أدوات ترميز وراثيا optogenetic تمكين التلاعب موسع من الخلايا العصبية المحددة في ذبابة الفاكهة الدماغ. يمكن لهذه الأدوات تحديد الخلايا العصبية التي التنشيط كافية للحصول أو قمع السلوكيات معينة. هنا نقدم طريقة لتفعيل Channelrhodopsin2 التي يعبر عنها في الخلايا العصبية المستهدفة في الذباب المشي بحرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وهناك عدد متزايد من الأدوات المشفرة وراثيا أصبحت المتاحة التي تسمح غير الغازية التلاعب في النشاط العصبي للخلايا العصبية الخاصة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. ومن أهم هذه الأدوات هي optogenetic، والتي تتيح تفعيل أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة والتحرك بحرية باستخدام الضوء الساطع. Channelrhodopsin (ChR2) هي قناة الموجبة للضوء المنشط أنه عندما تفعيلها من خلال الضوء الأزرق، وأسباب إزالة الاستقطاب من الخلايا العصبية التي تعبر عن ذلك. وكان ChR2 فعالة لتحديد الخلايا العصبية الحرجة لسلوكيات معينة، مثل تجنب 2 CO والإرشاد وخرطوم العملاقة الألياف بوساطة ردود الفعل المفاجئة 2-4. لكن، وكما تستخدم مصادر الضوء المكثف لتحفيز تحفيز خلايا مستقبلة للضوء ChR2 أيضا، لم هذه التقنيات optogenetic سبق المستخدمة في النظام البصري. هنا، ونحن الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف لphototransduction التجريبيnstrate أن تفعيل مجموعة من الخلايا العصبية الحساسة للتلوح في الأفق في الفص الذبابة البصرية، FOMA-1 الخلايا العصبية، يمكن أن تقود سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام. كنا على أليل فارغة من عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β، المشفرة بواسطة الجينات norpA، لجعل الذباب المكفوفين وأيضا استخدام Gal4-UAS نظام المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في FOMA-1 الخلايا العصبية. توضع الذباب الفردية على منصة صغيرة محاطة المصابيح الزرقاء. عندما تضاء المصابيح، ويطير بسرعة الإقلاع في رحلة، بطريقة مشابهة لسلوك الهروب النول مدفوعة بصريا. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة السلوكيات الأخرى في التحرك بحرية الذباب.
المقدمة
وقد وضعت ترسانة متزايدة من الأدوات المشفرة وراثيا لمعالجة النشاط العصبي في خلايا معينة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. هذه الأدوات تمكن تفعيل موسع أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة وتتحرك بحرية. ومن بين هذه، Channelrhodopsin2 (ChR2)، قناة الموجبة للضوء المنشط، ويقدم المزايا الرئيسية، حيث يمكن أن تسيطر مؤقتا والتي يسببها بسرعة. عندما الخلايا العصبية التي يتعرض لها صريحة ChR2 إلى الضوء الساطع (470 نانومتر) الزرقاء التي تظهر بسرعة ويزيل الاستقطاب ارتفاعا في معدلات اطلاق 3-5. وقد كشفت هذه الخلايا العصبية المستهدفة تفعيل محددة في الحيوانات التحرك بحرية كفاية من الخلايا العصبية خاصة ل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد الذباب Channelrhodopsin
- عبر UAS-ChR2 الذباب مع السائق Gal4 من اختيارك، ونحن نستخدم G105-Gal4، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية-1 FOMA في الفص البصري.
- للقضاء على احتمال وجود استجابة البصرية لتحفيز الضوء الأزرق، سواء خطوط الطيران في الخلفية AW + norpA.
- النتيجة النهائية: W + norpA؛ G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- بعد الكبار الذباب eclose، وطرح الإناث على اختيار الأغذية الط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أعمى يطير يعبر عن ChR2 أو برنامج تشغيل G105 وحدها تظهر انخفاض معدل الإقلاع بعد إضاءة الضوء الأزرق مع مشرق. أعمى يطير عرضت بنفس المعدل من خارج بغض النظر عن اتخاذ الإضاءة (الشكل 2)، مما يشير إلى أن هذه الموازنة كانت عفوية أخذها إلى بدلا من الإضاءة نظرا لمع الضوء الأزرق. عندما يتم التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية Foma1، ومع ذلك، مع إضاءة الضوء الأزرق يثير استجابة الهروب. استغرق أكثر من 50٪ من اختبار الذباب من خلال 1 ثانية من الإضاءة، و 75٪ في غضون 5 ثوان (ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد أثبتنا التحفيز optogenetic من السلوكيات الهروب من الاستحمام بحرية المشي الذباب في ضوء زرقاء لامعة. يمكن تكييفها بسهولة هذا النهج لدراسة السلوكيات الأخرى في الذباب المشي بحرية، ويمكن زيادتها إلى أكبر منصات من قبل تبليط ببساطة صفائف LED كنا على مساحة أكبر. سواء باستخدام الكاميرا غير مكلفة وصفنا، أو غيرها من أنظمة الكاميرات المتوفرة، يمكن للمستخدم تصميم حصلت على معدل الإطار والتحليل المكاني من الصور لتتناسب مع سلوك الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يقتصر التصوير لدينا لوقت بعد تضا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة وعميد جامعة ستانفورد في (SEJdV)، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة الريادة المدير (TRC DP0035350)، جائزة مؤسسة ماكنايت الباحث في (TRC) وR01 EY022638 (TRC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاشف | |||
| جميع العابر الشبكية | التقدم العلمي وشركة الكيميائية | R3041 | |
| معدات | |||
| المشتت الحراري 9،2 C / W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 مم 30 مم مربع X عالية |
| Carclo 18 ° ثلاثي عدسة | Luxeonstar | 10507 | |
| الأزرق LED المتمردين على قاعدة ثلاثي نجوم | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 نانومتر، 174 LM @ 700 مليون سنة. |
| 700 مليون سنة سائق BuckPuck DC | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| تسخير الأسلاك لسائق BuckPuck | Luxeonstar | 3021-HE | |
| قبل قطع شريط لاصق الحراري | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 ملم قاعدة الهيكس |
| الأداة الإضافية لوك خرطوم المبرد، ¼ "ID | ماكماستر-كار | 5307K49 | |
| الأداة الإضافية لوك رابط خرطوم المبرد | ماكماستر-كار | 5307K39 | ¼ "معاهدة حظر الانتشار النووي ذكر |
| مختبر الصف تبديل وضع الطاقة DC التموين للبرمجة | BK الدقة | 1698 | |
| EXILIM الكاميرا | كاسيو | EX-FH20 |
المراجع
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
