطلوب.
  6. في حالة مستقرة، لا يغير كثافة الخلية في ناظم كيميائي مع مرور الوقت. وهذا يمكن أن تقاس دون احداث بلبلة في الثقافة عن طريق أخذ عينات من تدفق. نحدد من الناحية التشغيلية تحقيق حالة مستقرة كما متطابقة قياسات كثافة الخلايا التي تكون مفصولة تضاعف السكان واحد على الأقل. سوف تصل إلى حالة مستقرة يستغرق ما يقرب من ثمانية أجيال الثقافة بعد الشروع في الثقافة التخفيف. في حالة مستقرة، والخلايا تنمو باطراد (اولاه. معدل نمو ثابتة على مر الزمن) في ظروف محدودة المغذيات. الوقت تضاعف عدد السكان (الجيل الوقت) هو قانون الجنسية (2) / د.
  7. مواصلة لقياس كميات النفايات السائلة بشكل دوري لمدة التجربة لضمان أن معدل التخفيف المستمر والمحافظة عليها.

6. تطبيق 1: دراسة الخلايا تنمو بمعدلات مختلفة في ظروف الحالة المستقرة

  1. في حالة مستقرة في ناظم كيميائي، فإن معدل نمو السكان من الخلايا يساوي معدل التخفيف. عن طريق تغيير منهجية معدل التخفيف فمن الممكن أن تنمو الخلايا بمعدلات مختلفة. وهذا يتيح الدراسة المنهجية للمعلمات الفسيولوجية التي تختلف مع معدل النمو بما في ذلك حجم الخلية، ومرحلة دورة الخلية ومقاومة الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك، ملامح ثابتة للدولة مرنا العالمية والبروتين ومستوى الأيض يمكن أن يعاير في الخلايا تنمو بمعدلات مختلفة. هناك طريقتان للحصول على عينات:
  2. يمكن أن تكون عينات صغيرة أوب سلبيتترتب عليه من خلال وضع نهاية أنبوب مياه الصرف إلى 1.5 مل أو 15 مل أنبوب. ويمكن الحصول على عينة من 1-5 مل في بضع دقائق (اعتمادا على معدل التدفق). ويمكن قياس العديد من المعلمات الفسيولوجية من هذه العينات.
  3. التعبير الجيني، أو الأيض التحليلات تتطلب عينات أكبر التي يجب الحصول عليها في أسرع وقت ممكن. وضع نهاية أنبوب النفايات السائلة في أنبوب مخروطي 15 مل. الافراج عن المسمار عقد نهاية المعدني للأنبوب النفايات السائلة ودفع إلى أسفل بلطف. سوف A ~ 10 عينة مل ملء بسرعة الأنبوب الخاص. نضع في اعتبارنا أن وحدة التخزين في السفينة ناظم كيميائي قد تغير. إذا تم اتخاذ العديد من عينات متتالية قد يكون من الضروري للحد من تدفق للحفاظ على معدل ثابت التخفيف.

7. تطبيق 2: قياس دقيق من الاختلافات في معدلات النمو بين الطرز الوراثية في البيئات التي تسيطر عليها عن طريق فحوصات المسابقة على أساس التدفق الخلوي

  1. الكيموستات يمكن استخدامها لتحديد بدقة تأثير تركيز المغذياتعلى الفروق في معدلات النمو (أي لياقة بدنية) بين خلفيات وراثية مختلفة. بواسطة سلالات زراعة المشترك المسمى مع البروتينات الفلورية مختلفة يتم تحديد معدل التغير في الوفرة النسبية خلال النمو المتسارع. أداء هذا الاختبار في معدلات تخفيف مختلفة (D) يسمح دراسة آثار تركيز المغذيات (ق) على الاختلافات اللياقة البدنية.
  2. إنشاء ثقافات حالة مستقرة من سلالتين في الأوعية ناظم كيميائي منفصلة مع معدلات التخفيف متطابقة وحجم 300 مل.
  3. سلبية عينة 1 مل من كل سفينة. تدور باستمرار خلايا، resuspend في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ووضعت في 4 درجات مئوية. هذه العينات تحتوي على عينات الخلايا متجانسة، والتي هي الضوابط لتحليل التدفق الخلوي لاحقة.
  4. وضع أنبوب النفايات السائلة من سفينة واحدة في اسطوانة تخرج تعقيمها. الافراج عن المسمار عقد نهاية المعدني للأنبوب مياه الصرف، ودفع برفق إلى أسفل لطرد الخلايا من ناظم كيميائي. عندمايصل حجم 150 مل، والعودة نهاية المعدني للأنبوب مياه الصرف إلى موقعها الأصلي (300 مل). أكرر مع السفينة الثانية، وذلك باستخدام اسطوانة تخرج مختلفة.
  5. استخدام الايثانول 70٪ للحفاظ على العقم أثناء إزالة المسمار على الجزء العلوي من السفينة ناظم كيميائي. وضع القمع في افتتاح وتصب 150 مل من ثقافة أخرى في الإناء ناظم كيميائي. إعادة إحكام المسمار. أكرر مع السفينة الثانية، وذلك باستخدام قمع الثانية. يحتوي كل سفينة ناظم كيميائي الآن خليط من سلالات اثنين.
  6. الحصول على عينة 1 مل من كل سفينة باستخدام العينات سلبية كل 2-6 ساعة. تدور باستمرار خلايا، resuspend في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية. مواصلة اتخاذ عينات لتسجيل 2-3 أيام بعناية الوقت الذي اتخذ كل عينة.
  7. في نهاية التجربة، يصوتن وتمييع عينات إلى ~ 2 × 10 6 خلية / مل. باستخدام التدفق الخلوي، وقياس نسبة سلالتين في كل عينة. لأن كلا من سلالات تنمو باطراد، والفرق هو معدل النمو النسبييحددها الانحدار الخطي من قانون الجنسية (strain1/strain2) مع الزمن (يقاس في الأجيال). المنحدر من الانحدار هو الفرق النسبي في معدل النمو (أي ميزة اللياقة البدنية) من سلالة واحدة بالنسبة للأخرى.
  8. كما يمكن للثقافة مختلطة يستغرق بعض الوقت للوصول الى حالة استقرار جديدة، ونقاط الوقت المبكر قد تناسب بشكل ضعيف إلى الانحدار. هو افضل حل هذه المشكلة عن طريق السماح 2-3 أجيال تنقضي قبل بدء أخذ العينات أو إزالة النقاط المبكرة التي هي القيم المتطرفة واضحة. على العكس، مرة واحدة وسلالة واحدة outcompeted وغيرها من البيانات لم تعد مفيدة وينبغي استبعاد هذه النقاط.

8. تطبيق 3: تطور التجريبية

  1. تطور التجريبية التي أجريت في الكيموستات يختار لالمسوخ التي زادت في اللياقة البدنية في بيئة محدودة المغذيات. يتم تنفيذ الاختيار عموما على مدى مئات الأجيال.
  2. تأسيس ثقافة ناظم كيميائي ثابت للدولة باستخدام سلالةالنمط الجيني المعروفة (ويفضل أن يكون تسلسل الجينوم المعروف)، والمغذيات تعريف القيد.
  3. للحفاظ على "سجل الحفريات" من السكان التكيف بشكل سلبي عينة ناظم كيميائي كل 2-3 أيام وتخزين العينة في 15٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية.
  4. رصد الخزان وسائل الإعلام وتجديد وسائل الإعلام الجديدة مع الضرورة.
  5. الحفاظ على الثقافة المتنامية باطراد لعدة مئات من الأجيال.
  6. بعد الانتهاء من لوحة اختيار عينة من الخلايا على لوحات أجار الصلبة. بعد أن نمت الخلايا في المستعمرات، واختيار عينة متحيزة من المستعمرات باستخدام المسواك وتطعيم الحيوانات المستنسخة في الآبار الفردية لوحة 96 جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. تسمح عينات نسيلي أن تنمو بين عشية وضحاها، إضافة 100 ميكرولتر من 30٪ الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  7. تميز الحيوانات المستنسخة من خلال تسلسل الجينوم كله وأداء فحوصات المظهري بما في ذلك تقييم اللياقة البدنية، وذلك باستخدام المشتركة سلالة مرجعية fluorescently المسمى، كما هو موضح في التطبيق 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

والميزة الرئيسية لالكيموستات هو القدرة على التحكم في معدل نمو الخلايا تجريبيا من خلال تغيير معدل التخفيف. في الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، مورفولوجية الخلية بالمعلومات من مرحلته في دورة انقسام الخلية. السكان مع ارتفاع معدلات النمو تحتوي على نسبة أعلى من تقسيم الخلايا بنشاط على النحو الذي يحدده قياس جزء من خلايا unbudded (الشكل 5A). وقد أظهرت التحاليل التي أجريت على التعبير مرنا في الثقافات العالمية ناظم كيميائي أن التعبير عن العديد من الجينات وأعرب تفاضلي بوصفها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الكيموستات تمكين زراعة الميكروبات في ظروف الحالة المستقرة التي تسيطر عليها النمو. الخلايا تنمو بشكل مستمر بمعدل ثابت مما يؤدي إلى بيئة خارجية ثابتة. هذا هو على النقيض من الأساليب ثقافة دفعة في البيئة الخارجية التي تتغير باستمرار ويتم تحديد معدل نمو الخلايا من خلال التفاعل المعقد بين البيئة وراثى. وهكذا، فإن الميزة الرئيسية لزراعة الميكروبات في الكيموستات على الثقافات الدفعة هو القدرة على التحكم تجريبيا معدل نمو الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من جامعة نيويورك. نشكر مايتريا دنهام ومات براور الذي طور في البداية استخدام المفاعلات الحيوية Sixfors كما الكيموستات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Infors-HT Sixfors ChemostatAppropriate Technical Resources، Inc. 
زجاجة زجاجية 9.5 لترفيشر ساينتفيك02-887-1لسفينة الوسائط والخراطيم
بينتشكوكفيشر ساينتفيك05-867لسفينة الوسائط وسدادة الخراطيم
، مقاس 12 ، نيوبرين أخضركول بالمرEW-62991-42لوعاء الوسائط وموصل الخراطيم
المستقيمCole-PalmerEW-30703-02لسفينة الوسائط والخراطيم
العامة روابط الغرض 4 فيفيشر NC9557052 العلميةلسفينة الوسائط وأنابيب الخراطيم
أجزاء صغيرةمن مطاط السيليكونB000FMWTDEلأوعية الوسائط وأنابيب الخراطيم
، السيليكون ، 3/8 في ODFisher Scientific02-587-1Qلسفينة الوسائط وأنابيب الخراطيم
، سيليكون ، 7/32 في ODFisher Scientific02-587-1Eلسفينة الوسائط والخراطيم
أنابيب ، فولاذ مقاوم للصدأ ، 3/16 في ODMcMaster-Carr6100K164لأوعية الوسائط وأنابيب الخراطيم
، الفولاذ المقاوم للصدأ ، 3/8 في ODMcMaster-Carr6100K161لسفينة الوسائط وموصلات
خطافالخراطيم فيشر Scientific14-66-18Qلسفينة الوسائط ومشبك
اسئلةالخراطيم Cole-PalmerEW-06403-11لسفينة الوسائط والخراطيم
Luer، أنثىكول بالمرEW-45512-34لسفينة الوسائط والهوزيمة
لور ، ذكركول بالمرEW-45513-04لسفينة الوسائط والخراطيم
Millipore Aervent MTGR05010 مرشح 62 مم ، 0.2 & mu ؛ مفيشر MTGR05010 العلميلأوعية الوسائط والرافعات
PTFE Acrodisc CR 13 مم ، 0.2 & mفيشر NC9131037 العلميلأوعية الوسائط وأنبوب
التدفق للقراءة المباشرة للهواءكول بالمرEW-32047-77لإعداد غاز النيتروجين
أنبوب التدفق للقراءة المباشرة للنيتروجينكول بالمرEW-32048-63لإعداد غاز النيتروجين
إطارات متعددة الأنابيبكول بالمرEW-03218-50لإعداد
غاز النيتروجينالمنظم ، غاز الهواء التحليلي على مرحلتينY12-N145D580إعداد غاز النيتروجين
، الفولاذ المقاومAirgasY99-26450لإعداد خرطوم غاز النيتروجين
محول ذكرAirgasWES544لإعداد غاز النيتروجين
أنابيب نوربرينالبلاستيك الأمريكي57280لإعداد غاز النيتروجين
قاعدة ثلاثية القوائمCole-PalmerEW-03218-58لخراطيش صمام إعداد غاز النيتروجين
Cole-PalmerEW-03217-92لإعداد غاز النيتروجين
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2Aلإعداد الوسائط
Steritop الفراغ المعقم المرشحات العلوية ، 1,000 مل ، غشاء PES ؛ لحجم العنق 45 ممFisher ScientificSCGP-T10-REلإعداد
الوسائط زجاجة وسائط 100 مل ، حجمالعنق 45 ممفيشر العلميFB-800-100لإعداد
وسائل الإعلام كلوريد الكالسيوم · ؛ 2H2< / sub>Oفيشر ScientificC79-500كواشف الوسائط
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-1كواشف الوسائط
كبريتات المغنيسيوم & middot ؛ 7H2< / sub>Oسيجما ألدريتش230391وسائل الإعلام كواشف
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةفيشر العلميAC424205000وسائل الإعلام كواشف
كبريتات الأمونيومفيشر العلميةAC423400010وسائل الإعلام كواشف
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP9541كواشف الوسائط
حمض البوريكسيجما ألدريتشB6768كواشف الوسائط
كبريتات النحاس · ؛ 5H2< / sub>Oسيجما ألدريتش209198كواشف الوسائط
البوتاسيومسيجما ألدريتش60400كواشف الوسائط
كلوريد الحديديك & middot ؛ 6H2Oفيشر العلميI88-100كواشف الوسائط
كبريتات المنغنيز & middot; H2< / sub>Oسيجما ألدريتش230391كواشف وسائط
موليبدات الصوديوم & middot ؛ 2H2< / sub>OSigma AldrichM7634كواشف الوسائط
كبريتات الزنك & middot ؛ 7H2< / sub>Oفيشر ScientificZ68-500كواشف الوسائط
البيوتينفيشر ScientificBP232-1كواشف الوسائط
بانتوثينات الكالسيومفيشر ScientificAC24330-1000كواشف الوسائط
حمض الفوليكسيجما ألدريتشF7876كواشف الوسائط
الإينوزيتول (المعروف أيضا باسم ميو إينوزيتول)فيشر العلميAC12226-1000كواشف الوسائط
النياسين (المعروف أيضا باسم حمض النيكوتينيك)سيجما ألدريتشN4126كواشف الوسائط
p-aminobenzoic حمضفيشر ScientificAC14621-2500كواشف الوسائط
البيريدوكسين HClسيجما ألدريتشP9755كواشف الوسائط
ريبوفلافينسيجما ألدريتشR4500-25Gكواشف الوسائط
الثيامين حمض الهيدروكلوريكفيشر العلميBP892-100كواشف الوسائط
ليوسينسيجما ألدريتشL8000-100Gكواشف الوسائط
UracilSigma AldrichU0750كواشف الوسائط
سكر العنبفيشر العلميDF0155-08-5كواشف الوسائط
، لمحول خرطوم للصدأ يوديد

المراجع

  1. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
  2. Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
  3. Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  4. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
  5. Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
  6. Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
  7. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  8. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
  9. Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  10. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
  11. Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
  12. Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107(2006).
  13. Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4(2007).
  14. Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
  15. Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
  16. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325(2012).
  17. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  18. Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  19. Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202(2011).
  20. Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
  21. Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
  22. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).
  23. Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
  24. Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
  25. Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
  26. Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
  27. Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
  28. Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة المفاعل الكيميائيالتحكم في معدل النموتحليل التعبير الجينيالتطور التكيفيقياس التدفق الخلويالتحديد الغذائيزراعة الحالة المستقرةحساب معدل التخفيفمقايسة اللياقة التنافسية
استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.