MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا لتقييم في الجسم الحي آثار لل miRNAs الإفراط في المعبر عنها في مناطق محددة في الدماغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن المجسم من الرنا الميكروي، معربا عن Lentiviruses إلى CA1 الحصين ماوس المنطقة وتقييم حصيلة السلوكية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
MicroRNAs (miRNAs) هي عبارة عن جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تنظيمية صغيرة حول 22 النيوكليوتيدات طويلة على أنه يجوز لكل هدف العديد من النصوص مرنا وخافت على كامل مسار الجين التعبير من خلال تدمير حمل و / أو ترجمة تثبيط هذه الأهداف. العديد من miRNAs تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية وظيفة وظائف المخ في المستوى العالي، ويتم البحث عن طرق لمعالجة مستوياتها لاستكشاف هذه الوظائف. هنا، نقدم طريقة مباشرة في الجسم الحي لدراسة العواقب المعرفية لل miRNAs القسري الزائدة في الفئران عن طريق الحقن المجسم من جزيئات الفيروس ميرنا ترميز. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي ينطوي على الحقن في المنطقة CA1 الحصين، الأمر الذي يسهم في توطيد الثدييات الذاكرة، والتعلم، واستجابات التوتر، ويقدم موقع الحقن مريحة. يتم قياس الإحداثيات وفقا لbregma الماوس، ويتم التحكم رقميا نضح الفيروس وأبقى بطيئة جدا.بعد الحقن، وختم الجرح الجراحة والحيوانات استرداد. Lentiviruses ترميز كواتم الصوت من الأهداف مرنا المقابلة تعمل على توريط ميرنا / الهدف التفاعل محددة مسؤولة عن تأثير الملاحظ، مع الفئران السذاجة، حقن الفئران بمحلول ملحي وحقن الفئران مع "فارغة" ناقلات الفيروسة البطيئة والضوابط. شهر واحد بعد الحقن، ويتم فحص الحيوانات في متاهة موريس المائية (MWM) لتقييم التعلم الملاحة وقدراتهم الذاكرة. وMWM هو خزان جولة مملوءة بالماء الملون مع منصة صغيرة مغمورة 1 سم تحت سطح الماء. الإشارات البصرية ثابت حول خزان تسمح للملاحة الفضائية (صوت وربما حقل المغناطيسي للأرض أيضا مساعدة الحيوانات في التنقل). ورصد كاميرا فيديو تتيح قياس مسار السباحة والوقت للعثور على وترقى المنصة. تدرس الماوس الأولى التي تركيب منصة خفية يوفر الهروب من السباحة القسري؛ ثم يتم اختباره لاستخدام هذا الهروب وجمعةinally، تتم إزالة منصة والاختبارات التحقيق فحص إذا كان الماوس يتذكر موقعه السابق. الاختبارات المتكررة على مدى عدة أيام متتالية تسليط الضوء على تحسن أداء الفئران اختبارها في الإختفاء أقصر لإيجاد وتحميل منصة، وطرق وأكثر مباشرة للوصول إلى منصة أو موقعه. عدم إظهار هذا التحسن تمثل ضعف في التعلم والذاكرة و / أو القلق، والتي قد ثم يتم اختبارها على وجه التحديد (على سبيل المثال في المتاهة زائد مرتفعة). هذا النهج يمكن التحقق من صحة لل miRNAs محددة ومحاضر الهدف في درس المعرفي و / أو العمليات المرتبطة بالتوتر.
المقدمة
وقد تم مؤخرا تحدى دور لل miRNAs خاصة في أداء الجهاز العصبي عن طريق الحقن lentiviral في العديد من الدراسات. تم العثور على MiRNAs أن تكون حاسمة للحفاظ وإعادة تشكيل بنية المشبك 1 synaptogenesis، و2 و إعادة عرض المشبك وصيانة 3. هذه الدراسات تشير بقوة إلى أن miRNAs يشاركون، عبر آثار التنظيمية multileveled سواء في صياغة وتصل في الحفاظ على الناتج الرئيسي من الجهاز العصبي، والوظيفة المعرفية. حقن المجسم من جسيمات الفيروسة البطيئة إلى مناطق محددة في الدماغ القوارض تمكن بالبحث عن تغييرات في التشكل المشبك ونشاط الخلايا العصبية، وكانت تستخدم لإقامة أهمية وظيفية من خلال النصوص التي تبديها 4،5. قد ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الفيروسة البطيئة
- تنمو الخلايا HEK-293FT إلى 90٪ التقاء.
- في يوم من ترنسفكأيشن تغيير المتوسطة الخلية إلى DMEM المصل خالية تستكمل مع 1 ملي الجلوتامين و 50 ملغ / مل البنسلين، الستربتوميسين.
- شارك في بالنقل الخلايا مع متجه pLKO.1-بورو ومع البلازميدات ترميز لR8.2 الدلتا والأنصاف VSV-G وميرنا من الفائدة، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل polyethylenimine باعتبارها الناقل 9.
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
حقن من 0.5 ميكرولتر الفيروسة البطيئة في المنطقة CA1 في حصين الماوس، مع معدل تدفق مبين في القسم بروتوكول غلة المجال المصابة من حوالي 1 ملم في محور منقاري-الذيلية، وحوالي 0.5 ملم في الإنسي الوحشي والأمامي الخلفي محاور (الشكل 3).
الشكل 1. نقطة و bregma جهاز الحقن. (أ) يظهر هو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
حقن المجسم من الفيروسة البطيئة هي طريقة سريعة نسبيا للتقييم في الجسم الحي على حد سواء أعلى أو أسفل تنظيم الجينات وmiRNAs مختلفة. البديل الرئيسي هو الفأر وراثيا الذي هو تقنية تستهلك الكثير أكثر شاقة والوقت ثم حقن الفيروسة البطيئة مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتنظيم ما يصل، في حقن الفيروسة البطيئة، يحدث في وقت محدد في الماوس الكبار ولا يتضمن أي إمكانية التسرب خلال التنمية، كما هو الحال في الفئران المعدلة وراثيا والتي تشمل التحكم الزمني في معظم الأحيان. التحكم الزمني الكامل هو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مركز الصفرا ادمون والزنبق للعلوم الدماغ (SB الزمالة)، وراثي التراث الطبية الحيوية برنامج الشراكة العلوم من مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 378/11، إلى HS) ومؤسسة الألمانية للالإسرائيلي العلمية البحث والتطوير (GIF) (منحة رقم 1093-32.2/2010، إلى HS).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
مقياس
| <قوي> المعدات< / قوي > | |||
| وزن القوارض | Burtons (المملكة المتحدة) | 115-455 | |
|---|---|---|---|
| وسادة تسخين | FIRst< / sup> التكنولوجيا | DCT-25 | |
| آلة التشذيب | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| مشرط وشفرات | كينت العلمية | INS500348 | |
| حقنة هارلاند | هاميلتون | 7632-01 | |
| الحفار | Stoelting | 51449 | |
| مضخة رقمية | هارفارد جهاز | 704507 | |
| خزان المياه والمنصة | Stoelting | 60135 | |
| الكواشف < / قوي > | |||
| كيتامين | فيتوكينول (إغراء فرنسا) | 3055503 | |
| دوميتور | أوريون فارما | 107140-10 | |
| ريماديل | فايزر لصحة | 24751 | |
| مرهم ترطيب - سينثوميسين 5٪ | ريكة فارماسيكوتيكال | 195 | |
| هيستواكريل | براون | 112101 | |
| محلول ملحي | سيجما ألدريتش | D8662 | |
المراجع
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
