مقالة منهجية

Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

DOI:

10.3791/50184

⸱

يناير 31, 2013

 , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو عالية السرعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد اليرقات تظهر كنموذج لوصف وضع وظيفة الدارات العصبية البسيطة. بسبب التسميد الخارجية، التطور السريع، والشفافية، وبشكل خاص مناسبة الزرد لنهج optogenetic للتحقيق الوظيفة العصبية الدائرة. في هذا النهج، يتم التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء في الخلايا العصبية المحددة، مما يتيح للمجرب لتنشيط أو تثبيط لهم في الإرادة، وبالتالي مساهمتها في تقييم سلوكيات معينة. تطبيق هذه الأساليب في الزرد اليرقات المفهوم بسيط ولكنه يتطلب الاستفادة المثلى من التفاصيل التقنية. نحن هنا يبرهن على وجود إجراءات التعبير عن البديل channelrhodopsin في الخلايا العصبية الحسية الجسدية اليرقات الزرد، الصور تفعيل الخلايا واحدة، وتسجيل السلوكيات الناتجة عن ذلك. من خلال إدخال بعض التعديلات على أساليب المحددة سابقا، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة للحصول الاستجابات السلوكية واحدة من الخلايا العصبية تصل تنشيطعلى الأقل 4 أيام بعد الإخصاب (DPF). على وجه التحديد، أنشأنا التحوير باستخدام الخلايا العصبية الحسية الجسدية محسن، CREST3، لدفع التعبير عن المتغير channelrhodopsin الموسومة، الشيف، tdTomato. حقن هذا التحوير في الخلية 1-مرحلة الأجنة النتائج في التعبير في الخلايا العصبية الحسية الجسدية الفسيفساء، والتي يمكن تصويرها مع المجهري متحد البؤر. تحديد الخلايا في إلقاء الضوء على هذه الحيوانات مع ضوء ليزر من DPSS نانومتر 473، يسترشد من خلال كابل من الألياف البصرية، يثير السلوكيات التي يمكن تسجيلها مع كاميرا فيديو عالية السرعة وتحليلها كميا. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة السلوكيات التي تسببها تفعيل أي الخلايا العصبية الزرد. سوف يجمع هذا النهج مع الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تكون وسيلة قوية للتحقيق في تشكيل الدوائر وظيفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جعلت تطوير أساليب optogenetic لتعزيز أو تثبيط الخلايا العصبية مع استثارة موجات محددة من الضوء من الممكن دراسة وظيفة للسكان متميزة من الخلايا العصبية في الدارات العصبية السيطرة على السلوك 1، 19، 21. وغالبا ما تستخدم هذه التقنية لتفعيل مجموعات من الخلايا العصبية، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتنشيط الخلايا العصبية الفردية. اليرقات الزرد هي أكثر ملاءمة لهذه الأساليب لأنها شفافة، الجهاز العصبي يتطور بسرعة، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا بسرعة والروتينية. ومع ذلك، لا بد من التغلب على العقبات الفنية الهامة لتحقيق موثوق واحد تفعيل الخلايا العصبية.

لتحسين إجراء لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية الزرد واحد، ركزنا على الخلايا العصبية الحسية الجسدية. اليرقات الزرد كشف مجموعة متنوعة من المحفزات الحسية الجسدية باستخدام اثنين من السكان من الخلايا العصبية: مثلث التوائم الخلايا العصبية، والتي يعصب رأسه، وحية Rohon-(RB) الخلايا العصبية، وهي عصب باقي الجسم. كل الخلايا العصبية والعصب الثلاثي التوائم RB مشاريع محور عصبي الطرفية التي الفروع على نطاق واسع في الجلد للكشف عن المنبهات ومحور عصبي المركزي الذي يتصل الدوائر العصبية المصب. الحيوانات تستجيب للمس في وقت مبكر الى 21 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، مشيرا إلى أن دوائر متماسكة الحسية الجسدية شكلت 5، 18. خلال نمو اليرقات على الأقل بعض الخلايا العصبية المشبك الثلاثي التوائم وعلى RB الخلية ماوتنر لتفعيل استجابات الهروب الكلاسيكي، ولكن تراكم الأدلة تشير إلى أن هناك فئات متعددة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع أنماط مختلفة من الاتصال التي قد تثير اختلافات على سلوك الهروب 2، 4، 10 و 12 و 14 و 15 و 16 و 17. كان لدينا الدافع لتطوير هذه الطريقة لتوصيف وظيفة السلوكية لفئات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية، ولكن من حيث المبدأ يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة وظيفة الخلايا العصبية من أي تقريبا أو السكان من الخلايا العصبية في لارفال الزرد.

دوغلاس وآخرون. سبق وصفها وسيلة لتفعيل Channelrhodopsin-2-معربا عن الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع الضوء الأزرق، انتزاع السلوك هروب 3. تستخدم نهجها عنصر محسن من الجين isl1 لدفع التعبير عن ChR2-EYFP في الخلايا العصبية الحسية الجسدية. هذا التحوير، ومع ذلك، أفادت التقارير لعرض مضان ضعيفة نسبيا، وتتطلب المشاركة في حقن مراسل الثاني، UAS GFP ::، للسماح التصور من الخلايا معربا عن ChR2-EYFP. وقد استخدم هذا النهج الحصول على ردود السلوك بين 24-48 HPF، ولكن لا يمكن أبدا أن استثارة رد فعل الماضي 72 HPF. وهكذا، في حين أن هذا الأسلوب يعمل لدراسة الدوائر العصبية في مراحل اليرقات في وقت مبكر جدا (24-48 HPF)، فإنه غير كاف لوصف الدوائر العصبية واستجابات سلوكية لدى كبار السن اليرقات، عند أكثر الاستجابات السلوكية المتنوعة واضحة والدوائر العصبية هي أكثر نضجا.

سعينا إلىتحسين حساسية هذه التقنية من أجل تميز وظيفة الخلايا العصبية مجموعات سكانية فرعية RB اليرقات. لتحسين التعبير استخدمنا محسن الحسية الجسدية الخاصة (CREST3) 20 لطرد التعبير عن وبه lexa-VP16 امتداد تسلسل المشغل به lexa (4xLexAop) 11 لتضخيم التعبير عن قناة ضوء تنشيط الموسومة fluorescently. هذا التكوين تضخيم التعبير عن القناة، مما يلغي الحاجة لمشاركتها في التعبير عن مراسل الثاني والسماح لنا مباشرة لتحديد الوفرة النسبية للقناة في كل الخلايا العصبية. باستخدام تسلسل به lexa / LexAop كان ميزة إضافية تتمثل في السماح لنا لتقديم التحوير إلى خطوط مراسل الزرد التي تستخدم نظام Gal4/UAS. أدى هذا التعبير عابرة التحوير في مستويات مختلفة من التعبير، ولكن عادة ما كان قويا بما يكفي لتصور كل من جسم الخلية والتوقعات من الخلايا العصبية محواري الفردية على مدى عدة أيام. لتحسين sensitivإيتي إلى النور استخدمنا ضوء تنشيط قناة الشيف، وهو البديل channelrhodopsin يتألف من الوهم من channelopsin-1 (Chop1) وchannelopsin-2 (Chop2) مع موقع كروس في حلقة الحلزون EF 13. يتم تنشيط هذه القناة في نفس الطول الموجي ChR2، ولكنها تتطلب كثافة أقل للتنشيط ضوء، مما يجعلها أكثر حساسية من غيرها من القنوات شائعة الاستخدام، بما في ذلك ChR2. وتنصهر البروتين الشيف لبروتين فلوري الأحمر، tdTomato، مما يمكننا من فحص للتعبير البروتين دون تنشيط القناة. كمصدر الضوء، كنا الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة (DPSS) الليزر بالإضافة إلى كابل من الألياف البصرية لتقديم دقة، عالية القدرة نبض أزرق خفيف إلى منطقة محددة من اليرقات. هذا سمح لنا للتركيز ضوء الليزر على الخلايا العصبية الفردية، مما يلغي الحاجة لإيجاد الحيوانات المعدلة وراثيا نادرة معربا عن الخلايا العصبيه في قناة واحدة. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على تنشيط الخلايا العصبية RB واحدة، دون الإجابة السلوكيةق مع كاميرا الفيديو عالية السرعة، والصورة الخلايا العصبية المنشط بدقة عالية مع المجهري متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد ما يلي في وقت مبكر.

1. إعداد كابل الألياف البصرية

  1. إنشاء وحدة التخزين للكابلات الالياف بواسطة ذوبان الرقبة مدبب من ماصة باستور الزجاج أكثر من موقد بنزن لخلق زاوية ° ~ 150.
  2. باستخدام قطع الأسلاك أو شفرة حلاقة، وقطع بعناية الكابلات البصرية إلى قطعتين. ينبغي لكل قطعة واحدة مع نهاية FC / PC ومحول أحد طرفي عرضة للخطر. تخزين قطعة واحدة كما كبل احتياطي.
  3. تجريد الكابل البصري وصولا الى الكسوة عن طريق إزالة سترة الألياف والألياف تعزيز (الشكل 1A) من 5.0 سم من نهاية قطع من الكابل.
  4. إدراج كابلات الالياف إلى ماصة باستور المعدة. تأكد من الكابل يمكن ان تتحرك بسهولة ويخرجون من طرف ماصة.
  5. مع الكابل البصري جاحظ من طرف ماصة باستور، وقطع بعناية وإزالة الألياف الكسوة من جميع أنحاء الألياف الزجاجية، ~ 2 مم من نهاية القطع.
  6. باستخدام القلم الماس / الزجاج القاطع، نيك الألياف الزجاجية وكسر سوما يليها نهاية لإنشاء قطع نظيفة / سطح في نهاية الألياف (1B الشكل).
  7. سحب الكابلات البصرية إلى ماصة باستور للتخزين. كرر الخطوة (1.6) إذا كان يحصل على نقطة وغيض من الألياف البصرية أو فواصل بشكل غير متساو.
  8. الكابل البصري في موقف ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية (الشكل 1C).

الإجراءات 2-8 تصف طريقة لحقن الجينات المحورة في الأجنة المطبقة عادة على التجارب الزرد كثيرة. الاختلافات على هذا الأسلوب، مثل تلك الموضحة في الفيديو إن الرب الأخرى 6، 7، 8، 9، 22 هي نفس القدر من الفعالية.

2. سحب حقن الإبر

  1. باستخدام إبرة مجتذب، وسحب أنابيب الزجاج البورسليكات في الإبر حقن اثنين مع تلميح مدبب تدريجيا. سوف الإعدادات مجتذب تختلف. (على إبرة سوتر الآلات التي نستخدمها مجتذب إعدادات: P = 500، الحرارة = 720، سحب = 50، السرعة والوقت = 70 = 150). كل إبرة مجتذب هو مختلف، حتى تحسين إعدادات مجتذب مpirically. لمزيد من الإبر مدبب، وزيادة الحرارة و / أو سحب. لإبر أقل مدبب، وزيادة الوقت و / أو سحب انخفاض.
  2. الإبر في وعاء تخزين آمنة (أي طبق بتري مع الشريط توالت لاصقة من جانب).

3. صب قوالب حقن

  1. تذوب 0.5 غ الاغاروز في الجنين مل 30 / المياه الزرقاء، حتى أنه قد حلت تماما الاغاروز.
  2. تصب في النصف السفلي من طبق بيتري.
  3. وضع قالب مستطيل مع تصاعد الآبار (الشكل 2) في الاغاروز، والحرص على تشكيل للحد من فقاعة حول الآبار.
  4. السماح لترسيخ الاغاروز.
  5. إزالة العفن وملء طبق بتري مع الأزرق / المياه الجنين.
  6. تخزين تستقيم، مليئة المياه النظيفة، في درجة حرارة الغرفة لاستخدام نفس اليوم أو في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. جعل البلازميد الحمض النووي لحقن مزيج

  1. تمييع DNA البلازميد إلى تركيز من 50 نانوغرام / ميكرولتر مع أحمر الفينول 1:10 في DDH 2 O. إلىعلى سبيل المثال:
    1.0 مل بلازميد الحمض النووي (250 نانوغرام / مل)
    0.5 مل الفينول الأحمر
    3،5 مل DDH 2 O
  2. يمكن أن تظل مزيج DNA في درجة حرارة الغرفة في حالة استخدام فورا أو تخزينها في C ° 4 لعدة أيام.

5. إعداد أزواج التزاوج

وينبغي أن يتم هذا المساء قبل كنت تخطط للقيام الحقن.

  1. ملء خزانات المياه مع نظام التربية ومكان الأسماك الذكور والإناث معا. إذا لم يكن يتم تنفيذ الحقن بمجرد تشغيل أضواء في منشأة منفصلة الأسماك الذكور والإناث مع مقسم.

6. (يمكن القيام أثناء انتظار الأجنة) الاستعداد للحقن

  1. بدوره على الضغط حاقن تلاعب. تأكد من تعيين النظام إلى النبض. تبدأ مع مجموعة PULSE DURATION إلى 1.
  2. بدوره على صمام الهواء وضبط ضغط حاقن لPSI 20 ~.
  3. باستخدام نطاق تشريح على أعلى التكبير، وكسر غيض من إبرة مع ملقط أو لعبة البوكر لخلق ~ افتتاح ميكرومتر 2 (الشكل 3، فيلم 1).
  4. ملء مع الإبر مزيج من DNA: 1. وضع الجانب إبرة غيض، وحتى، في مزيج الحمض النووي والسماح للإبرة ملء من عمل شعري أو 2. باستخدام تلميح طويلة تصل إلى 1-2 ماصة ميكرولتر من الحمض النووي مزيج مباشرة في الإبرة.
  5. شغل الإبرة مكان في مكان آمن حتى جاهزة للحقن.

7. جمع الأجنة

  1. بعد أضواء مرفق تم تشغيل، وإزالة فواصل (إن وجد). جمع الأجنة مع مصفاة / غربال الصغيرة ونقلها إلى طبق بتري مع الأزرق الطازجة / المياه الجنين.

8. حقن الأجنة في مرحلة الخلية 1-2

  1. نقل الأجنة إلى حصاد قوالب حقن البلاستيك باستخدام ماصة.
  2. باستخدام مجهر تشريح، ودفع برفق الأجنة فيالآبار مع ملقط أو لعبة البوكر حادة (الشكل 4، فيلم 2).
  3. وضع الإبرة المحملة إلى مياداة مجهرية وموقف أكثر الأجنة.
  4. معايرة حجم الحقن عن طريق ضبط مدة PULSE في الخطوة 1-زيادات حتى تحصل على الصوت المطلوب (~ 1 NL). يمكن معايرة ذلك مع شريحة ميكرون، كما هو موضح في الفيديو لإن الرب السابق 8 و 22، ولكن لهذه الدقة التجربة ليست ضرورية، لأن مجموعة واسعة من حجم الضخ سيؤدي إلى التعبير الملائم.
  5. حقن مزيج 1 ~ NL DNA في الخلية مباشرة وتكرار لجميع الأجنة. ويمكن أيضا أن DNA حقنها في صفار، ولكن هذا يميل إلى أن يكون أقل كفاءة (الشكل 5، الفيلم 3).
  6. إزالة الأجنة المحقونة من العفن باستخدام تيار لطيف من اللون الأزرق / المياه الجنين.
  7. متجر حقن الأجنة في C ° 28،5 في الظلام.
  8. إزالة غير مخصبة، أجنة ميتة أو التالفة بشكل دوري.
  9. علاج الأجنة وايال PTU بين 18-24 HPF لمنع تصبغ.

9. الشاشة للتعبير التحوير

  1. dechorionate يدويا باستخدام HPF 24-48 الأجنة ملقط.
  2. تخدير اليرقات باستخدام 0.02٪ tricaine.
  3. باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح وتحديد اليرقات أو مثلث التوائم مع RB التعبير الخلايا العصبية ونقل هذه إلى طبق جديد مع المياه العذبة الزرقاء / PTU الجنين. الأجنة مع التعبير متفرق في الخلايا يسهل التعرف عليها هي الأمثل، ولكن سيتم استهداف الخلايا العصبية الفردية للتنشيط مع كابل من الألياف البصرية لذلك مجموعة واسعة من كثافة التعبير مقبولة.
  4. الأجنة في متجر 28.5 ° C في الظلام حتى المرحلة التجريبية المطلوبة.

10. تحميل ليرقات التجارب السلوك

  1. جعل منخفضة 1.5٪ الاغاروز ذوبان في DDH 2 O وتخزينها في كتلة الحرارة ° 42 C لمنعها من التصلب.
  2. باستخدام ماصة باستور الزجاج، ونقل اليرقات واحدة من فرزهم في حوض(ه) من 1.5٪ الاغاروز ذوبان منخفضة مع والمياه الزرقاء / الجنين أقل قدر ممكن.
  3. نقل اليرقات في قطرة من الاغاروز على طبق بتري الصغيرة.
  4. تحت المجهر تشريح يرقة الموقف، حتى الظهرية.
  5. وقد عززت عندما الاغاروز، وقطع بعيدا الاغاروز مع شفرة حلاقة رقيقة (# 11 مشرط)، وترك اسفين من أجار حول يرقة بأكمله.
  6. جعل اثنين تخفيضات قطري في جانبي صفار؛ الحرص على عدم نيك اليرقة.
  7. ملء المنطقة المحيطة الاغاروز مع الجنين / المياه الزرقاء.
  8. سحب الاغاروز بعيدا عن الجذع والذيل من يرقة (الشكل 6).

11. إعداد الكاميرا فائقة السرعة وبرامج التصوير

  1. تحميل كاميرا عالية السرعة على نطاق تشريح.
  2. توصيل الكاميرا إلى جهاز الكمبيوتر.
  3. بدوره على جهاز الكمبيوتر.
  4. تشغيل الكاميرا عالية السرعة.
  5. فتح الفيديو / برامج التصوير (نحن نستخدم AOS برامج التصوير وسوف يصف الإجراءات لاستخدامه هنا، ولكن التصوير الأخرىالبرنامج هو مقبول على حد سواء).
  6. ضبط إعدادات الكاميرا وفقا لذلك (أي 1000 لقطة في الثانية (في الثانية)، 50٪ العازلة الزناد أو إعدادات المفضل الأخرى).
  7. بدء التسجيل.

12. تنشيط الخلايا العصبية واحدة باستخدام الليزر نانومتر 473

  1. إرفاق مشجعا، والكابلات البصرية بالليزر.
  2. بدوره على تحفيز.
  3. تعيين مشجعا إلى حد أقصى من 5 فولت ومدة النبضة من 5 ميللي ثانية.
  4. بدوره على الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. استخدام المجهر تشريح لوضع غيض من كابلات الالياف بالقرب من جسم الخلية العصبية مع وجود الشيف-tdTomato التعبير (الشكل 6).
  6. تقديم نبض الضوء الأزرق لتفعيل الخلايا العصبية الحسية.
  7. تعيين السلوك سجل باستخدام كاميرا عالية السرعة على 500 أو 1،000 لقطة في الثانية.
  8. تكرار التجربة على النحو المرغوب فيه، والانتظار 1 دقيقة بين كل تفعيل لتجنب التعود. (نسجل ما لا يقل عن ثلاث إجابات لكل الخلايا العصبية).
  9. إلىاليرقات الإفراج عنهم، وبصرف النظر نقب الاغاروز مع ملقط، مع الحرص على عدم إصابة الحيوان. يمكن أن يسمح هذا الحيوان لمواصلة تطوير ويمكن تكرار الإجراء في مرحلة قديمة لوصف تطور السلوك. ويمكن أيضا أن الجنين remounted عالية الدقة لتصوير مبائر للخلية المنشط لربط السلوك مع بنية الخلية، كما هو موضح أدناه.
  10. نقل اليرقة إلى لوحة زرقاء مع ثقافة جديدة / جنين المياه. نستخدم لوحة 24 أيضا لتتبع اليرقات الفردية.

13. صورة الخلية العصبية (ق) مع مجهر متحد البؤر

  1. تخدير اليرقات مع tricaine 0.02٪.
  2. جبل اليرقات، حتى الجانب الظهري، في ذوبان 1.2٪ الاغاروز منخفضة أو في قالب الظهرية.
  3. صورة الشيف-tdTomato الخلايا العصبية مع ليزر نانومتر 543 و تصفية مناسبة وموضوعية. نستخدم الهدف 20X.
  4. إزالة اليرقات من الاغاروز والعودة إلى الفرد بشكل جيد مع الأزرق / المياه الجنين.
  5. متجر 28.5 ° C في في الظلام لفوrther التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1. تعيين ما يصل كابلات الالياف. (A) من الطبقات كابل من الألياف البصرية. (B) كابلات الألياف البصرية في عاري ماصة باستور. (C) وضع كابلات الالياف البصرية في ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصفت لنا نهجا لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية RB واحد في الزرد الحية. لدينا أسلوب يستخدم للتعبير عن transgenesis عابرة البديل channelrhodopsin الموسومة fluorescently، الشيف، tdTomato 13، في الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحددة. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا النهج لاستخدامها في غيرها من اليرقات الزرد السكان الخلية.

باستخدام هذا النهج الذي أثار باستمرار الاستجابات السلوكية من اليرقات HPF 34-48 مع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم أي اهتمام المتنافسة المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر فومي كوبو، وتود تييلي HerwigBaier (UCSF / معهد ماكس بلانك) للحصول على المشورة بشأن التجارب السلوك وDPSS الليزر إنشاؤها؛ Heesoo كيم وCERRI كيارا من ملعب البيولوجيا العصبية للمساعدة في MBL الشيف-tdTomato التجارب؛ PetronellaKettunen (جامعة غوتنبرغ ) للتعاون الأولي على التجارب optogenetic؛ BaljitKhakh، اريك هدسون، وجون مايك باكا ميليغان (UCLA) للحصول على المشورة التقنية، وروجر تسين (جامعة كاليفورنيا سان دييغو) لبناء الشيف-tdTomato. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة (5F31NS064817) NRSA لAMSP ومنحة من NSF (RIG: 0819010) لAS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
المواد
الزجاج ماصة باستور الصياد 1367820B أو ما يعادلها (10-15 مم)
200 ميكرومتر الألياف البصرية ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM التصحيح الحبل، المدة: 3 متر، انهاء: FC / PC، نهاية B: FC / PC، سترات: FT030
50 ميكرومتر الألياف البصرية ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM التصحيح الحبل، المدة: 3 متر، انهاء: FC / PC، نهاية B: FC / PC، سترات: FT030
تجريد أداة للتعديل ThorLabs AFS900 أو ثلاثة هول أداة تجريد (FTS4)
الوتد الماس الكاتب ThorLabs S90W
المشتعلة / براون Micropipette بولير سوتر الآلات P-97 أو ما يعادلها
البورسليكات أنابيب الزجاج مع خيوط سوتر الآلات BF-100-78-10
حقن القالب N / A N / A الشكل 5
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي أي أي
طبق بتري (100x15 ملم) أي أي
طبق بتري (60x15 ملم) أي أي
ضغط حاقن ASI MPPI-3 أو ما يعادلها
مياداة مجهرية والمعادن موقف Narashige M152 أو ما يعادلها
البلاستيك القابل للتصرف ماصات Fisherbrand 13-711-7 أو ما يعادلها
لعبة البوكر (حامل دبوس دبوس والحشرات) غرامة العلوم أدوات، وشركة 26018-17 26000-70 و أو ما يعادلها
ملقط الجراح غرامة العلوم أدوات، وشركة 11255-20 أو ما يعادلها
Microloader ماصة نصائح إيبندورف 9300001007
28.5 ° C الحاضنة أي أي
42 ° C الحرارة كتلة أي أي
غير معقمة شفرات المشرط رقم 11 الأدوات العلمية الدقيقة، وشركة 10011-00 أو ما يعادلها
تشريح قتغلب زايس STEMI أو ما يعادلها
الفلورسنت نطاق تشريح مع فلتر القياسية أي أي أو ما يعادلها
مبائر المجهر زايس 510 أو 710 LSM أو ما يعادلها مع أهداف الليزر لGFP وطلب تقديم العروض، و10X، 20X 40X و
كاميرا عالية السرعة AOS تكنولوجيز، وشركة X-PRI (130025-10) أو ما يعادلها
473 نانومتر ليزر محمول الكريستال الليزر CL-473-050 أو أعلى السلطة، مع خيار TTL
S48 محفز استرو المتوسطية، آلات العشب شركة الانقسام S48K أو ما يعادلها
FC / PC لكم التزاوج FC / PC ThorLabs ADAFC1 شمال شرق مايوإد للاتصال الكابل البصري
الليزر السلامة نظارات ThorLabs LG10 أو ما يعادلها
لوحات الثقافة 24 جينيسي 25-102 أو ما يعادلها
الاكتئاب واحد الشرائح الصياد S175201 أو ما يعادلها
كاشف
الفورية المحيط النظم البيئية المائية IS50
الميثيلين الأزرق الصياد S71325
الفينول الأحمر سيجما P4758
الاغاروز EMD 2125 أو ما يعادلها
انخفاض نذوب الاغاروز سيجما A9045 أو ما يعادلها
PTU سيجما P7629
Tricaine سيجما A5040
المياه الزرقاء / جنين 10 L DDH 2 O
0،6 ز الفوري المحيط
الميثيلين الأزرق 6 قطرات
الفينول الأحمر (5 ملغ / مل في بوكل M 0.2)
100X PTU 0،150 ز PTU
50 مل DDH 2 O
حل في 70 ° C، ويهز في كثير من الأحيان
قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية
1X PTU 1 مل 100X PTU
99 مل أزرق / أسماك المياه
Tricaine الأسهم الحل 400 ملغ tricaine
97،9 DDH 2 O
~ 2،1 مل 1M تريس، pH9.0 ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 ~
متجر في 4 ° C -20 ° C أو للتخزين على المدى الطويل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  2. Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
  3. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
  4. Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
  5. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  6. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689(2011).
  7. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217(2009).
  8. Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722(2010).
  9. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394(2009).
  10. Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
  11. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  12. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  13. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  14. Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
  15. Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
  16. Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
  17. Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
  18. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  19. Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
  20. Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
  21. Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
  22. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ChEF tdTomato CREST3

مقالات ذات صلة