يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133

21K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50200

⸱

مارس 13, 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة إعداد الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا في سرطان الجلد الثقافات الخلية الأولية، وكيفية إزالة التلوث من الكريات الحمراء والخلايا الليفية من الخلايا السرطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية CD133 + الجذعية خلايا سرطان الجلد المفترضة من CD133 - معظم المغناطيسي باستخدام الفرز الخلية المنشط (MACS).

الملخص

على الرغم من خيارات العلاج لسرطان الجلد تحسين المتاحة اليوم، المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد الخبيث متقدمة لا تزال لديها بسوء التشخيص من أجل البقاء خالية من التقدم والشاملة. ولذلك، والبحث متعدية في حاجة إلى توفير مزيد من الأدلة الجزيئية لتحسين العلاجات المستهدفة لالميلانينية الخبيثة. في الآليات، أنكجنيك الماضية المتعلقة سرطان الجلد وتمت دراسة على نطاق واسع في خطوط الخلايا الراسخة. في الطريق إلى نظم العلاج أكثر تخصيصا على أساس مواصفات جينية الفردية، نقترح استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بدلا من خطوط الخلايا عامة. جنبا إلى جنب مع بيانات عالية الجودة السريرية، وخصوصا على المريض المتابعة، فإن هذه الخلايا تكون مفيدة لفهم أفضل للآليات الجزيئية وراء تطور سرطان الجلد.

هنا، ونحن التقرير إنشاء الثقافات سرطان الجلد الأولي من تشريح أنسجة الورم الطازجة. يتضمن هذا الإجراء تنميق وتفكك النسيج إلى خلايا واحدة، وإعادةmoval من التلوث والخلايا الليفية مع كرات الدم الحمراء وكذلك الثقافة الابتدائية والتحقق بصورة موثوق بها من أصل سرطان الجلد الخلايا.

كشفت تقارير حديثة أن الميلانينية، مثل معظم الأورام، الميناء جزء من السكان صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والذي يبدو لتغذية حصرا بدء الورم والتقدم نحو الدولة النقيلي. واحدة من علامات رئيسية لتحديد CSC والعزلة في سرطان الجلد هو CD133. CD133 + لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الجلد الثقافات الأولية، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) الإجراء من Miltenyi مما أدى إلى نقاء عالية والفرز CD133 + صلاحية الخلايا الجذعية السرطانية وCD133 - السائبة، والتي يمكن زراعتها وتحليلها وظيفيا بعد ذلك.

المقدمة

الميلانينية الخبيثة الجلدية هي نوع أقل شيوعا، ولكن القاتل من سرطان الجلد الأكثر. نتيجة لتزايد، ودرجة عالية من الخباثة والانتشار السريع، الميلانينية تمثل الآن 75٪ من الأورام الخبيثة الجلد الوفيات المرتبطة 1،2. وبالاضافة الى الاستئصال الجراحي للورم الأولية، والعلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي، العلاج المناعي الكيميائي ومجتمعة والعلاج المناعي للسرطان الجلد انتشر هي الاستراتيجيات للدولة من بين الفن للعلاج سرطان الجلد 3،4. ومع ذلك، يتميز سرطان الجلد الخبيث من ضعف الاستجابة لمبحث المعالجة الكيميائية (5-12٪) 5،6، وتلك فقط 50-70٪ من مرضى سرطان الجلد يحمل الجين V600E BRAF فائدة من طفرة جديدة واعدة لعلاج العلاجات المستهدفة مع 7 لvemurafenib تحسين البقاء على قيد الحياة عموما، هناك حاجة إلى فهم أفضل بكثير لآليات تكون الأورام سرطان الجلد.

لدراسة هذه الآليات في الماضي تسويقية راسخة،واستخدمت خطوط الخلايا المتاحة cially. نهج أكثر حداثة لدراسة الأحداث الجزيئية للسرطان والتقدم بدء استخدام الثقافات الأولية المستمدة مباشرة من أنسجة الورم - وهي فوائد متعددة تحمل استراتيجية: وقد قام الباحث السيطرة الكاملة على المريض واختيار الأنسجة. الخلايا عينات أنسجة الورم المكتسبة من اختيار بخبرة، تشبه الورم مع عدم التجانس في جميع ومتابعة البيانات للمريض والأمراض مفصلة متاح للسماح مقارنة خصائص الثقافة مع تلك الورم الأصلي 8.

في المقابل، ويناقش استخدام خطوط الخلايا على النحو المنصوص عليه في الأنظمة ذات الصلة نموذج أبحاث السرطان للجدل. بالفعل في عام 1987 وصف أوسبورن وزملاء الاختلافات البيولوجية بين كبير MCF-7 خطوط الإنسان خلايا سرطان الثدي من مختبرات مختلفة 9. كان هذا عدم الاستقرار الجيني واسعة والاختلاف في التعبير RNA المشترك خلال ثقافة فرعيةnfirmed من Hiorns وآخرون، وقدمت بيانات داعمة لدليل على أن خطوط الخلايا لم تتطور في الثقافة، مما يضعف أهمية مباشرة لمثل هذه الثقافات التي أنشئت كنماذج لسرطان الإنسان 10.

وهناك اعتبار آخر مهم، التي تم تجاهلها إلى حد كبير على مر السنين، هو خطر التلوث أو فرط نمو الخلايا لا علاقة لها مع الثقافات 'كاذبة'، والتي تم تسليط الضوء الأول على عشرين عاما من خلال إظهار أن كانت ملوثة عدد كبير من خطوط الخلايا بواسطة هيلا الخلايا 8،11. لقد حان سوء تفسير البيانات من 'كاذبة' خطوط الخلايا مؤخرا إلى النور في الأدب مرة أخرى. باستخدام مزيج من التنميط الحمض النووي علم الوراثة الخلوية الجزيئية وكشف ماكلويد وآخرون أن الورم من 252 الجديدة المستمدة من خطوط الخلايا البشرية المودعة لدى مجموعة الألمانية الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSMZ)، تم العثور على ما يقرب من 18٪ لتكون إختلافات بين الأنواع أو بين الأنواع عبر 12،13-الملوثات.

لتجنب هذه المشاكل، والاستفادة من المزايا المذكورة أعلاه، قررنا إنشاء المنخفضة مرور خطوط الخلايا سرطان الجلد من الانبثاث رفعه حديثا.

فصل الخلايا قوية وتقنيات التحليل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير البروتينات السطحية مميزة. A صك الفوق للالتفكك الآلي من الأنسجة إلى وحيدة الخلية تعليق هو Dissociator gentleMACS المصنعة من قبل Miltenyi. عندما تستخدم بالاقتران مع gentleMACS C أنابيب والحلول الأمثل التفكك، والتفكك فعالة ورقيقة من نسيج الورم في نظام مغلق ويتحقق مع الحفاظ على الحواتم مستضد والحد من فقدان الخلية. الصك يوفر الأمثل، برامج محددة مسبقا لمجموعة متنوعة من تطبيقات محددة وضمانات موحدة من إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة سرطان الجلد 14.

<ف الطبقة = "jove_content"> كشفت التقارير الأخيرة أن غالبية أورام تؤوي جزء من السكان صغيرة من ما يسمى الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر بشكل حصري للورم والبدء الذاتي تجديد القدرات. أدى تحديد الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية التي تنتج في الأدمة من الجلد إلى الفرضية القائلة بأن هذه الخلايا قد يكون منشأ الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في سرطان الجلد منذ التعرض للإشعاع UVA يستطيع رئيس هذه الخلايا للتحول الخبيث 15. ونتيجة لهذه الآفة الوراثية تكون الخلايا التي تؤوي مجموعة من الورم وخصائص الخلايا الجذعية.

واحدة من علامات الرئيسية المقترحة لتمثيل الخلايا الجذعية السرطانية في حيوانية سرطان الجلد هو CD133 16-20. وأعرب عن CD133 (المعروف أيضا باسم Prominin 1)، وهو عضو في البروتينات السكرية عبر الغشاء pentaspan، في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا البطانية السلف، الخلايا الجذعية العصبية والدبقية 21-23. ويرتبط التعبير عن CD133 معوقد تبين انقسام الخلية غير المتماثلة 24، وحاتمة الغليكوزيلاتي من CD133 أن تكون downregulated على تمايز الخلايا 25. مؤخرا، تم عرض CD133 + خلايا سرطان الجلد أن يكون التجديد الذاتي والقدرة الورم بدء 19،20.

لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية السرطانية CD133 + المفترضة سرطان الجلد، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) من نظام التكنولوجيا الحيوية Miltenyi للحصول على السكان وقابلة للحياة عالي التخصيب من CD133 + وCD133 - الخلايا.

الفصل المغناطيسي خلية حبة القائم يسمح لأي اختيار سلبية كما يتضح من ماثيو وآخرون. اختيار 26 أو إيجابية كما نعرض هنا. أثناء اختيار إيجابية هو المسمى مغناطيسيا الخلية المستهدفة خاصة النوع، على سبيل المثال CD133 الخلايا معربا عن، مع، MicroBeads الجسيمات superparamagnetic 50-نانومتر التي هي الأجسام المضادة لمترافق محددة للغاية ضدخاصة مستضد الخلايا السطحية. خلال الفصل، يتم الاحتفاظ الخلايا المسمى مغناطيسيا داخل العمود في المجال المغناطيسي للفاصل، في حين الخلايا غير المسماة تتدفق من خلال. بعد غسل الخطوات، تتم إزالة العمود من المجال المغناطيسي للفاصل، ومزال الخلايا المستهدفة من العمود. وLS أو الأعمدة التي استخدمت خلال MS نتيجة إيجابية في اختيار أجزاء من خلايا وصفت والخالي من الملصقات مع نقاء عالية. من ناحية أخرى، والأعمدة LD، وتستخدم لاختيار سلبية، تؤدي إلى نقاء أقل قليلا من نسبة المسمى. نظرا لكثافة التعبئة من مصفوفة على معدل التدفق في هذه الأعمدة أقل مما أدى إلى ارتفاع خطر الخلايا غير المسماة إلى أن المحاصرين في العمود. ولذلك ينبغي أن تستخدم الأعمدة LD فقط لاستنزاف الصارمة لخلية حيوانية غير المرغوب فيها. لا يمكن أن يؤديها اختيار وضع العلامات الإيجابية التي المغناطيسي المباشر (الضد بالإضافة إلى MicroBeads) أو غير مباشر (مع MicroBeads الحضانة بعد incubatioن مع الأجسام المضادة الأولية). MACS MicroBeads محددة متاحة للاختيار من أنواع الخلايا إيجابية عديدة من الخلايا السرطانية الأولية مثل البروستاتا أو سرطان الجلد 27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الخطة الشاملة للتجربة بما في ذلك إعداد الخلايا الأولية واحد من أنسجة الورم، وتوصيف للثقافة الخلية الأولية، واستنفاد الخلايا الليفية والفرز المغناطيسي CD133 + خلية من خلايا وCD133 - يظهر خلايا سرطان الجلد في الشكل 1.

1. عينة اكتساب

  1. تحقق من وجود الموافقة الأخلاقية قبل النظر في الخطوات التالية.
  2. إعداد أنبوب 50 مل العقيمة مع PBS تستكمل مع تركيز البنسلين الستربتوميسين-1٪ النهائية وتسليم لعملية جراحية أو الفريق.
  3. تنظيم النقل السريع للأنسجة الورم من عملية جراحية لزراعة الخلايا في المختبر C. ° 4

2. إعداد الميلانوما أساسي واحد من خلايا أنسجة الورم

  1. تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة.
  2. قبل الإستئصال للورم، ويحتاج المرء لإعداد مزيج التفكك. مطلوب 10 مل لكل مزيج التفكك الأنسجة ز 2-4. ويمكن استخدام هذا المزيج immediately أو تخزينها في 10 مليلتر مأخوذة في -20 ° C لاستخدامها لاحقا.
    1. إعداد محلول يحتوي على 150 ملم كلوريد الصوديوم. خلط باستخدام الدوامة إلى أن الحل واضح. إذا لزم الأمر كلوريد الصوديوم العقيمة، الترشيح باستخدام فلتر حل ميكرون 0.22.
    2. تزن من الدناز I وإعداد محلول يحتوي على 10 ملغ / مل الدناز I في كلوريد الصوديوم 150mM. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح.
    3. إعداد محلول يحتوي على 100mg/ml كولاجيناز الرابع في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح. ويمكن تخزين مأخوذة من حل كولاجيناز في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
    4. إعداد مزيج التفكك مع تركيز النهائي من 1٪ البنسلين الستربتوميسين،، 1 ملغ / مل IV كولاجيناز و 0.1 ملغ / مل الدناز I في المتوسط ​​263 الكم. خلط باستخدام الدوامة. اختياري: عند استخدام الأنسجة المستمدة من سرطان الجلد الجلد إضافة إلى حل B الامفوتريسين المزيج التفكك إلى تركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B.
  3. قبل الدافئة للمساuired كميات من مزيج التفكك، وPBS الكم المتوسطة 263 حتي 37 ° C.
  4. المكان أنسجة الورم على طبق بتري معقمة. نضح حل المفرط من النسيج وإضافة 500 ميكرولتر مزيج التفكك. اللحم المفروم الورم إلى أجزاء صغيرة من 2-4 مم باستخدام الطازجة والمشارط العقيمة.
  5. نقل مفروم 2-4 ز أنسجة الورم في أنبوب C gentleMACS تحتوي على 5 مل مزيج التفكك. شطف طبق بتري مع مزيج إضافية 4،5 مل التفكك وإضافة شظايا الأنسجة المتبقية إلى أنبوب C gentleMACS.
  6. إغلاق أنبوب gentleMACS C ونعلق عليه رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS. تشغيل برنامج gentleMACS "h_tumor_01".
  7. فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة .
  8. إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم رانه gentleMACS Dissociator وتشغيل البرنامج gentleMACS "h_tumor_02".
  9. فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة .
  10. إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS وتشغيل البرنامج gentleMACS "h_tumor_03".
  11. فصل أنبوب C gentleMACS من العينة، dissociator إعادة تعليق وتطبيق التعليق الخلية إلى خلية مصفاة ميكرومتر 70 وضعت على أنبوب 50 مل. إذا انسداد الفلتر يحدث، وإثارة التعليق الخلية مع تلميح مرشح معقمة حتى التعليق الكامل من خلال ركض.
  12. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل المتوسطة الكم 263.
  13. اختياري: إذا كنت لا تزال شظايا الأنسجة المتبقية في شظايا، فلتر resuspend في المتوسط ​​263 الكم والبذور منهم في ديس خلية ثقافة المناسبةح. احتضان عند 37 درجة شظايا C و 5٪ CO 2.
  14. تجاهل مصفاة الخلية وإغلاق أنبوب 50 مل مع التعليق الخلية هضمها. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف.
  15. اختياري: إذا الخلية بيليه يظهر الحمراء بسبب وجود كمية عالية من كرات الدم الحمراء إعداد 1X خلايا الدم الحمراء عن طريق تمييع الحل يزيس 1:10 10X حل في الماء المقطر المزدوج، إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر PBS وإضافة 5 مل 1X خلايا الدم الحمراء يزيس الحل. دوامة 5 ثانية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف.
  16. إعادة تعليق الخلايا السرطانية مع 263 الكم والبذور الخلايا في خلية المناسبة قارورة الثقافة. الخلايا السرطانية في الثقافة 37 ° C و 5٪ CO 2 و الخلايا مرور روتينية عندما تصل إلى نقطة التقاء 80٪.

3. توصيف الثقافة الخلية الأولية واستنفاد الخلايا الليفية

  1. تحليل الأساسي باستخدام زراعة الخلايا ظاهريا على microscoبي.
  2. حصاد كمية صغيرة (0.5x 10 6 خلايا) من زراعة الخلايا الأولية وأداء RT-PCR مع الاشعال للرمي، سرطان الجلد، الخلايا الجذعية، والجينات سدى علامة الخلية. الجينات لتحليل أهم CD90 هي (علامة الخلايا الليفية)، TYR (سرطان الجلد / علامة الخلايا الصباغية)، CD133 (سرطان الخلايا الجذعية علامة)، CD83 (علامة للحصول على الخلايا الجذعية الناضجة) والجينات التدبير المنزلي (مثل HPRT أو GAPDH).
  3. إذا كان التحليل المجهري والتعبير عالية من CD90 خلال RT-PCR كشفت عن وجود تلوث شديد للثقافة سرطان الجلد مع الخلايا الليفية الأولية، تحتاج إلى استنزاف الخلايا الليفية باستخدام MicroBeads مكافحة الخلايا الليفية وأعمدة D من Miltenyi.

4. المغناطيسي الفرز الخلية من CD133 + وCD133 - خلايا سرطان الجلد باستخدام أعمدة LS

  1. إعداد MACS العازلة التي تحتوي على 2 مم EDTA وFCS 5٪ في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب عازلة ومعقمة باستخدام الترشيح، 0،22 ميكرون وحدة تصفية Steritop-GP. البرد عازلة ل4-8 ° Cوديغا قبل الاستخدام.
  2. قبل الدافئة Accutase، PBS الكم والمتوسطة 263 حتي 37 ° C.
  3. غسل الخلايا متموجة 80٪ مع PBS. إضافة كمية مناسبة من Accutase واحتضان الخلايا حتى فصل من سطح الثقافة. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل باستخدام الكم 263 متوسطة.
  4. تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا (وفقا لبروتوكول Miltenyi ليمكن تحميل أكبر عدد ممكن من 2X الخلايا 9 10 لكل عمود LS. ينبغي تحديد خلية خط الأعداد الأمثل محددة، ويمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير.) لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  5. إعادة تعليق بحد أقصى 10 8 خلايا 1X العازلة مع 350 ميكرولتر MACS (للأرقام أعلى الخلية توسيع نطاق جميع العازلة MACS التالية، FCR الكاشف الحظر، وCD133/1-Biotin MicroBeads المضادة للكميات البيوتين وفقا لذلك).
  6. إضافة 100 ميكرولتر الكاشف FCR الحظر.
  7. إضافة 50 ميكرولتر CD133/1-Biotin. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في ° C Fأو 10 دقيقة.
  8. غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  9. كرر الخطوة غسل (4.8)
  10. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 400 ميكرولتر العازلة MACS.
  11. إضافة 100 ميكرولتر مكافحة البيوتين MicroBeads. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  12. وفي الوقت نفسه، تعد الفاصل MACS للمغناطيس. إرفاق QuadroMACS للوقوف فاصل MACS موضوع. إدراج العدد المطلوب من الأعمدة LS مع أجنحة العمود إلى الأمام في المجال المغناطيسي للQuadroMACS. وضع فلتر قبل فصل (مع 30 ميكرومتر شبكة النايلون) في كل عمود وLS أنبوب جمع المناسبة (15 مل أو 50 مل) تحت كل عمود. إعداد تصفية والعمود وذلك بدهن مع 3 مل العازلة MACS. تجاهل التدفق من خلال.
  13. غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما.
  14. إعادة تعليق الخلايا مع 500 ميكرولترMACS العازلة وتطبيق التعليق على الخلية العمود LS مع تصفية ما قبل الانفصال.
  15. يغسل ثلاث مرات مع 3 مل العازلة MACS لكل عمود. فقط إضافة جديدة عازلة عند الخزان عمود فارغ.
  16. جمع النفايات السائلة مجموع يحتوي على CD133 لا تحمل علامات - جزء الخلية.
  17. تجاهل ما قبل تصفية الفاصل، إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب جمع مناسبة.
  18. 5 تطبيق العازلة MACS مل. طرد فورا من العلامات الخلايا CD133 + عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
  19. لزيادة نسبة نقاء السلبية، وتطبيق التعليق على الخلية عمود LS معايرتها الجديدة المدرجة في QuadroMACS. النفايات السائلة تحتوي على CD133 - الكسر.
  20. تجاهل الأعمدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إعداد الخلايا واحد من الأنسجة الورم

الشكل 2 مثالا على الانبثاث العقدة الليمفاوية مقطوعة لمريض سرطان الجلد في وقت متأخر قبل المرحلة (A) وبعد تفكك الميكانيكية (B) إلى قطع مم 2-4. بعد تفكك الأنزيمية من النسيج والترشيح من خلال شبكة ميكرومتر النايلون 70، كانت الخلايا مكعبات وتجاهل طاف. في هذه الخطوة لاحظنا وجود تلوث عالية مع كرات الدم الحمراء كما يدل على ذلك اللون المحمر من بيليه خلية في الشكل 2C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من أجل إزالة التلوث من كرات الدم الحمراء بيليه الخلايا السرطانية نوصي بشدة باستخدام خلايا الدم الحمراء تحلل من حل Miltenyi. مزايا lysing في الكريات الحمراء خلال الطرد المركزي Ficoll التقليدية التدرج الكثافة هي أنه من أسرع وأبسط. وعلاوة على ذلك، يتم تجنب التلوث مع Ficoll أو خلايا الدم الحمراء وفقدان الخلايا السرطانية. وينبغي عند مراقبة نمو الخلايا الليفية في المزارع الخلوية الأولية إزالتها على الفور لأنها عادة كسا الأرض الخلايا السرطانية عند انتظار طويل جدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

شكر وتقدير

أشكر الأستاذ الكتاب M. Dietel وديرك شوماخر لدعم هذا العمل وقراءة نقدية للمخطوطة.

تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 115234، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA 'في مساهمة عينية. كما أيد هذا العمل من قبل Krebsgesellschaft برلين (BKG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف
Accutase PAA المختبرات محدودة L11-007
الأمفوتريسين B حل 250 ميكروغرام / مل في الماء منزوع الأيونات سيغما الدريخ، وشركة A2942-50ML
مكافحة الخلايا الليفية microbeads Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-050-601
CD133 / 1 (W6B3C1) Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-092-395
كولاجيناز IV سيغما الدريخ، وشركة C5138
الدناز I APPLICHEM شركة محدودة A3778.0050
D-PBS دون الكالسيوم، والمغنيسيوم PAA المختبرات محدودة H15-002
Ethylenediaminetetraacetic حمض يذوى الملح الصوديوم (EDTA) سيغما الدريخ، وشركة E-7889
FBS فخمة Biochrom S0615
غير المباشرة CD133 الإنسان كيت الصغرى، حبة Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-091-895 تشمل ما يلي: CD133 / 1 (AC133)-البيوتين، MicroBeads مكافحة البيوتين وFCR الكاشف الحظر
البنسلين الستربتوميسين، السائل (100X) إينفيتروجن شركة محدودة 15140-122
الكم 263 PAA المختبرات محدودة U15-815
تحلل الخلايا الحمراء في الدم الحل (10X) Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-094-183
معدات
الخليوي مصفاة (70 ميكرون) BD العلوم البيولوجية 352350
gentleMACS C أنابيب Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-093-235
MACS حامل فاصل موضوع Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-042-303
أعمدة الفاصل MACS أعمدة LS 25 Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-042-401
MACSmix أنبوب الدوار Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-090-753
Natriumchloride ميرك KGaA 567440-1KG
قبل فصل فلاتر Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-041-407
QuadroMACS فاصل Miltenyi بيوتيك شركة محدودة 130-090-976
Rotilabo-حقنة المرشحات (0.22 ميكرومتر، PES) كارل روث GMBH & KG شركة P668.1
Steritop-GP تصفية وحدة 500 مل Miltenyi بيوتيك شركة محدودة SCGPS05RE

المراجع

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409(2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية لسرطان الميلانوماالخلايا الموجبة لـ CD133فرز الخلايا بالتنشيط المغناطيسيزراعة الميلانوما الأوليةاستنزاف الخلايا الليفيةإزالة كريات الدم الحمراءتفكيك أنسجة الورمنقاء فرز الخلايانهج الطب الشخصي
زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.