يتم استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتقييم سلوك الخلايا الظهارية الثديية سابق للورم الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من خطر الاصابة بسرطان الثدي لتحديد ما إذا كانت هناك علاقة بين المعايير السلوكية والآفات الجينية المحددة متميزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لمقارنة سلوك الخلايا الثديية الأولية مثقف سابق للورم الظهارة المستمدة من نماذج مختلفة الماوس المعدلة وراثيا للإصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كميا الوقت بين انقسامات الخلية (أعمار الخلية)، وأرقام الخلية أفكارك، وتطور التغيرات المورفولوجية، وآلية تشكيل مستعمرة ومقارنة في خلايا تحمل آفات جينية محددة. وتولد انتخابات الثديية الثقافات من الخلايا الظهارية ورم الغدد الثديية دون اضح. ومقطوعة بعناية الغدد مع فصل واضح من العضلات المجاورة، تتم إزالة الغدد الليمفاوية، ويتم إنشاؤها وحيدة الخلية تعليق من الخلايا الظهارية الثديية المخصب من الأنسجة الثديية تنميق تليها التفكك الأنزيمية والترشيح. ومطلي وحيدة الخلية المعلقات وضعها مباشرة تحت المجهر داخل غرفة حاضنة للخلايا الحية التصوير. ستة عشر 650 ميكرومتر ميكرومتر X حقول 700 في تكوين 4X4 من كل ثوالتقط الذراع من لوحة 6 جيدا كل 15 دقيقة لمدة 5 أيام. يتم فحص الوقت الفاصل بين الصور مباشرة لقياس السلوكيات الخلوية التي يمكن أن تشمل آلية وتواتر تشكيل خلية داخل مستعمرة على مدار 24 ساعة الأولى من الطلاء الخلايا (التجميع مقابل تكاثر الخلايا)، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص من تغيرات شكلية. يتم استخدام وحيدة الخلية تتبع لتوليد خرائط مصير الخلية لقياس أعمار الخلايا الفردية والتحقيق في أنماط انقسام الخلايا. ويتم تحليل البيانات الكمية إحصائية لتقييم للفروق ذات دلالة إحصائية في السلوك يرتبط الآفات الجينية المحددة.
المقدمة
نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات لدراسة وفهم كيفية آفات جينية مختلفة تسهم في خطر الاصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، أظهرت الفئران المعدلة وراثيا أن الجمع بين ثلاثة عوامل هي: فقدان الثدي كامل طول السرطان 1، بداية مبكرة (BRCA1) الجينات في الخلايا الظهارية الثديية، ورم P53 البروتين (TP53) الجرثومية الخط haploinsufficiency، والثدي الظهارية خلية مستهدفة حتى التنظيم ألفا الاستروجين مستقبلات النتائج التعبير (ERA) في تطوير سرطان الثدي في 100٪ من floxed BRCA1) و (فيروس الورم 11/f11/Mouse الثديية (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( تيت-OP) -ER/MMTV-reverse التتراسيكلين transactivator (الفئران ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مخطط العام
- توليد الثقافات الأولية من الخلايا preneoplastic الظهارية الثديية من الغدد الثديية من المهندسة وراثيا والتحكم من النوع البري الفئران.
- التقاط الصور الحية خلية كل 15 دقيقة باستخدام برنامج Volocity الحصول على الصور (الإصدار 5.3.1، PerkinElmer، التايم، MA) لمدة تصل إلى 5 أيام.
- عرض الوقت الفاصل بين الصور مباشرة لتقييم توقيت وآلية الخلية الظهارية تشكيل مستعمرة، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص التدريجي من التغيرات الشكلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويمكن تمييز الخلايا الظهارية والخلايا الليفية من شكل الخلية. الخلايا الظهارية لها شكل مكعبي الشكل (الشكل 1A-B) والمستعمرات الخلية شكل (الشكل 1A). الخلايا الليفية، وهو نوع من الخلايا اللحمية، لها مورفولوجيا ممدود (الشكل 1C).
تم تقريب الخلايا والعائمة في بداية التصوير (الشكل 2A-D). بعد الحجز على لوحة مسطحة وأصبحوا أظهرت ظهور مكعبي الشكل من نوع
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة
من المهم للتأكد من أن يتم حصاد الغدد الثديية من الفئران من نفس العمر للتحكم عن التقلبات المرتبطة بالعمر في الخلايا الظهارية الثديية السلوك. عندما الخلايا تصفيح، ينبغي مطلي نفس العدد من الخلايا في كل بئر لكل تجربة. يجب أن تكون الخلايا متفرق نسبيا عند الطلاء المعدني بحيث لا تصبح الثقافات متموجة بسرعة كبيرة جدا مما يجعل من الممكن لمتابعة الخلايا الفردية متعددة من خلال الصور التسلسلية. من الضروري أن تكون.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
شكر وتقدير
الكتاب أود أن أشكر BOFAN وو وRaithel المسيحية للمساعدة التقنية وريجر مايكل على عرضه لخلية الحية التصوير. بدعم من NCI، NIH RO1CA112176 (PAF)، NCI، NIH. R01CA89041-10S1 (PAF)، الألمانية Akademischer Austaush DIENST فولت A/09/72227 المرجع. 316 (REN)، وزارة الدفاع W81XWH-11-1-0074 (REN)، WCU (الدرجة العالم جامعة) البرنامج من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (R31-10069) (PAF )، NIH IG20 RR025828-01 (مرفق معدات القوارض الجدار)، والمعاهد الوطنية للصحة NCI 5P30CA051008 (الميكروسكوب والتصوير والثروة الحيوانية المشتركة).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| EpiCult-B ماوس متوسطة بصل | StemCell تكنولوجيا | 05610 | |
| EpiCult-B ماوس انتشار المكملات | StemCell تكنولوجيا | 05612 | |
| المؤتلف الإنسان عامل نمو البشرة (rhEGF) | StemCell تكنولوجيا | 02633 | |
| كولاجيناز / هيالورونيداز | StemCell تكنولوجيا | 07912 | |
| يمكن التخلص منها Scapels | ريشة | # 2975 10 | |
| هانكس "محلول ملحي متوازن | StemCell تكنولوجيا | 37150 | |
| Ammonium كلوريد | StemCell تكنولوجيا | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell تكنولوجيا | 07901 | |
| Dispase | StemCell تكنولوجيا | 07913 | |
| الدناز I | StemCell تكنولوجيا | 07900 | |
| 40 ميكرومتر مصفاة الخلية | StemCell تكنولوجيا | 27305 | |
| FBS | StemCell تكنولوجيا | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
المراجع
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
