عالية الإنتاجية انتقائية 2 'أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي (SHAPE) تستخدم مادة كيميائية رواية التحقيق التكنولوجيا، النسخ العكسي، الكهربائي الشعري والبرمجيات التنبؤ هيكل ثانوي لتحديد هياكل الرنا من عدة مئات إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات في قرار النوكليوتيدات واحد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فهم وظيفة الحمض النووي الريبي المشاركة في العمليات البيولوجية تتطلب معرفة وافية من بنية الحمض النووي الريبي. وتحقيقا لهذه الغاية، ومنهجية يطلق عليها اسم "عالية الإنتاجية انتقائية 2 'أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي"، أو الشكل، يسمح التنبؤ من الحمض النووي الريبي هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد. هذا النهج يستخدم وكلاء التحقيق الكيميائية التي acylate تفضيلي المناطق الذين تقطعت بهم السبل أو مرنة واحدة من الحمض النووي الريبي في محلول مائي. تم الكشف عن مواقع التعديل الكيميائي بواسطة النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي معدلة، والمنتجات من هذا التفاعل هي مجزأة من قبل الكهربائي الشعري الآلي (CE). منذ الناسخ العكسي مؤقتا في تلك النيوكليوتيدات RNA تعديلها من قبل الكواشف الشكل، مكتبة [كدنا] الناتجة خرائط غير مباشرة تلك ribonucleotides أن تقطعت بهم السبل واحدة في سياق RNA مطوية. باستخدام البرمجيات ShapeFinder، تتم معالجة electropherograms التي تنتجها الآلي CE وتحويلها إلى نوالجداول تفاعل cleotide التي يتم تحويلها إلى أنفسهم القيود الزائفة الطاقة المستخدمة في RNAStructure (V5.3) خوارزمية التنبؤ. وقد تم العثور على هياكل RNA ثنائي الأبعاد التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين SHAPE التحقيق مع الحمض النووي الريبي في سيليكون والتنبؤ هيكل ثانوي لتكون أكثر دقة من الهياكل التي تم الحصول عليها باستخدام أي من الطريقتين وحدها.
المقدمة
لفهم وظائف الرنا الحفاز وغير الترميز المشاركة في تنظيم الربط والترجمة وتكاثر الفيروس وسرطان، لا بد من معرفة تفصيلية للبنية الحمض النووي الريبي 1،2. للأسف، تنبؤ دقيق من الحمض النووي الريبي للطي يمثل تحديا هائلا. وكلاء التحقيق الكلاسيكية تعاني من عيوب كثيرة مثل سمية، والتغطية النوكليوتيدات غير مكتملة و / أو إنتاجية محدودة إلى 100-150 النيوكليوتيدات في التجربة. خوارزميات التنبؤ المجردة هيكل الثانوي غير ملائم وبالمثل، نظرا لعدم الدقة الناجمة عن عدم قدرتها على التمييز بين فعالية هياكل مماثلة بقوة. الرنا كبيرة على وجه الخصوص هي أيضا في كثير من الأحيان إلى صهر أساليب تحديد هيكل 3D مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغنا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
التصميم التمهيدي والإرشاد من 3 RNA 'محطة
لتحليل الرنا طويلة من قبل SHAPE الإنتاجية العالية، وينبغي اختيار مجموعة من المواقع التهجين التمهيدي بحيث يتم فصلهم (ط) التي كتبها ~ 300 NT، (الثاني) 20-30 NT في الطول، و (ثالثا) أن الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الهجينة التي تنتجها الصلب الحمض النووي لهذه المواقع لديها درجة حرارة انصهار المتوقعة من> 50 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب قطاعات من الحمض النووي الريبي التي من المتوقع أن تكون منظم للغاية، على الرغم من اتخاذ مثل هذا القرار يتطلب بعض المعرفة المسبقة للبنية الحمض النووي الريبي، والتي غالبا ما تكون....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الحمض النووي الريبي التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية REV-1 عنصر استجابة (RRE) وأعدت 3 'هيكل محطة راديو كاسيت 4 من البلازميد خطي من قبل في النسخ المختبر، وبعد ذلك كانت مطوية عن طريق التسخين والتبريد، والحضانة عند 37 درجة مئوية في وجود من MgCl 2. تعرضت RNA إلى NMIA ومن ثم الانعطاف من كتب التمهيدي الحمض النووي 5'-نهاية المسمى المهجنة إلى 3 'هيكل محطة راديو كاسيت. الناتجة SHAPE مكتبة [كدنا]، جنبا إلى جنب مع ردود فعل السيطرة و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم هنا بروتوكول مفصلة لشكل الإنتاجية العالية، وهي تقنية تسمح تحديد هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد لالرنا من أي حجم. وعلاوة على ذلك، اقتران بيانات الشكل التجريبية مع خوارزميات التنبؤ هيكل ثانوي يسهل جيل من الحمض النووي الريبي نماذج 2D مع درجة أعلى من دقة مما هو ممكن مع إما الأسلوب وحده. مزيج من الاشعال fluorescently المسمى وCE الآلي يوفر مزايا هامة على شكل التقليدي القائم على هلام، وتسهيل قرار من تسلسل الحمض النووي الريبي طويلة في تجربة واحدة، فضلا عن ارتفاع كبير السرعة وا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
معتمدة S. Lusvarghi، J. Sztuba-Solinska، KJ Purzycka، JW RAUSCH وSFJ لو جريس من قبل برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة الأمريكية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
EQUIPMENT< / strong> الرحلان الكهربائي الشعري يختلف Beckman CEQ8000 Thermocycler
تقنيات يستخدم الحمض النووي لقالب < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RECODES< / strong> | |||
| N-methylisatoic أنهيدريد (NMIA) | الحياة | M25 | تذوب في أنهيدريد DMSO اللامائي |
| 1-methyl-t-nitroisatoic أنهيدريد (1M7) | انظر المرجع 22 | ||
| تقنيات Superscript III Reverse Transcriptase | Life | 18080044 | 10,000 وحدة |
| طقم تسلسل دورة التسلسل الحراري | Affymetrix | 78500 | |
| المواد التي يوفرها المستخدم < / strong> | |||
| RNA ذات الأهمية | 6 pmol لكل تفاعل (سيتم تحديد حد الكشف بواسطة الأداة) | ||
| مجموعات من أربعة بادئات تحمل علامة 5 بوصات (Cy5 و Cy5.5 و WellRed D2 و WellRed D1 / Licor IR800) | البادئات مكملة للحمض النووي الريبي وتستخدم في تفاعلات النسخ والتسلسل. تعتبر الفلوروفورات المدرجة مثالية ل Beckman Coulter 8000 CEQ. يمكن شراء الاشعال أو تصنيعها في المنزل. | ||
| الحمض النووي | لتسلسل التفاعلات ، ويجب أن يحتوي على تسلسل الحمض النووي الريبي الذي تتم دراسته - بما في ذلك أي امتداد طرفي 3 بوصات ، إن وجد. عند الاقتضاء ، غالبا ما يكون من الملائم استخدام قالب نسخ الحمض النووي الريبي. | ||
| Buffers< / strong | |||
| >10x RNA renaturation | buffer 100 mM Tris-HCl pH 8.0 ، 1 M KCl ، 1 ملي مولار EDTA | ||
| 5X RNA قابل للطي عازلة | 200 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 25 ملي مللي MgCl 2< / sub> ، 2.5 ملي مولار EDTA ، 650 ملي كلوريد الهيدروجين (قد يتم تغيير هذا المخزن المؤقت اعتمادا على الحالة ( على سبيل المثال < / em> درجة الحموضة ، EDTA ، Mg ، مثبط RNase) | ||
| 2.5X RT مزيج | 4 & مو ؛ ل 5X عازلة ، 1 & ل 100 ملي DTT ، 1.5 مو ؛ ل ماء ، 1 مو ؛ ل 10 ملي مولار dNTPs ، 0.5 مو ؛ ل SuperScript III. لاحظ أن المخزن المؤقت 5X و 100 mM DTT يتم توفيرهما مع شراء SuperScript III (Invitrogen). | ||
| محلول تحميل عينة GenomeLab (بيكمان كولتر) | <قوي>انتباه: < / قوي> تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة | ||
المراجع
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
