يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في

11.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

مارس 25, 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

في هذه المقالة

ملخص

في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها ( على سبيل المثال الرخويات)، ويتم تحليل حمامات السيارات باستخدام تقنيات الخلايا 1،2،3،4. مؤخرا، قمنا بتطوير تقنية لتحفيز الخلايا العصبية خارج الخلية وتسجيل الأفراد في Aplysia californica 5. وصفنا الآن على بروتوكول لاستخدام هذه التقنية لتحديد وتوصيف فريد الخلايا العصبية الحركية داخل حوض المحرك.

الملخص

في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها (مثل الرخويات)، وتحليل حمامات السيارات ويتم باستخدام تقنيات الخلايا 1،2،3،4. مؤخرا، قمنا بتطوير تقنية لتحفيز الخلايا العصبية خارج الخلية وتسجيل الأفراد في californica Aplysia 5. وصفنا الآن على بروتوكول لاستخدام هذه التقنية لتحديد وتوصيف فريد الخلايا العصبية الحركية داخل حوض المحرك.

هذه التقنية خارج الخلية من المزايا. أولا، يمكن تحفيز كهربائي خارج الخلية والخلايا العصبية من خلال تسجيل غمد 5، لذلك لا بد من إزالتها. وهكذا، سوف تكون أكثر صحة الخلايا العصبية في التجارب خارج الخلية مما كان عليه في تلك الخلايا. ثانيا، إذا العقد يتم تناوب المناسبة من قبل تعلق من غمد، يمكن الوصول إلى الخلايا العصبية خارج الخلية أقطاب على جانبي العقدة، مما يجعل من أسهل وأكثر كفاءة لتحديد الخلايا العصبية متعددة في إعداد نفسه. الثالث، extracelluلار الأقطاب لا تحتاج إلى اختراق الخلايا، وبالتالي يمكن نقلها بسهولة ذهابا وإيابا بين الخلايا العصبية، مما تسبب في أضرار أقل لهم. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند واحد يحاول تسجيل متعددة الخلايا العصبية خلال تكرار أنماط الحركية التي قد تستمر لدقائق فقط. الرابعة، أقطاب خارج الخلية هي أكثر مرونة من تلك الخلايا خلال حركات العضلات. قد الأقطاب الكهربائية بين الخلايا وتلف سحب الخلايا العصبية خلال تقلصات العضلات. في المقابل، يتم الضغط بلطف منذ الأقطاب خارج الخلية إلى الخلايا العصبية وغمد أعلاه، فإنها عادة البقاء فوق الخلايا العصبية ذاتها خلال تقلصات العضلات، وبالتالي يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية أكثر سليمة.

لتحديد الخلايا العصبية الحركية بشكل فريد لمجموعة السيارات (وخاصة العضلات I1/I3 في Aplysia) باستخدام أقطاب خارج الخلية، يمكن للمرء استخدام الميزات التي لا تتطلب قياسات داخل الخلايا كمعايير: سوما الحجم والموقع، الإسقاط محور عصبي، وتعصيب العضلات 4، 6،7. لتجمع السيارات المستعملة خاصة لتوضيح هذه التقنية، سجلنا من الأعصاب الشدق 2 و 3 لقياس التوقعات محور عصبي، وقياس قوات تقلص العضلات I1/I3 لتحديد نمط تعصيب العضلات لالخلايا العصبية الحركية الفردية.

علينا أن نبرهن العملية الكاملة لأول الخلايا العصبية الحركية باستخدام تحديد تعصيب العضلات، ثم تميز توقيتها خلال أنماط السيارات، وخلق طريقة مبسطة لتحديد التشخيص السريع. طريقة مبسطة وسريعة أكثر التشخيص متفوقة للتحضير أكثر سليمة، على سبيل المثال في إعداد الشامل الشدق علقت 8 أو في الجسم الحي 9. ويمكن أيضا أن تطبق هذه العملية في أحواض السيارات الأخرى في 10،11،12 Aplysia أو في النظم الحيوانية الأخرى 2،3،13،14.

البروتوكول

1. إعداد طبق تسجيل

  1. وخلال التجارب محول القوة، يتم وضع العقد الشدق، العقدة المخية، والشدق الشامل في طبق بيركس الجولة والمتخصصة للدراسات القوة.
  2. للحث على ابتلاعي مثل الأنماط في التجارب، ونحن بحاجة إلى تطبيق غير hydrolyzable كرباكول ناهض الكولينية إلى العقدة المخية 15. لتجنب الاتصال المباشر من كرباكول على العقد والشدق والشدق الشامل، وهناك حاجة إلى غرف منفصلة لعزل العقدة المخية من العقد الشدق والشدق كتلة (الشكل 1).
  3. منذ كتلة الشدق هو أكثر سمكا بكثير من العقد الشدق، فلن يتم وضعها على نفس المستوى. ولذلك، ينبغي أن يكون هذا الطبق يعود لدائرة العقدة المخية (منطقة A في الشكل 1)، وهو منصة الأوسط للالشدق العقد (C منطقة في الشكل 1)، وغرفة أعمق بكثير اجهة لكتلة الشدق (منطقة D في الشكل 1).
  4. لإنشاء هذا الطبق، وتبدأ مع طبق بيركس 100x15 الجولة (15 ملم عالية، 100 مم في القطر). وبناء الطبق تتطلب عدة يصب من Sylgard. اتبع الإرشادات المتوفرة مع المنتج Sylgard. ويجب أن يسمح لتعيين Sylgard بين يصب مختلفة.
  5. وبور الأول هو لإنشاء أعلى مستوى من Sylgard في الصحن (B منطقة في الشكل 1)، وهو الجدار الفاصل بين المنصة والقاعة الأوسط مرة أخرى.
  6. استخدام اثنين من الصلصال المساند لعزل المنطقة عن الجدار Sylgard (منطقة B في الشكل 1). معطف من الطين النمذجة المساند مع غلاف بلاستيكي حيث سيتصل Sylgard لتسهيل إزالتها. ضمان الاختام مشددة على الحواف، حيث الطين النمذجة سوف اتصل الطبق، للحد من التسرب.
  7. صب Sylgard في الجزء بين المساند النمذجة الطين ما يقرب من 2 إلى أعلى الطبق. السماح للSylgard تعيين بالكامل بين عشية وضحاها. والحفاظ على الطبق في مكان دافئ لحثأسرع الإعداد. إزالة الطين النمذجة المساند وتنظيف أي بقايا الطين على Sylgard.
  8. المقبل، يجب سكب الدائرة مرة أخرى (منطقة A في الشكل 1) ومنهاج الأوسط (C منطقة في الشكل 1).
  9. وضع حامل الطين النمذجة حوالي 5 ملم بعيدا عن السطح الأمامي للSylgard للقسم الأوسط من منصة (منطقة C).
  10. صب Sylgard إلى المقاطع مرة أخرى لدائرة (منطقة A) والمتوسطة منصة (منطقة C) حتى ارتفاع حوالي 3-5 ملم تحت مستوى أعلى الجدار Sylgard الأولى (منطقة B). ينبغي السطح Sylgard للغرفة مرة أخرى تكون أقل بقليل من النظام الأساسي لتجنب تسرب الأوسط من غرفة تحتوي على العودة إلى منصة كرباكول الأوسط. مرة أخرى، والسماح للSylgard تعيين بالكامل بين عشية وضحاها ومن ثم إزالة الطين دعم النمذجة.
  11. والخطوة الأخيرة هي لقطع الشق في وسط الجدار Sylgard لتوفير قناة لحروف العطف المخي الشدق (CBCs) للذهابمن خلال منصة بين المتوسطة وغرفة الظهر. يجب عرض هذا الشق يكون حوالي 3-4 ملم، وهو ما يكفي لCBCs واسعة. ينبغي الجزء السفلي من الشق لا يكون أقل من سطح Sylgard من منصة الأوسط لمنع التسرب. ويمكن استخدام شفرة مشرط لقطع الشق.

2. القطب إعداد

  1. سحب أسلاك الزجاج من خارج الخلية واحد الماسورة الشعرية الزجاجية باستخدام المشتعلة براون micropipette مجتذب كما وصفها مكمانوس وآخرون 8 في القسم 3.1. مع خيوط FT345B في مجتذب، وإعدادات برنامجنا الحرارة النموذجية هي 480، سحب 50، سرعة 13، والوقت 20، ولكن لاحظ أن إعدادات ستكون مختلفة عن خيوط مختلفة. هذا البرنامج يخلق الأقطاب في سحب واحد مع عدم وجود مرحلة تلميع النار. يجب أن حجم رأس القطب يكون أصغر من حجم أجسام الخلايا. لالخلايا العصبية الحركية تتراوح بين 50 إلى 400 ميكرومتر ميكرومتر في القطر سوما، وdiamete الداخليةيجب RS من الأقطاب الزجاج خارج الخلية تكون حوالي 40 ميكرومتر والمقاومة ينبغي أن يكون لها حوالي 0.1 MΩ عندما أنها مليئة المالحة Aplysia.
  2. سحب أسلاك من أنابيب البولي اثيلين شفط باستخدام موقد بنزن. قطع قطعة من أنابيب البولي اثيلين حوالي 10 سنتيمترا. عقد أنابيب على طرفي ووضعه قريبة جدا من اللهب الناتجة عن الموقد بنسن في حين تناوب الأنبوب حتى يصبح لينة من الحرارة. تمتد على طول الأنبوب بعناية طوله بينما تتحرك بعيدا عن اللهب. فإن الجزء الأوسط من أنابيب استطال وتضييق كما يتم سحبها أنابيب.
  3. قطع الأنابيب في النصف لتشكيل أقطاب شفط اثنين. عموما يتم تطبيق الشفط الأقطاب إلى أقاصي قطع الأعصاب أو العضلات، على الرغم من أنها في بعض الأحيان يمكن أن تطبق عابرة.
  4. خلق أقطاب هوك للتسجيلات العصبية بعد بروتوكول صفها مكمانوس وآخرون 8 في أقسام 3،2-3،13. هذه الأقطاب هي especiحليفا مفيدا عندما لا يتم قطع الأعصاب أو العضلات.

3. ربط الكهربائي مرفق

  1. تشريح الحيوان وإزالة كتلة الشدق بعد بروتوكول الموصوفة في مكمانوس وآخرون .. 8 الباب 4.
  2. للتسجيل والتحفيز، يمكن إرفاق أقطاب هوك لعدد من الأعصاب المختلفة.
  3. لتوصيف أنماط كما حدث في الجسم الحي من قبل كولينس وChiel 9، يجب الحصول على تسجيلات من العصب والعضلات I2 الذي يشير إلى المرحلة مطل على إطعام 16، العصب radular (RN) الذي يشير إلى إغلاق الطعام الممسك 17، الشدق العصب 2 (BN2) والشدق العصب 3 (BN3) التي تشير إلى مرحلة التراجع 17،18. المرفقات من الأقطاب الكهربائية هوك التالي إجراء مماثل لتلك التي وصفها آخرون مكمانوس 8، الباب 5.
  4. مواقع هذه الأعصاب الرجوع إلى التخطيطي لجهاز التغذية Aplysia هو مبين فيالرقم 2 من مكمانوس وآخرون 8. نلاحظ أن trifurcates BN2 إلى فروع أ، ب، ج وقبل الذهاب تحت العضلات I1 في الأخدود الأفقي. فرع هو أول فرع لفصل من الجذع الرئيسي، والمجاور لBN3.
  5. تم استخدام تسمية الفروع أ، ب، ج وقبل Warman وChiel 18. فروع أ، ب، ج وتتوافق مع الفروع 3، 2، و 1، على التوالي، في التسميات المستخدمة من قبل Nargeot وآخرون 19. علاوة على ذلك، RN، BN1، وBN2، وBN3 لتتوافق مع الأعصاب 1 و 6 و 5 و 4 على التوالي، في التسميات المستخدمة من قبل كاندل 20 و سكوت وآخرون 21
  6. لدراسة تعصيب العضلات عضلة I1/I3، وجميع ما عدا الأعصاب الأعصاب الشدق 2 سوف تكون قطعت من كتلة الشدق خلال التجارب. وهكذا، كنا قطب هوك لتسجيل من BN2.
    7. <لى> ومنذ لن العصب I2 وRN وضمها الى كتلة الشدق، وأنها صعبة جدا للوصول باستخدام أقطاب هوك، فمن الأفضل لتطبيق أقطاب الشفط لتسجيل من لهم بدلا من ذلك. سنقوم بشرح تطبيق أقطاب شفط في الباب 7.
  7. إما استخدام القطب الكهربائي أو ربط شفط لتسجيل من BN3، لأنه من السهل للوصول باستخدام أي نوع من القطب. اخترنا لاستخدام الخطاف لقطب تسجيلات BN3 للحد من عدد من المتلاعبين لعقد الأقطاب الشفط، وتوفير مساحة للالمتلاعبين أخرى أو المعدات.
  8. إرفاق الكهربائي لربط فرع من BN2 (BN2-A) لبدء رفض مثل أنماط أثناء التجارب. من المفيد ربط الكهربائي إرفاق إضافية إلى BN2-وعلى الجانب الآخر، وذلك لأن بعض الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف لالمماثل مقابل المقابل BN2 A-التحفيز.
  9. للمساعدة في التمييز بين الخلايا العصبية مع توقعات من جانب واحد مقابل الثنائية، فإنهمفيد أيضا لإرفاق أقطاب هوك لBN2 وBN3 وعلى الجانب الآخر من العقد الشدق.

4. العقد وإعداد العضلات

  1. وسيتم إعداد العقد الشدق، العقدة المخية والشامل للتجارب الشدق محول القوة، التي يتم إرفاق العقدة المخية إلى العقد عن طريق الشدق CBCs ويتم إرفاق الشامل الشدق إلى العقد عن طريق الشدق BN2s فقط.
  2. بعد ربط الأقطاب هوك، وقطع العصب الدهليزي 1 (BN1) والعصب المريء (EN) ثنائي، وقطع في نقطة التعلق كتلة الشدق.
  3. سحب العقدة المخية إلى الأمام لنقلها للخروج من الطريق من العضلات I2. اجراء خفض في عضلة I2 على كيس radular، تمديد خفض أفقيا والأمامية في كلا الاتجاهين، وسحب رفرف من العضلات I2 إلى الأمام لفضح العصب radular. قطع فرعين RN والتأكد من أن فروع هي فترة كافية لمرفق القطب الشفط.
  4. Continue خفض I2 في دائرة واسعة حول العقد الشدق، والحرص على عدم قطع أو BN2s BN3s، وحتى يمكن أن العقد الشدق والجزء من عضلة المرفق I2 يفصل تماما من كتلة الشدق. قطع BN3s الثنائية عند نقطة التعلق كتلة الشدق، وراء ربط الكهربائي المرفق.
  5. تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم فراغ إلى الشق في طبق تسجيل المذكورة أعلاه التي تربط الغرفة ذهابا ومنصة الأوسط، وذلك باستخدام معلومات سرية ماصة لالتقاط الكرة من الشحوم فراغ وانتشر أكثر من الشق.
  6. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء السريع جل سوبر لأسفل الزجاج الأمامي للغرفة حيث سيتم وضع كتلة الشدق، عادل امام قاعدة Sylgard من منصة الأوسط.
  7. نقل بعناية العقدة المخية، والشدق العقد الشامل الشدق إلى الطبق تسجيل (الشكل 1) وصفها في القسم 2، والتأكد من أن يتم سحبها أي من أقطاب ربط بإحكام، والتي يمكن أن تلحق الضرر الأعصاب.
  8. وضع بعناية الشامل الشدق على الغراء في قاعة أمام الطبق التسجيل، لضمان أن يتم لصقها سطحه البطني في الجزء السفلي من الطبق. تأكد من الحفاظ على العقد وأقطاب من لمس الغراء. إضافة Aplysia المالحة 8 (460 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 22 ملم MgCl 2، 33 مم MgSO 4 و 10 ملي CaCl 2، 10 الجلوكوز مم، 10 مم اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7،4-7،5) إلى الطبق، والتي من شأنها أن تحفز الغراء لتعيين.
  9. إذا يجب أن يتم نقل الطبق إلى آخر المجهر لإعداد العقد الشدق للتسجيلات سوما خارج الخلية، تكون حذرة للغاية مع الأقطاب هوك. مجموعة الأقطاب الكهربائية على جانب واحد من كتلة الشدق معا، وأيضا مجموعة من الأقطاب الكهربائية على الجانب الآخر من كتلة الشدق معا. عقد بعناية من قبل الأقطاب استيعاب الشريط المختبر الذي يغطي أسنان في الموصل، مما يجعل مرة أخرى من أن يتم سحب أي من الأقطاب الكهربائية بإحكام.
  10. عندما يتم وضع صحن تحت المجهر، القطبوينبغي رايات ق بلطف على جانبي الصحن والباقي على المنصة بجوار الطبق.
  11. وأثناء فترات الراحة بين مراحل التجربة، تهوية المياه المالحة في قاعة الشامل الشدق باستخدام airstone الحوض.
  12. استخدام ملقط للاستيلاء على غمد من العقدة المخية وتسحبه مرة أخرى إلى غرفة، وضمان أن CBCs تشغيل من خلال الشق. دبوس العقدة الدماغية باستخدام الأعصاب غير CBCs لتجنب الأضرار التي لحقت CBCs سليمة.
  13. تطبيق أكثر الشحوم فراغ على CBCs، ثم قم بإضافة أكثر المالحة Aplysia لمجلسي الطبق، بحيث يتم المغمورة تماما العقد. تأكد من أن الجزء العلوي من الشحوم فراغ هو أعلى قليلا من الجدار Sylgard بحيث لا تسرب سيحدث بين الدوائر.
  14. لتحقيق الاستقرار في العقد الشدق، دبوس لأول مرة ينتهي من BN3s، ثم BN1s وENS وعلى قاعدة من منصة Sylgard الأوسط (الشكل 2). ومنذ أن سجلت BN3s باستخدام القطب هوكق، يجب وضع دبابيس أكثر من النقاط بشكل أقصى المرفقات من الأقطاب الكهربائية هوك.
  15. استخدام اثنين من الدبابيس، عازمة 90 درجة، والسنانير لتمتد وترسيخ CBCs، بحيث لن يكون معطوبا CBCs (الشكل 2).
  16. انخفاض الرقم فروع RN بين غرفة الظهر والعقد الشدق. ثم سوف تكون العضلات I2 على رأس RNS. لفضح العصب I2، استخدم ملقط للاستيلاء على العضلات I2 وتسحبه خلال العقد الشدق. دبوس ركنين من العضلات I2 لتجنب تلف في العصب I2.
  17. قطع العصب I2 البعيدة إلى النقطة التي دمج فرعيها في عضلة I2. تأكد من معصب لا تزال العضلات لتكون قابلة للمقارنة إلى التسجيلات في الجسم الحي. قطع بعيدا بقية العضلات I2 والوجه العصب I2 العودة ويعلقون عليه بين السلطتين RN اثنين (انظر الشكل 2، الشكل).
  18. ضبط مواقع الاوتاد لتمتد والتوتر إضافة إلى العصبية إذا هو فضفاض جدا، أو أن يفرج عنه إذا كان التوتر NERVه هو ضيق جدا. لزيادة استقرار العقد الشدق، إضافة المزيد من دبابيس على غمد بين الأعصاب.
  19. منذ يتم وضع العقد الشدق الجانب الذيلية حتى، تدوير العقد الشدق إذا الخلايا العصبية ذات الاهتمام على الجانب منقاري. لتدوير واحدة من العقد 2 الشدق، استخدم ملقط غرامة لانتزاع بعض الزيادة في غمد CBC حيث تقع بالقرب من العقد الشدق ويعلقون عليه بين BN2 وBN3 و. في بعض العقد، قد يكون أكثر ملاءمة لحفظ عليه بين CBC وBN3.
  20. إضافة دبوس إضافية على غمد من العقدة الشدق على الجانب بالقرب من غرفة الاستقبال للحد من حركة العقدة الشدق.
  21. لخفض غمد يغطي العقد الشدق، استخدم ملقط غرامة للاستيلاء على غمد على إغلاق الجانب إلى الدائرة مرة أخرى، ومن ثم قطع غمد الزائدة مع مقص غرامة دون تعريض الهيئات الخلية. من أجل تقليل الضرر، وإزالة فقط الحد الأدنى من غمد اللازمة لرؤية أجسام الخلايا.
  22. بعد ريتم قطع غمد انه من العقد الشدق، وسحب العصب وI2 RNS على مدى العقد الشدق ويعلقون عليهم بين العقد والشدق غرفة الاستقبال لتدوير زيادة العقد الشدق. (انظر الشكل 2).
  23. لتغسل أي كلوريد المغنيسيوم المتبقية 8 التي تم استخدامها لتخدير الحيوان قبل التشريح، استبدال المالحة Aplysia في الطبق مع المالحة Aplysia الطازجة.

5. ربط كهربائيا أقطاب هوك

  1. بعد إعداد العقد والعضلات، ونقل الطبق بعناية إلى الاهتزاز العزلة الجدول للتجارب.
  2. إرفاق جميع دبابيس الكهربائي لمآخذ على الكابلات BNC التي تتصل مضخمات (AM 1700 نموذج مكبر للصوت أنظمة). مرة أخرى، تأكد من أن لا يتم سحب الأقطاب بإحكام أثناء القيام بذلك. تأكد من أن يتم بشكل صحيح تعلق الأقطاب إلى الكابلات على النحو المناسب وأن أقطاب صحيحة.

6. إنشاء أقطاب الزجاج خارج الخلية لتسجيلات سوما

  1. ملء مع القطب المالحة Aplysia باستخدام حقنة تعلق على قطعة من أنابيب البولي اثيلين من 15-20 سم حولها. نعلق نهاية خالية من أنابيب البولي اثيلين إلى نهاية القطب الزجاج. التراجع على المكبس من المحاقن لتملأ بمحلول ملحي Aplysia القطب.
  2. وضع الزجاج مملوءة الكهربائي خارج الخلية في الشق لصاحب تتلاعب على. استخدام مناور لوضع القطب الكهربائي في تلميح المالحة التي تحتوي على العقد Aplysia الشدق.
  3. إدراج سلك كلوريد الفضة / فضية دبوس ملحوم على الذهب موصل ذكر في القطب لتكون بمثابة السلك التسجيل. وضع سلك آخر كلوريد الفضة / فضية دبوس ملحوم على الذهب موصل ذكر المالحة مباشرة في Aplysia داخل القسم من الطبق الذي يحتوي على تسجيل العقد الشدق ليكون بمثابة مرجع السلك. ربط كل التسجيل البريد وأسلاك الإشارة إلى كابل BNC الذي يتصل مكبر للصوت.
  4. إذا كان هناك مساحة كافية لمزيد من المتلاعبين، يمكن إضافة أقطاب إضافية الزجاج خارج الخلية لتسجيل الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت.

7. إنشاء أقطاب شفط للتسجيلات العصب

  1. تقليم نهاية ضيقة من القطب الشفط تلميح لمباراة قطر العصب. ينبغي أن القطر الداخلي للطرف القطب تكون مشابهة لأو أصغر قليلا من قطر العصب لضمان شفط مشددة.
  2. منذ العصب I2 وRN وقريبة جدا من بعضها البعض، ويمكن عقد من قبل أقطاب تتلاعب نفس لتوفير مساحة. وضع قطبين في درجتين من نفس المالك. تدوير القطبين وضمان النصائح هي قريبة من الآخر. اختيار واحد منهم لتسجيل العصب I2، والآخر لتسجيل RN.
  3. مكان غيض الكهربائي في محلول ملحي Aplysia داخل recordinز الطبق الذي يحتوي على العقد الشدق. نعلق نهاية خالية من أنابيب البولي إيثيلين على حقنة لشفط القطب. استخدام حقنة لملء مع القطب المالحة Aplysia. نقل معلومات سرية على مقربة من القطب نهاية العصب المستهدف، أي العصب I2، واستخدام المحاقن لامتصاص العصب في القطب. وينبغي أن طول العصب داخل القطب يكون حول 0،5-1،0 مم لضمان ختم ضيقة.
  4. تكرار الشفط الكهربائي لأن تعلق على RN.
  5. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى كابلات BNC المقابلة كما هو موضح في القسم 6.3.

8. إنشاء محول لقياس قوة انقباض العضلات I1/I3

  1. لإرفاق محولات القوة لعضلة، استخدم خيوط الحرير. ثني الإبرة منحني كل غرزة، وربط الخيط إلى محول القوة. الاستيلاء بلطف ورفع كمية صغيرة من العضلات مع ملقط و، وعقد إبرة في مجموعة أخرى من الملقط، إدراجالإبرة من خلال العضلات إلى نقطة عازمة في الإبرة (الشكل 1).
  2. يمكن تركيبها محولات إما أفقيا أو ظهريا على العضلات I1/I3. مرفق ظهري يسمح قياس تقلصات التي حركها تفعيل الجانب إما إلى اليسار أو اليمين من العضلات. سوف تظهر المرفقات الوحشي أقوى قوات لغالبية الخلايا العصبية، ولكن سوف لا تسمح قياس انكماش على الجانب الذي يتم إرفاق محول.
  3. للمساعدة في تحديد الخلايا العصبية التي قد تفعيل المناطق الأمامية، الخلفية، أو كليهما I1/I3، إرفاق محول القوة إلى الجزء الخلفي من عضلة، فقط الأمامي للأنسجة البلعوم، وإرفاق آخر محول القوة إلى الجزء الأمامي لل العضلات، في الفكين (الشكل 1؛ السنانير علما).
  4. محولات رفع المفعول الى حين سحب خيوط مشدود، ولكن لا الإطالة الزائدة لا. للتحقق من ذلك، عرض قياس قوة من محول عندما خياطة لديه بعض الركود في الاولر، ثم ارفع حتى محول القياس هو أعلى قليلا من مستوى خط الأساس هذا.

9. تحديد الخلايا العصبية الحركية داخل حمام سباحة للسيارات

  1. يصف هذا البروتوكول عملية لتحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية داخل حوض المحرك. استخدمنا برنامج مسجل المحاور لرصد نشاط الخلايا العصبية الفردية والأعصاب المتعددة، والعضلات (EMG إشارة أو قوات الانكماش). في هذا البروتوكول، كنا القوات تقلص العضلات وكمثال لعملية تحديد الخلايا العصبية الحركية، وفي تجارب أخرى، كنا EMG أيضا، والإعداد لمثل هذه التجارب هي مشابهة جدا (انظر المناقشة).
  2. لتحديد موقع الخلايا العصبية مرشح، استخدم مناور للضغط بلطف غيض من القطب الزجاج خارج الخلية أسفل على غلاف أكثر من مركز الخلايا العصبية سوما 5 (الشكل 3)، والذي هو أفضل مكان لتحفيز والانتقائية تسجيل 5. منذ عتبة و الحاليةأو تنشيط الخلايا العصبية يزيد خطيا مع المسافة الكهربائي إلى سوما 5، فإن الانتقائية التحفيز تصبح أسوأ عندما يتم نقل القطب بعيدا عن وسط الخلايا العصبية المستهدفة نحو الخلايا العصبية المجاورة.
  3. لتحديد الخلايا العصبية الحركية، أولا تحفيز الخلايا العصبية مباشرة باستخدام الزجاج الكهربائي خارج الخلية لضمان أن هذه الخلايا العصبية فقط وإطلاق النار، ودراسة ما إذا كان يعصب العضلات. ثم، خارج الخلية العصبية من هذا السجل لإنشاء واحد مقابل واحد العلاقة بين خارج الخلية وتسجيل سوما التسجيلات العصبية، التي هي أيضا حاسمة لتحديد الخلايا العصبية.
  4. منذ مكبرات الصوت خارج الخلية أكثر لا تسمح التحفيز في وقت واحد وتسجيل قناة في، تعيين قناة تستخدم لتنشيط وتسجيل سوما (القناة سوما) إلى وضع التحفيز وتطبيق موجز انوديك الحالية (على سبيل المثال 6 ميللي ثانية لالخلايا العصبية Aplysia 5) إلى سوما (أرقام 4A، 5A، السهام ملاحظة 1 طن كلا الرقمين)، بدءا من تيار منخفض (مثل 200 ميكروأمبير)، وزيادة تدريجيا الحالي حتى رشقات نارية الخلايا العصبية.
  5. مرة واحدة يتم تنشيط الخلايا العصبية للانفجار، ينبغي للمرء التبديل على الفور القناة سوما من وضع التحفيز لوضع التسجيل (أرقام 4A، 5A، السهام الملاحظة 2 في كل من الأرقام). ومع ذلك، ستظل هناك تأخير بين التحفيز وتسجيل سوما بسبب تأخر استجابة الإنسان.
  6. إذا كانت الخلايا العصبية حرائق لفترة معقولة من الزمن، وينبغي أن يكون من الممكن لمراقبة واحد مقابل واحد إمكانات العمل المقابلة من تسجيل سوما وعلى العصب (ق) من خلال المشاريع التي العصبون (أرقام 4B، 5B، علما خطوط متقطع )، فضلا عن القوات التي تولدها الخلايا العصبية (أرقام 4A، 5A، علما صناديق زرقاء). إذا توقف إطلاق الخلايا العصبية قبل تسجيل سوما يبدأ، وزيادة الحالية لتنشيطه لفترة أطول.
  7. نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خارج الخليةتسجيلات يعتمد على موقع وحجم سوما القطب. سوف تكبر تسجيل خارج الخلية وزيادة حجم سوما والنقصان مسافة القطب إلى سوما. منذ الضوضاء تختلف فقط في نطاق ضيق، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء تزيد أيضا كما يزيد حجم سوما والمسافة الكهربائي إلى سوما النقصان. مجموعة الأكثر شيوعا من نسبة الإشارة إلى الضوضاء هو 4:01 حتي 08:01.
  8. ويمكن التعرف على الخلايا العصبية الحركية استنادا إلى خصائصها، مثل الموقع سوما، الإسقاط العصبية والغدد العرقية العضلات 4،6،7. منذ المرفقة فقط BN2s اثنين إلى كتلة الشدق، من خلال رصد النشاط على BN2s، يمكن للمرء التأكد من أن يحدث فقط قوة تقلص العضلات من الخلايا العصبية تفعيلها من خلال تحفيز خارج الخلية.
  9. على سبيل المثال، B3 هي الخلايا العصبية الحركية الكبيرة للعضلة I1/I3 (300-400 ميكرون في القطر سوما في الحيوانات وزنها 200 حتي 350 غرام)، وتقع على الجانب منقاري من العقدة الشدق (الشكل 3 ). مشروعات تكنولوجيا المعلومات إلا من خلال BN2 المماثل، ويعصب كل الأجزاء الأمامية والخلفية من العضلات I1/I3. معظم الوقت، وتفعيل فإنه ينشئ أكبر من قوة الأمامي الخلفي (8 من أصل 9 تجارب).
  10. بعد تبين وجود الخلايا العصبية، يمكن تسجيل النشاط في السلوكيات مثل الرضاعة مختلفة عبر القطب الزجاج خارج الخلية (أرقام 4 و 5)، والتي يمكن استخلاصها على النحو المبين أدناه. فإن تسجيل خارج الخلية على سوما يكون أكثر تحديدا بكثير من التسجيلات العصبية، والتي تشمل نشاط الخلايا العصبية عديدة ومختلفة.
  11. للحث على برامج مثل السيارات egestive، وتحفيز BN2 واحد مع 1-2 دقيقة من البقول 19 (2Hz، كل نبضة هي 1 ميللي ثانية). هذا التحفيز يولد موثوق أنماط egestive في هذا الإعداد. مع الحالية كافية (على سبيل المثال 300 ميكروأمبير)، قد تستمر لأنماط مدة التحفيز. في بعض الأحيان سوف يكون هناك واحد أكثر النمط الذي يحدث بعد فترة وجيزةتحفيز ينتهي.
  12. للحث على برامج مثل السيارات ابتلاعي، وضع بلورات قليلة من كرباكول الصلبة مباشرة على غمد من العقدة المخية 15. إذا كان أحد يريد أن تحكم في مستوى التعرض كرباكول، استخدم محلول كرباكول مم 1 إلى 10 في Aplysia المالحة. تركيزات أعلى من المرجح أن تحفز الاستجابات. أنماط متكررة تبدأ عادة خلال خمس دقائق، ويمكن أن تستمر لنحو عشرة الى خمس عشرة دقيقة قبل البدء في الجري.
  13. بعد الغسيل عدة مرات كرباكول وانتظار ما لا يقل عن 30 دقيقة، يمكن إضافة تطبيق لاحقة من كرباكول إلى العقدة المخية للحث على مزيد من الأنماط الحركية مثل ابتلاعي.
  14. بعد أن تم التعرف على الخلايا العصبية الحركية متعددة لتجمع السيارات خاصة، وتميزت خلال البرامج الحركية، يمكن للمرء وضع طريقة مبسطة إلى حد كبير التشخيص التي تتطلب الحد الأدنى من المعلومات لتحديد هذه الخلايا العصبية بسرعة في العمل في المستقبل (الشكل 6 </ STRONG>)، على سبيل المثال في الأعمال التحضيرية الشامل الشدق مع وقف التنفيذ أو في الجسم الحي. قد تشمل معايير حجم سوما والموقع، الإسقاط العصبية، حجم وحدة على الأعصاب، وتوقيت النشاط خلال أنماط الحركية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أرقام 4 و 5 اظهار النتائج المعتادة المستخدمة لتحديد اثنين من الخلايا العصبية الحركية I1/I3. ويبين الشكل 4 التسجيلات سوما من الخلايا العصبية الحركية الكبيرة، B3، خلال أنماط egestive مثل ومثل ابتلاعي-(أرقام 4C، 4D). واحد مقابل واحد المسامير المقابلة على قناة سوما وقناة BN2 المماثل (4E الشكل) أن تمت المحافظة على خصوصية التسجيل سوما B3 خلال الأنماط. B3 حرائق خلال مرحلة التراجع في منتصف إلى أواخر الأنم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها، مثل الرخويات (على سبيل المثال، المنقعية، اللولب، وAplysia)، وتحليل حمامات السيارات يتم عادة باستخدام الخلايا تسجيل 1،2،3،4. في هذا البروتوكول، ونحن تصف عملية لتحديد الخلايا العصبية الحركية بشكل فريد لمجموعة السيارات باستخدام تقنية خارج الخلية. استخدمنا القوة القياسات وكمثال على هذه العملية. يمكن للمرء أيضا استخدام EMG لقياس innervations العضلات. لفترة وجيزة، أن تفعل ذلك، وبروتوكول يحتاج إلى تعديل لإرفاق أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047073 وNSF DMS1010434 المنحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم شركة كتالوج رقم تعليقات
كلوريد الصوديوم فيشر العلمية S671 البيولوجية، وشهادة
البوتاسيوم كلوريد فيشر العلمية P217 شهادة ACS
المغنيسيوم كلوريد هيدرات العضوية أكروس 19753 99٪
كبريتات المغنيسيوم امائية فيشر العلمية M63 شهادة ACS
كلوريد الكالسيوم ثنائي الماء فيشر Scientifc C79 شهادة ACS
الجلوكوز (سكر العنب) سيغما الدريخ G7528 BioXtra
اجتماعات الأطراف عازلةص العضوية أكروس 17263 99٪
كرباكول العضوية أكروس 10824 99٪
هيدروكسيد الصوديوم فيشر العلمية SS255 موثق
حامض الهيدروكلوريك فيشر العلمية SA49 موثق
واحد الماسورة الشعرية الزجاجية نظم AM 6150
براون المشتعلة micropipette مجتذب نموذج P-80/PC سوتر الآلات خيوط المستخدمة: FT345B
المينا المغلفة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ كاليفورنيا الأسلاك الجميلة 0.001D، طلاء ح
II الغراء سيليكون المنزلية GE
دورو السريعة جل superglue هنكل كورب.
نظم AM مكبر للصوت نموذج 1700 نظم AM تصفية إعدادات: 10-500 هرتز لالعصب I2 / العضلات، الأعصاب 300-500 هرتز لسائر
Pulsemaster موضوع متعدد قناة محفز أدوات الدقة العالم A300
المعزل التحفيز أدوات الدقة العالم A360
مسجل المحاور X مسجل المحاور العلمية البرنامج للحصول على التسجيلات
دبابيس رابط الذهب BULGIN SA3148 / 1
الذهب موصل المقابس BULGIN SA3149 / 1
Sylgard إلاستومر سيليكون 184 داو كورنينج
100 × 15 مم طبق بلورة بيركس
ارتفاع الشحوم فراغ داو كورنينج
نصائح الماصة فيشر العلمية 21-375D
دبابيس Minutien أدوات العلوم الجميلة 26002-10
النمذجة كلاي سارجنت الفن 22-4400
تهمس مضخة الهواء تترا 77849
الحوض الأنابيب Eheim 7783 12/16 مم
النخبة Airstone هاغن A962
Vannas ربيع مقص أدوات العلوم الجميلة 15000-08
دومون # 5 الملقط الجميلة غرامة Sciencه أدوات 11254-20
Kimwipes كيمبرلي كلارك 34155

المراجع

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.