يوفر مجموع RNA الخلوية قالب الفقيرة لدراسة التغيرات قصيرة الأجل في تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال وكذلك حركية معالجة RNA. هنا، نحن تصف وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouridine تليها biotinylation ثيول محددة وتنقية RNA المحولة حديثا السماح للتغلب على هذه القيود.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وصفها الأيضية من الحمض النووي الريبي كتب حديثا للدقة عالية التنميط التعبير الجيني من تخليق الحمض النووي الريبي، ومعالجة تسوس في خلية ثقافة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على وتسلسل الجيل القادم قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني. جنبا إلى جنب مع فهم أفضل للآليات الجزيئية المسؤولة، أصبحت قياسات دقيقة لحركية الكامنة ذات أهمية متزايدة. هنا، تواجه هذه المنهجيات قوية قيود كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من العينات قالب التي يدرسونها، أي الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية. في كثير من الحالات تغيرات في الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية تحدث إما ببطء شديد أو بسرعة كبيرة جدا لتمثيل الأحداث الجزيئية الكامنة وحركية مع القرار كافية. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم التمييز بينها بسهولة مساهمة تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي، وتجهيز، والاضمحلال.
وضعنا مؤخرا عالية الدقة الجينات التنميط التعبير للتغلب على هذه القيود. ويستند نهجنا على وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouriتناول الطعام (وبالتالي يشار إلى 4sU الجغرافية أيضا)، يليه تنقية صارمة من الحمض النووي الريبي كتب حديثا باستخدام biotinylation ثيول محددة والخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. وهو ينطبق على طائفة واسعة من الكائنات الحية بما فيها الحيوانات الفقارية، ذبابة الفاكهة، والخميرة. طبقنا بنجاح 4sU الجغرافية لدراسة حركية في الوقت الحقيقي من أنشطة عامل النسخ، وتوفير قياسات دقيقة من الحمض النووي الريبي نصف حياة، والحصول على رؤى جديدة في حركية معالجة RNA. وأخيرا، والنمذجة الحسابية يمكن استخدامها لتوليد تحليل متكامل وشامل من الآليات الجزيئية الكامنة.
المقدمة
التنميط الجيني التعبير هي أداة رئيسية تستخدم لدراسة العمليات الخلوية وشبكة التفاعل المعقد المرتبطة بها. وكانت الدراسات على وفرة مرنا عادة الأسلوب المفضل للحصول على رؤى الأساسية في الآليات الجزيئية الكامنة. غذى تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على 1، وفي الآونة الأخيرة، تسلسل الجيل القادم من الحمض النووي الريبي (RNA وما يليها) 2-4 هذا النهج. في حين أن هذه التقنيات قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني، فإنهم يواجهون قيودا كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من عينة قالب بهم، أي مجموع الخلوية الحمض النووي الريبي. التغييرات الأولى، على المدى القصير في مجموع مستويات الحمض النووي الريبي لا تتطابق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. وصفها الأيضية مع 4 thiouridine
تقديم خطة مفصلة من الإعداد التجريبية / الجدول الزمني، على سبيل المثال عندما لإضافة 4sU لزراعة الخلايا، وعندما لجني العينات. خطة لمدة 5 دقائق على الأقل بين كل حالة. علاج الخلايا فقط من حالة واحدة في كل مرة. التعامل مع ماكس. 3-5 الأطباق في وقت معين. التعامل مع الخلايا في أسرع وقت ممكن للحد من التغيرات في درجات الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون 2. تجنب تعريض الخلايا للضوء الساطع بعد إضافة 4sU لأن هذا قد يؤدي إلى يشابك من الحمض النووي الريبي 4sU المسمى إلى البروتينات الخلوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
1. انطلاق مادة وعائدات المتوقعة
بعد 1 ساعة (HR) من 4sU التعرض RNA المحولة حديثا يمثل حوالي 1-4٪ من مجموع RNA الخلوية. هذا وسوف يكون أقل في الخلايا اعتقال النمو لأنها لم تعد توليف الحمض النووي الريبي لحساب لنمو الخلايا / النسخ المتماثل. عندما وصفها لمدة 1 ساعة، نوصي ببدء الفحص مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. بدءا من أقل من 30 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع النتائج في الكريات الحمض النووي الري.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا يعزز بشكل كبير من قوة تكنولوجيات عالية الإنتاجية مثل ميكروأرس وRNA وما يليها من خلال توفير قوالب أكثر ملاءمة لمعالجة هذه المسألة البيولوجية من الفائدة. خضع هذا البروتوكول الأمثل واسعة النطاق. لأنها تتيح تخصيب> 1،000 أضعاف من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا ويوفر نتائج استنساخه للغاية.
التصميم التجريبي من تجربة 4sU الجغرافية يتسم بأهمية حاسمة كما RNA ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر إيمي ريغان لقراءة متأنية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل NGFN زائد منحة # 01GS0801، MRC زمالة منحة G1002523 وNHSBT منحة WP11-05 إلى LD وDFG منحة FR2938/1-1 إلى CCF
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4-ثيوريدين | كربوسينث | T4509 | تحضير مخزون 50 ملي مولار في H2< / sub>O معقم ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C في الحصص من 50-500 & ل ، تجاهل الكاشف غير المستخدم ، لا تعيد التجميد. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 مل) ، 15596018 (200 مل) | <قوي >تحذير - تآكل وخطير على الصحة!< / قوي> ضمان الوصول الفوري إلى ترياق الفينول (PEG-Methanol) ؛ يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| الكلوروفورم | سيجما | 372978 | <قوي >تحذير - خطير على الصحة < / قوي > |
| الأيزوبروبانول | سيجما | 650447 | < م >< / م > |
| سترات الصوديوم ، خالية من النوكلياز | Sigma | C8532 | قم بإعداد محلول مخزون 1.6 متر باستخدام ماء خال من النوكلياز. |
| 5M خالية من النوكلياز NaCl | Sigma | 71386 | محلول مخزون |
| خال من Nuclease H2< / sub>O | Sigma | W4502 | اصنع 1 مل من الحصص في أنابيب خالية من النوكلياز. |
| مخزن هطول | 1.2 M كلوريد الصوديوم ، 0.8 M سترات الصوديوم في الماء الخالي من النوكلياز. استعد مسبقا في ظل ظروف خالية تماما من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في 50 مل من أنابيب الصقر. | ||
| 459844 الإيثانول | سيجما | استخدمه مع الماء الخالي من النوكلياز لتحضير 80٪ من الإيثانول ، ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. | |
| 1 M Tris Cl خال من النوكلياز ، درجة الحموضة 7.5 | Lonza | 51237 | محلول مخزون |
| 500 ملي مولار EDTA خال من النوكلياز ، درجة الحموضة 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | محلول مخزون |
| 10x عازلة البيوتينيل (BB) | 100 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي مولار EDTA في ماء خال من النوكلياز ، قم بعمل حصات من 1 مل. | ||
| ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) | سيجما | D4551 | |
| EZ-Link البيوتين-HPDP | بيرس | 21341 | تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق إذابة 50 مجم من البيوتين HPDP في 50 مل DMF. الاحترار اللطيف يعزز الذوبان. يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C في حصصات 1 مل. |
| قفل المرحلة أنابيب ثقيلة 2.0 مل | Eppendorf | 0032 005.152 | اختياري لخطوة استخراج الكلوروفورم. |
| غشاء زيتا | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x نقطة لطخة ملزمة | 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 10 ملي مولار EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5'-biotin ، 25 نيوكليوتيد ، أي تسلسل | ||
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | فيشر | BPE9738 | للحصول على 100 مل 20٪ محلول مخزون ، أضف 20 جم SDS إلى 80 مل PBS درجة الحموضة 7-8 واضبط الحجم على 100 مل. حافظ على جميع محاليل SDS عالية النسبة أعلى من 20 درجة مئوية دافئة الحلول قليلا سوفت [سدس] يتربط. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق إذابة 50 مجم يودوأسيتيل بيوتين في 50 مل DMF. الاحترار اللطيف يعزز الذوبان. يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C في حصصات 1 مل. يولد بيوتينيل لا رجعة فيه وخاص بالثيول. |
| ملحي للفوسفات | Gibco | 10010-015 | |
| مؤقت | امزج 20 مل 20٪ SDS مع 20 مل 1 × PBS درجة الحموضة 7-8 وأضف EDTA إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملليمتر. | ||
| ستربتافيدين - الفجل الحار بيروكسيداز | Vector Laboratories | SA5004 | يحفظ عند -20 درجة مئوية ، امزج 10 مل 20٪ SDS مع 10 مل 1 × PBS. أضف 20 مو ؛ ل ستربتافيدين-HRP قبل الاستخدام. |
| كاشف ECL | RNP2109 | GE Healthcare | استخدم باتباع تعليمات الشركة المصنعة. |
| سوبر RX ، فيلم XRA ، 18x24 سم | فوجي فيلم | 47410 19236 | |
| & mu ؛ ماك Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | قم بتخزين الخرز في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| توين 20 | سيجما | P1379 | |
| مخزن مؤقت | للغسيل 100 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي EDTA ، 1 م كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ توين 20 في H 2< / sub>O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | قم بإعداد 100 ملي مولار DTT في H2< / sub >O الخالي من النوكلياز ، قم دائما بالتحضير الطازج قبل الاستخدام. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | تخزين الأعمدة عند 4 درجات ؛ C ، المكونات المتبقية من المجموعة في درجة حرارة الغرفة. |
| 1.5 مل أنابيب بولي بروبيلين | Sarstedt | 72.692.005 | متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد |
| 2.0 مل أنابيب البولي بروبيلين اللولبية | Sarstedt | 72.694.005 | متوافق مع أنابيب ثنائي ميثيل فورماميد |
| 15 مل | BD | Falcon 352096 | متوافق مع أنابيب ثنائي ميثيل فورماميد |
| 50 مل BD | Falcon | 352070 | متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد |
| يجب تخزين جميع المحاليل / الكواشف في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. | |||
| < > قوي معدات < / قوي > | |||
| الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / المرئية | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | أو ما يعادله. استخدم حجما منخفضا (1-2 & mu; ل) لقياسات تركيزات الحمض النووي الريبي المنخفضة لتجنب الفقدان المفرط للعينة. |
| أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين 15 مل | VWR International | 525-0153 | على عكس الأنابيب القياسية سعة 15 مل ، فإن هذه الأنابيب تتسامح مع ما يصل إلى 15,000 &# 215 ؛ g |
| أجهزة طرد مركزي عالية السرعة | Beckman Coulter | Avanti J-25 | أو ما يعادلها من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000 & # 215 ؛ ز |
| الدوار عالي السرعة | Beckman Coulter | JLA-16250 | أو ما يعادله من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000 & # 215 ؛ ز |
| محولات لأنابيب 15 مل | Laborger&# 228; te Beranek | 356964 | أو ما يعادلها من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000&# 215; ز |
| جهاز طرد مركزي مبرد على سطح الطاولة | Eppendorf | 5430 R | أو ما يعادله. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer مدمج | أو ما يعادله. |
| حامل مغناطيسي | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | حامل واحد يحمل 8 & mu ؛ أعمدة Macs. |
| منحة حمام مائي | SUB Aqua 5 | أو ما يعادلها. | |
| مقياس فائق الدقة | A & D | GR-202 | أو ما يعادلها. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | للهلام RNA ؛ أو ما يعادلها. |
| E-Gel EX 1٪ agarose جل مسبقة الصب | Invitrogen | G4020-01 | للهلام RNA ؛ أو ما يعادله. |
المراجع
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
