يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وصفها الأيضية من الحمض النووي الريبي كتب حديثا للدقة عالية التنميط التعبير الجيني من تخليق الحمض النووي الريبي، ومعالجة تسوس في خلية ثقافة

27K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

أغسطس 8, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر مجموع RNA الخلوية قالب الفقيرة لدراسة التغيرات قصيرة الأجل في تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال وكذلك حركية معالجة RNA. هنا، نحن تصف وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouridine تليها biotinylation ثيول محددة وتنقية RNA المحولة حديثا السماح للتغلب على هذه القيود.

الملخص

تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على وتسلسل الجيل القادم قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني. جنبا إلى جنب مع فهم أفضل للآليات الجزيئية المسؤولة، أصبحت قياسات دقيقة لحركية الكامنة ذات أهمية متزايدة. هنا، تواجه هذه المنهجيات قوية قيود كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من العينات قالب التي يدرسونها، أي الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية. في كثير من الحالات تغيرات في الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية تحدث إما ببطء شديد أو بسرعة كبيرة جدا لتمثيل الأحداث الجزيئية الكامنة وحركية مع القرار كافية. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم التمييز بينها بسهولة مساهمة تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي، وتجهيز، والاضمحلال.

وضعنا مؤخرا عالية الدقة الجينات التنميط التعبير للتغلب على هذه القيود. ويستند نهجنا على وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouriتناول الطعام (وبالتالي يشار إلى 4sU الجغرافية أيضا)، يليه تنقية صارمة من الحمض النووي الريبي كتب حديثا باستخدام biotinylation ثيول محددة والخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. وهو ينطبق على طائفة واسعة من الكائنات الحية بما فيها الحيوانات الفقارية، ذبابة الفاكهة، والخميرة. طبقنا بنجاح 4sU الجغرافية لدراسة حركية في الوقت الحقيقي من أنشطة عامل النسخ، وتوفير قياسات دقيقة من الحمض النووي الريبي نصف حياة، والحصول على رؤى جديدة في حركية معالجة RNA. وأخيرا، والنمذجة الحسابية يمكن استخدامها لتوليد تحليل متكامل وشامل من الآليات الجزيئية الكامنة.

المقدمة

التنميط الجيني التعبير هي أداة رئيسية تستخدم لدراسة العمليات الخلوية وشبكة التفاعل المعقد المرتبطة بها. وكانت الدراسات على وفرة مرنا عادة الأسلوب المفضل للحصول على رؤى الأساسية في الآليات الجزيئية الكامنة. غذى تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على 1، وفي الآونة الأخيرة، تسلسل الجيل القادم من الحمض النووي الريبي (RNA وما يليها) 2-4 هذا النهج. في حين أن هذه التقنيات قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني، فإنهم يواجهون قيودا كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من عينة قالب بهم، أي مجموع الخلوية الحمض النووي الريبي. التغييرات الأولى، على المدى القصير في مجموع مستويات الحمض النووي الريبي لا تتطابق التغيرات في أسعار النسخ، ولكنها تعتمد بطبيعتها على الحمض النووي الريبي نصف العمر من النصوص منها. في حين أن الاستقراء خمسة أضعاف من لم يدم طويلا نص، على سبيل المثال ترميز لعامل النسخ، وسوف يكون كشفها بسهولة في الحمض النووي الريبي مجموعفي غضون ساعة، نفس تحريض على الأجل الطويل نص، على سبيل المثال الترميز لانزيم الأيضية، وسوف تظل غير مرئية تقريبا. وبالإضافة إلى ذلك، حتى استكمال اغلاق القناة (> 1،000 أضعاف أسفل تنظيم) في معدل النسخ من الجين بمتوسط ​​مع نصف عمر خمس ساعات RNA سوف ببساطة تأخذ خمس ساعات لمجموع مستويات الحمض النووي الريبي لينخفض ​​بنسبة شقين فقط . ولذلك، فإن تحليل الحمض النووي الريبي مجموع تفضل الكشف عن ما يصل التنظيم من النصوص لم يدم طويلا، وكثير منها ترميز لعوامل النسخ والجينات مع المهام التنظيمية 5. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حجب تتالي الحركية الحقيقية للتنظيم، ولا يمكن أن تكون متباينة الأحداث يشير الأساسي من الثانوي. كلا، بدوره، قد يؤدي إلى تحيز كبير في التحليلات المعلوماتية الحيوية المصب. ثانيا، لا يمكن أن تعزى التغيرات في إجمالي مستويات الحمض النووي الريبي للتغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي أو تسوس. قياسات لهذه الأخيرة تتطلب نهجا الغازية الخلية، على سبيل المثال حظر transcriptiحول استخدام أكتينوميسين D 6، ورصد طويلة من الاضمحلال RNA الجارية مع مرور الوقت. بمتوسط ​​مرنا نصف العمر في خلايا الثدييات من 5-10 ساعة 5،7، لن يؤدي إلا إلى فقد انخفضت مستويات مرنا من معظم الجينات بنسبة أقل من شقين بعد عدة ساعات من اعتقال النسخي. هذه الاختلافات الصغيرة بدلا يؤدي إلى قياسات غير دقيقة بشكل فاضح من مرنا نصف العمر بالنسبة لغالبية الجينات الخلوية نظرا لطبيعة الأسي من المعادلات الرياضية الكامنة. وأخيرا، بينما RNA وما يليها من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية كشفت أن ما يقرب من نصف جيناتنا تخضع لأحداث بديلة الربط 8، حركية الكامنة فضلا عن آليات ديناميكية توجيه الأنسجة ومحددة السياق تنظيم معالجة الحمض النووي الريبي لا تزال غير مفهومة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مساهمة RNA تجهيز لتباين التعبير الجيني، ولا سيما بالنسبة للالرناوات غير الترميز، لا يزال يتعين تحديدها. وإجمالا، هذه القيود تمثل العقبات الرئيسية للالنمذجة المعلوماتية الحيوية الحركية من الآليات الجزيئية الكامنة.

وضعنا مؤخرا نهجا، ووصف الجينات وارتفاع القرار التنميط التعبير، للتغلب على هذه المشاكل 5،7،9. لأنه يقوم على وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا باستخدام 4-thiouridine (4sU الجغرافية)، وهو مشتق يوريدين التي تحدث بشكل طبيعي، ويوفر الوصول المباشر إلى النصوص المحولة حديثا مع الحد الأدنى من التدخل في نمو الخلايا والتعبير الجيني (انظر الشكل 1) 5، 10-12. التعرض للخلايا حقيقية النواة إلى نتائج 4sU في امتصاص على وجه السرعة، الفسفرة إلى 4sU-ثلاثي الفوسفات، وإدماجها في الحمض النووي الريبي المحولة حديثا. بعد عزل الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية، الكسر RNA 4sU المسمى هو البيروكسيديز ثيول على وجه التحديد توليد السندات ثاني كبريتيد بين البيوتين وRNA المحولة حديثا. 'مجموع RNA الخلوية' ثم يمكن فصل كميا في المسمى ('المحولة حديثا') وتوضيحها ("ما قبل existinز ') RNA مع نقاء عالية باستخدام الخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. وأخيرا، يتم استرداد المسمى الحمض النووي الريبي من الخرز ببساطة عن طريق إضافة عامل مختزل (على سبيل المثال dithiothreitol) الشق السندات ثاني كبريتيد والافراج عن RNA المحولة حديثا من الخرز.

كتب حديثا RNA يصور النشاط النسخي من كل جين خلال الإطار الزمني للتعرض 4sU. 4sU الجغرافية في مقياس الوقت من دقيقة وبالتالي يقدم صورة لقطة من حقيقية النواة التعبير الجيني وقالب مثالي لأسفل مجرى التحليلات المعلوماتية الحيوية (مثل تحليل المروج). في الحالات التي يمكن افتراض ظروف الحالة المستقرة، نسب المحولة حديثا / المجموع، كتب حديثا / الخالي من الملصقات وغير المسماة / الحمض النووي الريبي مجموع توفير وصول غير الغازية لRNA دقيق نصف حياة 7،13. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن الحمض النووي الريبي المحولة حديثا تنقيته بعد اقل من 5 دقائق من 4sU الجغرافية (5 دقائق 4sU-RNA) هو أصغر من 15 و 60 دقيقة 4sU-RNA.عند تنفيذ كلا فائقة القصيرة والطويلة تدريجيا 4sU الجغرافية في إعداد تجريبية واحدة جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي وما يليها، وكشف حركية معالجة الحمض النووي الريبي في قرار النوكليوتيدات 9. وأخيرا، تحليلات الوقت طبعا من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا ومجموع جنبا إلى جنب مع النمذجة الحاسوبية تسمح لتحليل تكاملية تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال 14.

وفي الختام، فإن هذا النهج يسمح للتحليل المباشر لديناميات توليف الحمض النووي الريبي، وتجهيز، وتدهور في الخلايا حقيقية النواة. هذا ينطبق في جميع الكائنات الحية بما فيها الثدييات نموذج رئيسي والحشرات (ذبابة الفاكهة)، البرمائيات (الضفدع)، والخميرة 5،15،16. وهو متوافق مباشرة مع تحليل ميكروأري 5،17، RNA-يليها 9،13،14، وينطبق في الجسم الحي 12،15. هنا، ونحن بالتفصيل منهجية لتسمية وعزل، وتنقية RNA المحولة حديثا في خلايا الثدييات مثقف. وبالإضافة إلى ذلك، potentiوتناقش المشاكل القاعدة والمزالق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. وصفها الأيضية مع 4 thiouridine

تقديم خطة مفصلة من الإعداد التجريبية / الجدول الزمني، على سبيل المثال عندما لإضافة 4sU لزراعة الخلايا، وعندما لجني العينات. خطة لمدة 5 دقائق على الأقل بين كل حالة. علاج الخلايا فقط من حالة واحدة في كل مرة. التعامل مع ماكس. 3-5 الأطباق في وقت معين. التعامل مع الخلايا في أسرع وقت ممكن للحد من التغيرات في درجات الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون 2. تجنب تعريض الخلايا للضوء الساطع بعد إضافة 4sU لأن هذا قد يؤدي إلى يشابك من الحمض النووي الريبي 4sU المسمى إلى البروتينات الخلوية.

بدء وضع العلامات

  1. ذوبان الجليد 4 thiouridine (4sU) فقط قبل الاستخدام وماصة المبلغ المطلوب من 4sU لكل حالة في أنبوب الصقر العقيمة.
  2. أخذ المبلغ المطلوب من مستنبت الخلية (5 مل لكل 10 سم الطبق) قبالة الأطباق وإضافة لاحتواء 4sU أنبوب فالكون وتخلط جيدا. إزالة وتجاهل المتوسطة المتبقية من الأطباق.
    3. <لى <تطبيق المحتوية 4sU الظهير المتوسطة إلى الأطباق.

نهاية وصفها

  1. إزالة مستنبت خلية من خلايا. إضافة 5 مل من Trizol إلى كل لوحة. لإجراء التجارب المعقدة بما في ذلك نقاط زمنية متعددة أو الظروف، من الأفضل القيام بهذه الخطوة من قبل شخصين، واحد إزالة المتوسطة، والآخر مضيفا Trizol وحصاد المحللة.
  2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلايا كاملة.
  3. استخدام 10 مل ماصة لشطف لوحة بعناية مع Trizol المضافة. وهذا يساعد تحلل الخلية كاملة واسترداد العينة. التعامل مع الرعاية كما Trizol خطرة للغاية عند الحصول على اتصال مع الجلد أو العينين! لديك ترياق للحروق الفينول في متناول اليد (مثل البولي ايثيلين جلايكول 300 أو 400 في حالة معنوية ميثليته الصناعية (70:30)). نقل العينات إلى أنابيب البولي بروبلين. يرجى ملاحظة أن أنابيب فالكون القياسية لا تقاوم هذه القوات ز عالية). ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل حتى الحمض النووي الريبي مجموع طو أعد.

2. إعداد الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول معدلة Trizol

  1. إضافة 1 مل الكلوروفورم (0.2 مل لكل مل Trizol) ويهز بقوة لمدة 15 ثانية. يحضن في درجة حرارة الغرفة 2 - 3 دقيقة.
  2. الطرد المركزي في 13،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. نقل المرحلة العليا مائي (التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) إلى أنبوب جديد 15 مل البولي بروبلين.
  4. إضافة ½ حجم رد فعل كل من الحمض النووي الريبي هطول العازلة والأيزوبروبانول (على سبيل المثال إلى 3 مل طاف إضافة 1.5 مل RNA هطول العازلة و1.5 مل الأيزوبروبانول).
  5. تخلط جيدا. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  6. الطرد المركزي في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  7. تدور باستمرار لفترة وجيزة (5،000 × ز لمدة 30 ثانية) وإزالة الأيزوبروبانول المتبقية مع 200 ميكرولتر ماصة.
  8. إضافة حجم مساو من 75٪ من الإيثانول ويهز الأنبوب حتى يفصل بيليه. تجنب كسرها إلى قطع صغيرة كثيرة لأن هذا قد جعل إزالة ثمالاتL الايثانول صعبا.
  9. الطرد المركزي في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  10. تدور باستمرار لفترة وجيزة RNA وإزالة الإيثانول المتبقية مع ماصة 200 ميكرولتر. كرر الخطوة وإزالة الإيثانول المتبقية مع ماصة 20 ميكرولتر. بعد هاتين الخطوتين، يجب أن يتم تنفيذ أي التجفيف مزيد من بيليه.
  11. إضافة 100 ميكرولتر من H 2 O لكل 100 ميكروغرام RNA العائد المتوقع ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5-6 مرات للمساعدة في حل الحمض النووي الريبي.
  12. حل وتفسد الحمض النووي الريبي عن طريق التسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (شاكر)، ووضع على الفور على الجليد.
  13. قياس الحمض النووي الريبي تركيز في 260 نانومتر باستخدام معمل NanoDrop، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ويمكن تخزين هذا الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.

3. Biotinylation ثيول محددة من الحمض النووي الريبي كتب مؤخرا

  1. ابدأ مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية.
  2. تشكل رد فعل وصفها. ماصة في ما يليالنظام (في الحمض النووي الريبي ميكروغرام):
    1. 1 ميكرولتر العازلة 10X Biotinylation
    2. 7 ميكرولتر الحمض النووي الريبي (RNA يحتوي على 1 ميكروغرام مخففة في nuclease خالية-H 2 O)
    3. 2 ميكرولتر البيوتين HPDP (1 ملغ / مل DMF)

دائما إضافة البيوتين HPDP الماضي وخلط فورا من قبل pipetting. في حالة يترسب البيوتين، ويمكن زيادة محتوى DMF إلى تركيز النهائي من 40٪.

  1. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة مع دوران.
  2. إضافة حجم مساو من كلوروفورم. مزيج بقوة. احتضان لمدة 2 - 3 دقائق حتى تبدأ المراحل لفصل وفقاعات تبدأ تختفي.
  3. الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل بعناية الطبقه المائيه العليا في أنبوب جديد.
  4. كرر الخطوات من 3.4 و 3.5 مرة. قد تحتاج إلى تنفيذ هذه الخطوة في 2 مل المرحلة قفل جل الأنابيب الثقيلة للحد من فقدان الحمض النووي الريبي.
  5. RNA هطول: الوظيفة 1/10 من حجم 5 M كلوريد الصوديوم وحجم مساو منالأيزوبروبانول إلى مرحلة المياه.
  6. الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  7. إضافة حجم مساو من 75٪ من الإيثانول، أجهزة الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
  8. تدور لفترة وجيزة وإزالة الإيثانول المتبقية مع 200 ميكرولتر ماصة.
  9. تدور لفترة وجيزة وإزالة الإيثانول المتبقية مع ماصة 20 ميكرولتر.
  10. لا تسمح الحمض النووي الريبي لتجف. اعادة تعليق في 50-100 ميكرولتر H 2 O (~ 1 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام المدخلات RNA). مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5-6 مرات.
  11. التحقق من جودة RNA عن طريق التحليل electrophoretical لاستبعاد تدهور الحمض النووي الريبي.

4. نقطة لطخة تحليل 4sU التأسيس (اختياري)

دمج 4sU يمكن تحديد بسهولة عن طريق تحليل لطخة نقطة من الحمض النووي الريبي البيروكسيديز. هذه خطوة اختيارية التي تسمح الخلل وتقدير معدلات التأسيس 4sU نسبة إلى الحمض النووي المعقدة البيروكسيديز التحكم بنسبة ضئيلة. لهذا الاختبار نحن صecommend باستخدام iodoacetyl-البيوتين بدلا من البيوتين HPDP لbiotinylation من الحمض النووي الريبي 4sU المسمى في الخطوة 3.2. هذه النتائج في biotinylation لا رجعة فيه 4sU-RNA. لذلك، على أساس أساليب عمود (على سبيل المثال RNeasy) يمكن استخدامها لاسترداد المبالغ أصغر بكثير من الحمض النووي الريبي البيروكسيديز (مثلا 5 ميكروغرام). بينما البيروكسيديز الحمض النووي الريبي باستخدام البيوتين HPDP هو أيضا مناسبة لهذا الاختبار، وإشارة الناتج هو أضعف ونسبة الإشارة للضجيج أقل مواتاة (الشكل 3).

  1. اتبع بروتوكول لل4sU وضع العلامات وعزل الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية كما هو موضح في المقاطع 1 و 2.
  2. Biotinylate 4sU المسمى RNA كما هو موضح في القسم 3 استبدال البيوتين HPDP مع iodoacetyl-البيوتين وأداء اثنين من كلوروفورم الاستخراج المفرط لإزالة بقايا iodoacetyl-البيوتين.
  3. استرداد RNA المعقدة البيروكسيديز بواسطة الأيزوبروبانول / الإيثانول هطول كما هو موضح أو باستخدام النهج القائم على عمود (على سبيل المثال RNeasy) في حالة كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي (<10 ميكروغرام) وتستخدم.
  4. احتضان الغشاء زيتا في nuclease خالية من المياه مع هزاز لمدة 10 دقيقة.
  5. اتخاذ غشاء من الماء nuclease خالية وإزالة السوائل المفرط عن طريق وضع الغشاء في بين اثنين من المناشف الورقية النظيفة والضغط بقوة. تجفيف الهواء والغشاء لمدة 5 دقائق يؤدي إلى النقاط أجمل.
  6. لكل عينة، وإعداد 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي 200 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام الثلج نقطة لطخة العازلة ملزمة الباردة (10 ملي هيدروكسيد الصوديوم، 1 ملم EDTA). تطبيق 5 ميكرولتر من هذا التخفيف (أي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي)، فضلا عن ثلاثة التخفيفات 10 أضعاف اللاحقة (أي 100، 10، و 1 نانوغرام الحمض النووي الريبي، على التوالي) إلى غشاء زيتا بواسطة pipetting. pipetting لمن خلال رف فارغ من نصائح ماصة يمكن استخدامها لتوفير تباعد موزعة بالتساوي. بدلا من ذلك، استخدام جهاز لطخة نقطة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  7. تطبيق 5 ميكرولتر من الحمض النووي بنسبة ضئيلة البيوتين المسمى بتركيزات تتراوح من 20 نانوغرام / ميكرولتر إلى 20 جزء من الغرام / ميكرولتر (أي 100-،1 نانوغرام بنسبة ضئيلة) بوصفها تابع إيجابيةرول إلى الغشاء قبل pipetting. استخدام البيروكسيديز، عينة 4sU-السذاجة والسيطرة السلبية.
  8. الهواء الجاف الغشاء لمدة 5 دقائق.
  9. احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في 40 مل عازلة تمنع مع هزاز.
  10. احتضان الغشاء مع 10 مل من 1:1،000 streptavidin الفجل البيروكسيداز-لمدة 15 دقيقة (5 مل PBS + 5 مل 20٪ SDS + 10 ميكرولتر streptavidin الفجل البيروكسيداز-)
  11. غسل غشاء مرتين في 40 مل PBS + 10٪ SDS (20 مل PBS + 20 مل 20٪ SDS) لمدة 5 دقائق.
  12. غسل غشاء مرتين في 40 مل PBS + 1٪ SDS (38 مل PBS + 2 مل 20٪ SDS) لمدة 5 دقائق.
  13. غسل غشاء مرتين في 40 مل PBS + 0.1٪ SDS (40 مل PBS + 200 ميكرولتر 20٪ SDS) لمدة 5 دقائق.
  14. إزالة السائل الزائد عن طريق وضع الغشاء في بين اثنين من المناشف الورقية النظيفة والضغط عليها بقوة.
  15. تصور HRP غشاء محدد باستخدام ECL فقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  16. وضع غشاء في احباط البلاستيك / كيس، وإزالة فقاعات الهواء، واحتضان لمدة 2 دقيقة في الظلام.
  17. فضح الغشاء لفيلم عن 1-5 دقائق.

5. فصل الحمض النووي الريبي وصفت والخالي من الملصقات باستخدام الخرز المغناطيسي Streptavidin المغلفة

  1. حرارة غسل العازلة (3 مل لكل عينة) إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. إعداد الطازجة 100 ملي dithiothreitol (DTT) في nuclease خالية-H 2 O. القيام بذلك عن طريق الصب 15 - 30 ملغ من مسحوق DTT في نظيفة أنبوب 50 مل الصقر وضعت على نطاق وغاية في الدقة. وزن وإضافة المبلغ المطلوب من nuclease خالية-H 2 O.
  3. البيروكسيديز حرارة عينات الحمض النووي الريبي إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفسد والمكان فورا على الجليد.
  4. مكان μMacs الأعمدة في الوقوف المغناطيسي. ونحن نوصي بعدم معالجة أكثر من 12 عينة في وقت واحد (6-8 عينات هي الأمثل).
  5. أعمدة Miltenyi قبل تتوازن مع 1 مل درجة حرارة الغرفة غسل العازلة. هذا سوف يستغرق حوالي 15 دقيقة.
  6. وفي الوقت نفسه، إضافة 100 ميكرولتر من الخرز streptavidin إلى 50-100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البيروكسيديز. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع التناوب.
    7. < لى> إذا كان أي من الأعمدة لم يشرع استنزاف حتى الآن هذا يمكن تيسيره عن طريق الضغط بلطف على الجزء العلوي من العمود مع إصبع القفاز. مرة واحدة وقد بدأ تدفق الأعمدة استنزاف بسهولة.
  7. تطبيق RNA / حبات إلى الأعمدة. تجاهل التدفق من خلال إلا إذا كنت تريد استرداد جزء الحمض النووي الريبي الخالي من الملصقات (انظر القسم 7).
  8. يغسل ثلاث مرات مع 0.9 مل من 65 درجة مئوية العازلة غسل (1 مل ماصة نصائح يتقلص عندما pipetting لمخازن عند 65 درجة مئوية).
  9. يغسل ثلاث مرات مع 0.9 مل درجة حرارة الغرفة غسل العازلة.
  10. ماصة 700 ميكرولتر RLT العازلة (RNeasy MinElute كيت تنظيف، QIAGEN) في 2 مل أنابيب جديدة ووضعها تحت الأعمدة.
  11. أزل الحمض النووي الريبي المحولة حديثا في المخزن المؤقت RLT عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي DTT إلى الأعمدة.
  12. إجراء الجولة الثانية شطف 3 دقائق في وقت لاحق في نفس أنبوب عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من آخر 100 DTT ملي.

6. الانتعاش من الحمض النووي الريبي كتب مؤخرا

ontent "> متابعة مع تنظيف MinElute RNeasy (QIAGEN) بروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أزل في 25 H 2 O. تركيزات الحمض النووي الريبي قياس nuclease خالية ميكرولتر باستخدام معمل NanoDrop. لتجنب الحاجة إلى ذوبان الجليد وإعادة تجميد الحمض النووي الريبي قبل تقديم لفحص عالية الإنتاجية، ونحن نوصي إعداد [كدنا] مباشرة بعد RNA المحولة حديثا يتم تنقيته. استخدام 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا في 20 ميكرولتر مزيج التوليف [كدنا] لتخليق [كدنا] باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تنفيذ ضوابط QRT-PCR باستخدام 1 : 10 التخفيفات من مزيج [كدنا] مخزن الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.

7. انتعاش غير المسماة، غير منضم RNA (اختياري)

في حالة غير منضم RNA يحتاج إلى أن تعافى، وجمع والجمع بين التدفق من خلال (بعد إضافة حبات حل RNA-streptavidin إلى الأعمدة)، وغسل أول لهطول اللاحقة. وعادة ما يكفي لترسيب 50٪ فقط من الحمض النووي الريبي غير منضم كما ثيو سوف تحتوي على> 80٪ من المواد ابتداء.

  1. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول (لا يحتاج إلى الملح تضاف باعتبارها منطقة عازلة غسل يحتوي بالفعل على 1 M كلوريد الصوديوم).
  2. الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  3. إضافة حجم مساو من 75٪ من الإيثانول، أجهزة الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
  4. تدور لفترة وجيزة وإزالة الإيثانول المتبقية مع 200 ميكرولتر ماصة.
  5. تدور لفترة وجيزة وإزالة الإيثانول المتبقية مع ماصة 20 ميكرولتر.
  6. لا تسمح الحمض النووي الريبي لتجف. Resuspend في 100 ميكرولتر H 2 O. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5-6 مرات. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز ونقل مباشرة إلى جليد.
  7. التحقق من جودة RNA عن طريق التحليل electrophoretical لاستبعاد تدهور الحمض النووي الريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

1. انطلاق مادة وعائدات المتوقعة

بعد 1 ساعة (HR) من 4sU التعرض RNA المحولة حديثا يمثل حوالي 1-4٪ من مجموع RNA الخلوية. هذا وسوف يكون أقل في الخلايا اعتقال النمو لأنها لم تعد توليف الحمض النووي الريبي لحساب لنمو الخلايا / النسخ المتماثل. عندما وصفها لمدة 1 ساعة، نوصي ببدء الفحص مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. بدءا من أقل من 30 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع النتائج في الكريات الحمض النووي الري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا يعزز بشكل كبير من قوة تكنولوجيات عالية الإنتاجية مثل ميكروأرس وRNA وما يليها من خلال توفير قوالب أكثر ملاءمة لمعالجة هذه المسألة البيولوجية من الفائدة. خضع هذا البروتوكول الأمثل واسعة النطاق. لأنها تتيح تخصيب> 1،000 أضعاف من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا ويوفر نتائج استنساخه للغاية.

التصميم التجريبي من تجربة 4sU الجغرافية يتسم بأهمية حاسمة كما RNA ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

ونود أن نشكر إيمي ريغان لقراءة متأنية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل NGFN زائد منحة # 01GS0801، MRC زمالة منحة G1002523 وNHSBT منحة WP11-05 إلى LD وDFG منحة FR2938/1-1 إلى CCF

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-ثيوريدينكربوسينثT4509تحضير مخزون 50 ملي مولار في H2< / sub>O معقم ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C في الحصص من 50-500 & ل ، تجاهل الكاشف غير المستخدم ، لا تعيد التجميد.
TrizolInvitrogen15596026 (100 مل) ، 15596018 (200 مل)<قوي >تحذير - تآكل وخطير على الصحة!< / قوي> ضمان الوصول الفوري إلى ترياق الفينول (PEG-Methanol) ؛ يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الكلوروفورمسيجما372978<قوي >تحذير - خطير على الصحة < / قوي >
الأيزوبروبانولسيجما650447< م >< / م >
سترات الصوديوم ، خالية من النوكليازSigmaC8532قم بإعداد محلول مخزون 1.6 متر باستخدام ماء خال من النوكلياز.
5M خالية من النوكلياز NaClSigma71386محلول مخزون
خال من Nuclease H2< / sub>OSigmaW4502اصنع 1 مل من الحصص في أنابيب خالية من النوكلياز.
مخزن هطول1.2 M كلوريد الصوديوم ، 0.8 M سترات الصوديوم في الماء الخالي من النوكلياز. استعد مسبقا في ظل ظروف خالية تماما من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في 50 مل من أنابيب الصقر.
459844 الإيثانولسيجمااستخدمه مع الماء الخالي من النوكلياز لتحضير 80٪ من الإيثانول ، ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
1 M Tris Cl خال من النوكلياز ، درجة الحموضة 7.5Lonza51237محلول مخزون
500 ملي مولار EDTA خال من النوكلياز ، درجة الحموضة 8.0Invitrogen15575-020محلول مخزون
10x عازلة البيوتينيل (BB)100 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي مولار EDTA في ماء خال من النوكلياز ، قم بعمل حصات من 1 مل.
ثنائي ميثيل فورماميد (DMF)سيجماD4551
EZ-Link البيوتين-HPDPبيرس21341تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق إذابة 50 مجم من البيوتين HPDP في 50 مل DMF. الاحترار اللطيف يعزز الذوبان. يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C في حصصات 1 مل.
قفل المرحلة أنابيب ثقيلة 2.0 ملEppendorf0032 005.152اختياري لخطوة استخراج الكلوروفورم.
غشاء زيتاBIORAD162-0153
10x نقطة لطخة ملزمة100 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 10 ملي مولار EDTA
Biotin-oligo5'-biotin ، 25 نيوكليوتيد ، أي تسلسل
كبريتات دوديسيل الصوديومفيشرBPE9738للحصول على 100 مل 20٪ محلول مخزون ، أضف 20 جم SDS إلى 80 مل PBS درجة الحموضة 7-8 واضبط الحجم على 100 مل. حافظ على جميع محاليل SDS عالية النسبة أعلى من 20 درجة مئوية دافئة الحلول قليلا سوفت [سدس] يتربط.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق إذابة 50 مجم يودوأسيتيل بيوتين في 50 مل DMF. الاحترار اللطيف يعزز الذوبان. يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C في حصصات 1 مل. يولد بيوتينيل لا رجعة فيه وخاص بالثيول.
ملحي للفوسفاتGibco10010-015
مؤقتامزج 20 مل 20٪ SDS مع 20 مل 1 × PBS درجة الحموضة 7-8 وأضف EDTA إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملليمتر.
ستربتافيدين - الفجل الحار بيروكسيداز Vector LaboratoriesSA5004يحفظ عند -20 درجة مئوية ، امزج 10 مل 20٪ SDS مع 10 مل 1 × PBS. أضف 20 مو ؛ ل ستربتافيدين-HRP قبل الاستخدام.
كاشف ECLRNP2109GE Healthcareاستخدم باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
سوبر RX ، فيلم XRA ، 18x24 سمفوجي فيلم47410 19236
& mu ؛ ماك Streptavidin KitMiltenyi130-074-101قم بتخزين الخرز في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
توين 20سيجماP1379
مخزن مؤقتللغسيل 100 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي EDTA ، 1 م كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ توين 20 في H 2< / sub>O.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817قم بإعداد 100 ملي مولار DTT في H2< / sub >O الخالي من النوكلياز ، قم دائما بالتحضير الطازج قبل الاستخدام.
RNeasy MinElute KitQiagen74204تخزين الأعمدة عند 4 درجات ؛ C ، المكونات المتبقية من المجموعة في درجة حرارة الغرفة.
1.5 مل أنابيب بولي بروبيلينSarstedt72.692.005متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد
2.0 مل أنابيب البولي بروبيلين اللولبيةSarstedt72.694.005متوافق مع أنابيب ثنائي ميثيل فورماميد
15 ملBDFalcon 352096متوافق مع أنابيب ثنائي ميثيل فورماميد
50 مل BDFalcon352070متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد
يجب تخزين جميع المحاليل / الكواشف في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
< > قوي معدات < / قوي >
الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / المرئيةThermo ScientificNanoDrop 1000أو ما يعادله. استخدم حجما منخفضا (1-2 & mu; ل) لقياسات تركيزات الحمض النووي الريبي المنخفضة لتجنب الفقدان المفرط للعينة.
أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين 15 ملVWR International525-0153على عكس الأنابيب القياسية سعة 15 مل ، فإن هذه الأنابيب تتسامح مع ما يصل إلى 15,000 &# 215 ؛ g
أجهزة طرد مركزي عالية السرعةBeckman CoulterAvanti J-25أو ما يعادلها من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000 & # 215 ؛ ز
الدوار عالي السرعةBeckman CoulterJLA-16250أو ما يعادله من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000 & # 215 ؛ ز
محولات لأنابيب 15 ملLaborger&# 228; te Beranek356964أو ما يعادلها من المعدات القادرة على الوصول إلى 13,000&# 215; ز
جهاز طرد مركزي مبرد على سطح الطاولةEppendorf5430 Rأو ما يعادله.
ThermomixerEppendorfThermomixer مدمجأو ما يعادله.
حامل مغناطيسيMiltenyi Biotec130-042-109حامل واحد يحمل 8 & mu ؛ أعمدة Macs.
منحة حمام مائيSUB Aqua 5أو ما يعادلها.
مقياس فائق الدقةA & DGR-202أو ما يعادلها.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKللهلام RNA ؛ أو ما يعادلها.
E-Gel EX 1٪ agarose جل مسبقة الصبInvitrogenG4020-01للهلام RNA ؛ أو ما يعادله.
الأمطار RNA جل محلول مخزن لحجب اللطخة النقطية لولبية مقياس

المراجع

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

معالجة الحمض النووي الريبوزيتحلل الحمض النووي الريبوزيوسم 4-ثيوريدينالبيوتينية المتخصصة في الثيولحبيبات الستريبتاديفين المغناطيسيةتنقية الحمض النووي الريبوزي المنسوخ حديثاًتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقيتسلسل الجيل القادم
وصفها الأيضية من الحمض النووي الريبي كتب حديثا للدقة عالية التنميط التعبير الجيني من تخليق الحمض النووي الريبي، ومعالجة تسوس في خلية ثقافة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.