فصل الأدمة الجنينية الماوس الوجه واللحمة المتوسطة

ملخص

يوصف بروتوكول للفصل الجنين الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة. نستخدم Dispase II لعلاج الأجنة كلها أولا، تشريح الوجه كله من البروز، ومن ثم فصل الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة.

الملخص

انشقاقات فموي وجهي هي العيوب الأكثر شيوعا القحفي، والتي تؤثر 1.5 في الأطفال حديثي الولادة ^1،2 1000 في جميع أنحاء العالم. ويتسبب clefting فموي وجهي غير طبيعي من قبل ³ التطوير الوجه. في النمو، والماوس الإنسان الأولية والزخرفة من الوجه تعتمد على براعم صغيرة عدة من الأنسجة، والبروز الوجه ^4،5. مشتق من ست وجه البروز رئيسية هي: العمليات المقترنة الجبهي الأنفي (FNP)، البروز للفك العلوي (MXP) والبروز الفك السفلي (MDP). هذه النتوءات تتكون من تورمات من اللحمة المتوسطة التي هي المغطى في ظهارة الفوقية. وقد أظهرت الدراسات في الأنواع المتعددة التي يشير الحديث المتبادل بين الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة هو أمر حاسم لتشكيل الوجه ^6. بعد وتفاصيل الآلية المتعلقة الجينات المسؤولة عن هذه التبديلات يشير تعاني من نقص. طريقة واحدة للحصول على فهم شامل للالتعبير الجيني، عامل النسخ ملزم، وعلامات لونين المرتبطة develoالأديم الظاهر بينغ الوجه واللحمة المتوسطة هو عزل وتوصيف المقصورات الأنسجة فصل.

هنا نقدم طريقة لفصل الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة في يوم الجنينية (E) 10.5، مرحلة حاسمة في تشكيل التنموية الماوس الوجه التي تسبق التحام نتوءات. ويتم تكييف أسلوبنا من النهج الذي قد استخدمت في السابق لتشريح الوجه البروز ^7. في هذه الدراسة في وقت سابق قد استخدمناها C57BL الفطرية / 6 الفئران وهذه السلالة أصبحت معيارا لعلم الوراثة، علم الجينوم وعلم التشكل الوجه ^8. هنا، على الرغم من، ونظرا لكميات محدودة من أنسجة أكثر المتاحة، وقد استخدمت لدينا الأباعد CD-1 السلالة التي هي أرخص لشراء، أكثر قوة للتربية، وتميل إلى إنتاج المزيد من الأجنة (12-18) في القمامة من أي الفطرية الماوس سلالة ^8. بعد العزلة الجنين، وكان يستخدم محايدة البروتيني Dispase II لعلاج الجنين كله. ثم، وكان البروز الوجه تشريحتم فصل إد بها، والأديم الظاهر الوجه من اللحمة المتوسطة. هذه الطريقة تحافظ على كل من الوجه والأديم الظاهر اللحمة المتوسطة سليمة. يمكن استخدام عينات تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنيات بما في ذلك منهجية لكشف البروتين، لونين مناعي (رقاقة) فحص والدراسات ميكروأري، ويليها RNA.

البروتوكول

1. إعداد Dispase II

1. إعداد جديدة HEPES-مخزنة المالحة (HBS) (ملي Hepes 50 / KOH درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم). إضافة 2 مل 0.5 م HEPES / KOH درجة الحموضة 7.4 و 1.2 مل 2،5 M كلوريد الصوديوم في 16،8 مل النقاوة O. ₂ H
2. جعل 10 ملغ / مل II Dispase. تزن 0.2 غرام Dispase II (روش، القط # 4942078001) وتذوب في HBS مل 20. إعداد 1،0 مليلتر مأخوذة في أنابيب إيبندورف الفردية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل التخزين.
3. تمييع 10....

النتائج

بعد العلاج الثاني Dispase، والأديم الظاهر للجنين يميل إلى أن يكون فضفاض. يجب أن تكون سليمة البروز الوجه بعد تشريح (الشكل 2A). الأديم الظاهر معزولة الوجه واضحة وخالية من الأنسجة اللحمة المتوسطة (الشكل 2B). لتحديد مدى فعالية من البروتوكول وللكشف عن التلوث عبر الدماغ الأمامي لأننا يعاير أعرب Zic3 ^9، الأدمة محدد ⁵ cdh1 والوسيطة المحددة sox10 ¹⁰ باستخدام PCR الناسخ العكسي. دراساتنا أكد أن كلا من الأديم الظاهر الوجه والل.......

المناقشة

هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لفصل الجنينية الماوس الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة على أساس خطوة Dispase العلاج الأولي II. في الدراسات السابقة، فقد أجرينا تشريح الوجه البروز قبل المعالجة II Dispase، ولكن وجدنا دائما أن يصبح اللحمة المتوسطة "لزجة" وأكثر صعوبة للتلاعب. بروتوكول الجديد يتجنب هذه المشكلة. الجمع بين العلاج مع Dispase II القوة البدنية لطيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا يجعل الفصل بين الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة أسهل. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول أي.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Dispase II (البروتياز المحايد ، الدرجة الثانية)	4942078001 Roche		اصنع محلول مخزون 10 مجم / مل Dispase II في HBS. Aliquot وتخزينها في -20 درجة ؛ C .
RNAlater	أمبيون	AM7021