أدوات ترميز وراثيا optogenetic تمكين التلاعب موسع من الخلايا العصبية المحددة في ذبابة الفاكهة الدماغ. يمكن لهذه الأدوات تحديد الخلايا العصبية التي التنشيط كافية للحصول أو قمع السلوكيات معينة. هنا نقدم طريقة لتفعيل Channelrhodopsin2 التي يعبر عنها في الخلايا العصبية المستهدفة في الذباب المشي بحرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وهناك عدد متزايد من الأدوات المشفرة وراثيا أصبحت المتاحة التي تسمح غير الغازية التلاعب في النشاط العصبي للخلايا العصبية الخاصة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. ومن أهم هذه الأدوات هي optogenetic، والتي تتيح تفعيل أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة والتحرك بحرية باستخدام الضوء الساطع. Channelrhodopsin (ChR2) هي قناة الموجبة للضوء المنشط أنه عندما تفعيلها من خلال الضوء الأزرق، وأسباب إزالة الاستقطاب من الخلايا العصبية التي تعبر عن ذلك. وكان ChR2 فعالة لتحديد الخلايا العصبية الحرجة لسلوكيات معينة، مثل تجنب 2 CO والإرشاد وخرطوم العملاقة الألياف بوساطة ردود الفعل المفاجئة 2-4. لكن، وكما تستخدم مصادر الضوء المكثف لتحفيز تحفيز خلايا مستقبلة للضوء ChR2 أيضا، لم هذه التقنيات optogenetic سبق المستخدمة في النظام البصري. هنا، ونحن الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف لphototransduction التجريبيnstrate أن تفعيل مجموعة من الخلايا العصبية الحساسة للتلوح في الأفق في الفص الذبابة البصرية، FOMA-1 الخلايا العصبية، يمكن أن تقود سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام. كنا على أليل فارغة من عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β، المشفرة بواسطة الجينات norpA، لجعل الذباب المكفوفين وأيضا استخدام Gal4-UAS نظام المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في FOMA-1 الخلايا العصبية. توضع الذباب الفردية على منصة صغيرة محاطة المصابيح الزرقاء. عندما تضاء المصابيح، ويطير بسرعة الإقلاع في رحلة، بطريقة مشابهة لسلوك الهروب النول مدفوعة بصريا. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة السلوكيات الأخرى في التحرك بحرية الذباب.
المقدمة
وقد وضعت ترسانة متزايدة من الأدوات المشفرة وراثيا لمعالجة النشاط العصبي في خلايا معينة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. هذه الأدوات تمكن تفعيل موسع أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة وتتحرك بحرية. ومن بين هذه، Channelrhodopsin2 (ChR2)، قناة الموجبة للضوء المنشط، ويقدم المزايا الرئيسية، حيث يمكن أن تسيطر مؤقتا والتي يسببها بسرعة. عندما الخلايا العصبية التي يتعرض لها صريحة ChR2 إلى الضوء الساطع (470 نانومتر) الزرقاء التي تظهر بسرعة ويزيل الاستقطاب ارتفاعا في معدلات اطلاق 3-5. وقد كشفت هذه الخلايا العصبية المستهدفة تفعيل محددة في الحيوانات التحرك بحرية كفاية من الخلايا العصبية خاصة لتجنب السلوكيات مثل 2 CO 3، خرطوم تمديد 2،4، والألياف العملاقة الردود جفل بوساطة 4. لكن، وكما مصادر ضوء مكثفة اللازمة لتحفيز خلايا مستقبلة للضوء أيضا تحفيز ChR2، وتطبيق البروتوكول الاختياريكان محدودا لتقنيات togenetic النظام البصري. من خلال الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف phototransduction، وقد أثبتنا أن تفعيل مجموعة محددة من الخلايا العصبية في الفص الذبابة البصرية يمكن أن تدفع سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام 6.
معظم، إن لم يكن كلها، والحيوانات البصرية يحمل سلوك الهروب لتجنب الاصطدامات مع كائنات قادمة في الاتجاه المعاكس. المشي أو ثابتة الذباب، عندما قدم مع حادث تصادم تلوح في الأفق، الإقلاع إلى الطائرة، بعيدا عن التصادم قدوم 7-9. وتتميز هذه الموازنة من قبل أخذها إلى أجنحة أثار قبل اقلاعها ومسار رحلة غير مستقرة 10،11. هذا الرد يختلف عن استجابة العملاقة الألياف بوساطة جفل، القفزات التي لا يسبقها أجنحة المثارة، ويؤدي عادة في تعثر السقوط الحر 4،9. وبعد تحديد مجموعة محددة من الخلايا العصبية الحساسة تلوح في الأفق في الفص البصري، FOMA-1 الخلايا العصبية، التي هي UNIQUسعينا اعل ضبطها لترميز الأشياء تقترب، لبحث مشاركتها في الذبابة تلوح في الأفق السلوك الهروب. نحن هنا لشرح استخدام optogenetics لتفعيل هذه الخلايا العصبية بشكل انتقائي وتثير السلوك الذبابة الهروب.
نستخدم نظام Gal4-UAS المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية-1 FOMA. ChR2 يتطلب العامل المساعد للجميع عبر الشبكية وكما تم العثور على هذا في مستويات منخفضة في النظام المركزي العصبي ذبابة الفاكهة يجب أن تستكمل في النظام الغذائي للذباب. 3،4 كما يتم استخدام الضوء الساطع لتفعيل ChR2 والذباب يحمل السلوكيات ضوئية السلوك قوية 12، سعينا إلى القضاء على إمكانية استجابة لحافز البصرية. للقيام بذلك، كنا الحيوانات التي كانت متحولة متماثلة اللواقح أليل لاغية من الجين norpA، الذي يشفر عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β. مبصرات في الذباب متحولة غير قادر على مثل هذه المسؤولةد الضوء 13. لاختبار التحفيز optogenetic للاستجابة الهروب، ونحن بحاجة لعزل ذبابة واحدة ويستحم في ضوء زرقاء لامعة. للقيام بذلك، ونحن نضع الفرد في الذباب نصائح الماصة. يتم وضع طرف واحد الماصة في حامل مخصصة، مثل أن يطير سوف يسير geotactically حتى تلميح والخروج على منصة مستطيلة. الطاير قادرة على المشي بحرية حول على رأس هذا النظام الأساسي. وتحيط بها سلسلة منصة الزرقاء 4 الصمام، كل يحتوي على 3 المصابيح، وتركز على الجزء العلوي من المنصة. بعد الطاير على المنصة، والمصابيح مضاءة، ويتم تسجيل رد الذبابة باستخدام كاميرا عالية السرعة 6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد الذباب Channelrhodopsin
- عبر UAS-ChR2 الذباب مع السائق Gal4 من اختيارك، ونحن نستخدم G105-Gal4، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية-1 FOMA في الفص البصري.
- للقضاء على احتمال وجود استجابة البصرية لتحفيز الضوء الأزرق، سواء خطوط الطيران في الخلفية AW + norpA.
- النتيجة النهائية: W + norpA؛ G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- بعد الكبار الذباب eclose، وطرح الإناث على اختيار الأغذية الطازجة، على أن تستكمل مع 10 ميكرومتر جميع العابر الشبكية (شارك في العوامل اللازمة لChR2) ومحمية من الضوء، لمدة 3 أيام قبل إجراء الفحص السلوكي.
2. جعل 10 ميكرومتر جميع العابر الشبكية الغذاء المحسن
- 100 ملغ من حل جميع الشبكية العابر في 17،6 مل من الايثانول 95٪ لجعل 20 ملي الشبكية. إبقاء جميع العابر الشبكية محمية من الضوء في جميع الأوقات.
- تذوب معيار دقيق الذرة الغذاء يطير في الميكروويف، والسماح لتبرد حتى دافئة للمس.
- خلط 50 ميكرولتر من 20 مليجميع العابر الشبكية في قارورة من 10 مل من الغذاء الطاير.
- اسمحوا تبرد قوارير والحفاظ على محمية من الضوء.
3. معدات
- نصائح الماصة: يتم قطع القياسية 1000 نصائح الماصة ميكرولتر قرب الطرف، وخلق قطر المسام من 2،25 ملم ~.
- منصة (انظر الشكل 1).
- قاعدة Delrin، شيد 17 سم X 25 سم، مع ثقوب الخيوط في كل ركن لتناسب ¼ "خرطوم المبرد موصلات معاهدة حظر الانتشار النووي.
- ومرفق حامل عمودي، مصنوعة من Delrin، إلى مركز للقاعدة. الأبعاد الكلية هي 25 مم X 40 مم X 65 مم (الارتفاع X العرض X العمق). أخدود 10 مم واسعة تمتد على طول حامل، مع المسمار الإبهام في الأسفل. ومرفق النظام الأساسي إلى أعلى حامل، 25 مم X 40 مم X 10 مم، مع وجود ثقب قطره 3،5 مم تتماشى مع الأخدود في حامل.
- الصمام صفائف (انظر الشكل 1).
- أربعة أذرع للخرطوم المبرد، ~ 18 سم طويلة، تلصق على منصة BASه باستخدام الرابط خرطوم المبرد. خرطوم المبرد يستخدم فقط الدعم الهيكلي وعدم استخدامها لأغراض التبريد.
- يتم قطع الأخاديد متباعدة بشكل صحيح في الجزء الأخير من المبرد الخراطيم من كل ذراع لتركيب المشتت الحراري إلى نهاية كل ذراع.
- هي التي شنت A المتمردين الأزرق LED ثلاثي نجوم لكل بالوعة الحرارة باستخدام قبل قطع شريط لاصق الحراري. A 18 ° Carclo تم تثبيت ثلاثي العدسة لكل نجم ثلاثي.
- يتم السلكية LED ثلاثي نجوم لبرامج التشغيل DC BuckPuck وإمدادات الطاقة كما هو محدد. لقد رتبنا لدينا مجموعة المتابعة مع كل BuckPuck المحرك 2 ثلاثي نجوم في السلسلة.
- الإضاءة LED من كل أربعة نجوم ثلاثي ب 700 مللي أمبير وأسفرت عن الإشعاع من 713 W / م 2 على برنامجنا.
- الكاميرا: الكاميرا هي التي شنت على ترايبود الصغيرة وركز على الجزء العلوي من المنصة.
4. الفحص السلوكي
- تخدير لفترة وجيزة الذباب على الجليد.
- وضع الفرد في الذباب نصائح الماصة، وذلك باستخدام الشريط لإغلاقكلا طرفي الإكراميات.
- بعد الذباب واستيقظت واستكشاف بنشاط غيض الماصة، وإزالة الشريط ووضع الماصة في الأخدود في حامل عمودي. يتم استخدام إبهامي لتأمين طرف الماصة في مكان وإغلاق أسفل الحافة.
- كما يستكشف الطاير طرف الماصة (30 عادة - 60 ثانية)، بدء التسجيل قبل الكاميرا الطاير يخرج من الطرف على المنصة.
- بعد الطاير ظهرت على منصة، والانتظار 1-2 SECO، وتشغيل المصابيح الزرقاء. استخدام جهاز توقيت لقياس الوقت يدويا حتى يبدأ رحلة الطاير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أعمى يطير يعبر عن ChR2 أو برنامج تشغيل G105 وحدها تظهر انخفاض معدل الإقلاع بعد إضاءة الضوء الأزرق مع مشرق. أعمى يطير عرضت بنفس المعدل من خارج بغض النظر عن اتخاذ الإضاءة (الشكل 2)، مما يشير إلى أن هذه الموازنة كانت عفوية أخذها إلى بدلا من الإضاءة نظرا لمع الضوء الأزرق. عندما يتم التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية Foma1، ومع ذلك، مع إضاءة الضوء الأزرق يثير استجابة الهروب. استغرق أكثر من 50٪ من اختبار الذباب من خلال 1 ثانية من الإضاءة، و 75٪ في غضون 5 ثوان (ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد أثبتنا التحفيز optogenetic من السلوكيات الهروب من الاستحمام بحرية المشي الذباب في ضوء زرقاء لامعة. يمكن تكييفها بسهولة هذا النهج لدراسة السلوكيات الأخرى في الذباب المشي بحرية، ويمكن زيادتها إلى أكبر منصات من قبل تبليط ببساطة صفائف LED كنا على مساحة أكبر. سواء باستخدام الكاميرا غير مكلفة وصفنا، أو غيرها من أنظمة الكاميرات المتوفرة، يمكن للمستخدم تصميم حصلت على معدل الإطار والتحليل المكاني من الصور لتتناسب مع سلوك الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يقتصر التصوير لدينا لوقت بعد تضا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة وعميد جامعة ستانفورد في (SEJdV)، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة الريادة المدير (TRC DP0035350)، جائزة مؤسسة ماكنايت الباحث في (TRC) وR01 EY022638 (TRC).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاشف | |||
| جميع العابر الشبكية | التقدم العلمي وشركة الكيميائية | R3041 | |
| معدات | |||
| المشتت الحراري 9،2 C / W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 مم 30 مم مربع X عالية |
| Carclo 18 ° ثلاثي عدسة | Luxeonstar | 10507 | |
| الأزرق LED المتمردين على قاعدة ثلاثي نجوم | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 نانومتر، 174 LM @ 700 مليون سنة. |
| 700 مليون سنة سائق BuckPuck DC | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| تسخير الأسلاك لسائق BuckPuck | Luxeonstar | 3021-HE | |
| قبل قطع شريط لاصق الحراري | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 ملم قاعدة الهيكس |
| الأداة الإضافية لوك خرطوم المبرد، ¼ "ID | ماكماستر-كار | 5307K49 | |
| الأداة الإضافية لوك رابط خرطوم المبرد | ماكماستر-كار | 5307K39 | ¼ "معاهدة حظر الانتشار النووي ذكر |
| مختبر الصف تبديل وضع الطاقة DC التموين للبرمجة | BK الدقة | 1698 | |
| EXILIM الكاميرا | كاسيو | EX-FH20 |
المراجع
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
