مقالة منهجية

بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

DOI:

10.3791/50273

⸱

أبريل 3, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin , 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توطين وتوزيع البروتينات توفير معلومات هامة لفهم وظائفها الخلوية. يمكن استخدام دقة فائقة المكاني للالمجهر الإلكتروني (EM) لتحديد توطين التحت خلوية من مستضد معين بعد المناعية. لأنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والحفاظ على السلامة الهيكلية بينما استضداد كان من الصعب الحفاظ على وخاصة في الدراسات EM. هنا، ونحن اعتماد إجراءات التي استخدمت للحفاظ على الهياكل ومولدات المضادات في الجهاز العصبي المركزي لدراسة وتوصيف البروتينات متشابك في قرن آمون الفئران الخلايا العصبية الهرمية CA1.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفحص المجهري المناعي هو أداة قوية لدراسة الجزيئات البيولوجية على المستوى تحت الخلوي. يمكن للأجسام المضادة المقترنة بعلامات كثيفة الإلكترون مثل الذهب الغروي أن تكشف عن توطين وتوزيع مستضدات معينة في الأنسجةالمختلفة 1. التقنيتان الأكثر استخداما هما تقنيات التضمين المسبق وما بعد التضمين. في تقنيات الفحص المجهري المناعي الذهبي (EM) المسبق ، يجب اختراق الأنسجة للسماح باختراق الأجسام المضادة قبل تضمينها. هذه التقنيات مثالية للحفاظ على الهياكل ولكن الاختراق الضعيف للجسم المضاد (غالبا الميكرومترات القليلة الأولى فقط) يمثل عيبا كبيرا2. يمكن لطرق وضع العلامات بعد التضمين تجنب هذه المشكلة لأن وضع العلامات يحدث على أقسام من الأنسجة الثابتة حيث يمكن الوصول إلى المستضدات بسهولة أكبر. على مر السنين ، أدى عدد من التعديلات إلى تحسين طرق ما بعد التضمين لتعزيز التفاعل المناعي والحفاظ على البنية التحتية3-5.

يعد تثبيت الأنسجة جزءا مهما من دراسات EM. تربط المثبتات كيميائيا الجزيئات الكبيرة لتثبيت هياكل الأنسجة في مكانها. لا يؤثر اختيار المثبت على الحفظ الهيكلي فحسب ، بل يؤثر أيضا على الاستعداد والتباين. كان رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) والفورمالديهايد والجلوتارالديهايد من المثبتات القياسية لعقود من الزمن ، بما في ذلك أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS) المعرضة بشكل خاص للتلف الهيكلي أثناء المعالجة الكيميائية والفيزيائية. لسوء الحظ ، فإن OsO4 شديد التفاعل وقد ثبت أنه يخفي المستضدات6 ، مما يؤدي إلى وضع العلامات الضعيفة وغير الكافية. تشمل الأساليب البديلة لتجنب التثبيت الكيميائي تجميد الأنسجة. لكن هذه التقنيات يصعب تنفيذها وتتطلب أجهزة باهظة الثمن. لمعالجة بعض هذه المشاكل وتحسين وضع العلامات على أنسجة الجهاز العصبي المركزي ، Phend et al. استبدل OsO4 بخلات اليورانيل (UA) وحمض التانيك (TA) ، ونجح في إدخال تعديلات إضافية لتحسين حساسية الكشف عن المستضد والحفاظ الهيكلي في أنسجة الدماغ والحبلالشوكي 7. لقد اعتمدنا طريقة ما بعد التضمين الخالية من الأوزميوم لأنسجة دماغ الفئران وقمنا بتحسين تقنية وضع العلامات على الذهب المناعي لاكتشاف ودراسة البروتينات المشبكية. < p class = "jove_content">نقدم هنا طريقة لتحديد التوطين فوق البني للبروتينات المشبكية في الخلايا العصبية الهرمية CA1 في الحصين الفئران. نستخدم شرائح الحصين المستنفطة العضوية. تحافظ هذه الشرائح على الدوائر ثلاثية المشابك للحصين ، وبالتالي فهي مفيدة بشكل خاص لدراسة اللدونة المشبكية ، وهي آلية يعتقد على نطاق واسع أنها تكمن وراء التعلم والذاكرة. يمكن تحضير شرائح الحصين العضوية من اليوم 5 و 6 من صغار الفئران / الفئران بعد الولادة كما هو موضحسابقا 8 ، وهي مفيدة بشكل خاص لضربة قاضية حادة أو الإفراط في التعبير عن البروتينات الخارجية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول سابقا لتوصيف neurogranin (Ng) ، وهو بروتين خاص بالخلايا العصبية له دور حاسم في تنظيم الوظيفة المشبكية8،9. لقد استخدمناه أيضا لتوصيف التوطين الهيكلي للكالمودولين (CaM) وبروتين كيناز II المعتمد على Ca2 + / CaM (CaMKII) 10. كما هو موضح في النتائج ، يسمح هذا البروتوكول بالحفاظ على البنية التحتية الجيدة للعمود الفقري المتغصني ووضع العلامات الفعالة على Ng للمساعدة في توصيف توزيعه في العمودالفقري 8. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون للإجراء الموصوف هنا قابلية تطبيق واسعة في دراسة العديد من البروتينات الأخرى المشاركة في وظائف الخلايا العصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تثبيت

مثبتات مسببة للسرطان؛ ارتداء القفازات والتعامل مع مثبتات في غطاء الدخان. ما لم يذكر خلاف ذلك، وتتم جميع حضانات على الجليد، وينبغي أن تتم تصفيته قبل الاستعمال كل الحلول. استخدام الإلكترون المجهري الصف الكواشف.

يوم 1

  1. بعد الظروف التجريبية (حقن الفيروسية مثل العلاج من تعاطي المخدرات)، ضع الغشاء مع شرائح قرن آمون في عضوي النمط لمدة 60 × 15 مم طبق بتري تحتوي على الجليد البوليسترين الباردة الفوسفات 0.1 M عازلة (عازلة للفوسفات سورنسن)، ودرجة الحموضة 7.3. إضافة 1-2 مل من 0.1 العازلة الفوسفات M مباشرة على أعلى من شرائح للحفاظ على الباردة.

خطوة حاسمة: استخدم دوما طازجة أعدت مخازن ومثبتات. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للالعازلة هو داخل النطاق المطلوب. ويمكن لعدم القيام بذلك تلف الهياكل الخلوية.

  1. لعزل الحقل الفرعي CA1 للشريحة، استخدممشرط لقطع القابل للتصرف بلطف عبر شريحة بجوار DG، بالتوازي مع طبقة الخلايا CA1 (الشكل 1). ثم قص شريحة المتبقية عموديا لإزالة الحقل الفرعي CA3 ومرفد و. قطع زاوية من شريحة للمساعدة في تحديد السطح العلوي للنسيج.

ملاحظة: في حالة تسليم أي مطلوب من البروتين الفيروسي من الفائدة، يمكن ان تكون ثابتة في شريحة الأنسجة كامل بعد إزالة وسائل الإعلام مع طيف شطف من الجليد الباردة العازلة. ثم اعقب ذلك عن طريق الاستغناء عن CA1.

خطوة حاسمة: تتبع الجانب العلوي من الأنسجة من أجل باجتزاء السليم للشبكات في وقت لاحق.

  1. إزالة الأنسجة بعناية من الغشاء باستخدام مساعدات من مشرط. استخدام ماصة باستور لنقل بلطف الأنسجة إلى لوحة تحتوي على 12-جيدا العازلة الفوسفات 0،1 M.
  2. إزالة المخزن المؤقت في البئر من لوحة وإضافة 500 & Mش؛ L - 1 مل من الجليد الباردة مثبت (الرقم الهيدروجيني 7.3) تتألف مما يلي: 0.1٪ حمض البكريك، بارافورمالدهيد 1٪، وغلوتارالدهيد 2.5٪ في 0.1 العازلة الفوسفات M. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.

ملاحظة: قد يكون حمض البكريك متفجرة عندما تجف. يبقيه مبلل بالماء في حاوية مغلقة بإحكام. تخزينها في مكان جاف وجيد التهوية.

  1. إزالة مثبت من البئر وغسل العينات 3 مرات (20 دقيقة لكل منهما) في 0.1 العازلة الفوسفات M.
  2. احتضان لمدة 40 دقيقة في حمض التانيك 1٪ (W / V) في 0.1 العازلة ماليات M، 6.0 درجة الحموضة.
  3. شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات.
  4. احتضان لمدة 40 دقيقة في خلات اليورانيل 1٪ (W / V) في المخزن المؤقت ماليات في الظلام. خلات اليورانيل حساسة للضوء وغير المشعة. تغطية الكأس مع Parafilm عندما حل وتخزين أي العازلة المستخدمة في الظلام في C. ° 4
  5. شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات.
  6. احتضان لمدة 20 دقيقة في الكلور البلاتين 0.5٪IDE (ث / ت) في المخزن المؤقت ماليات.
  7. شطف مرتين (20 دقيقة لكل منهما) في المخزن المؤقت ماليات. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة لمزيد من المعالجة.

2. الجفاف وتضمينها

أكسيد البروبيلين هو مسرطنة. تجنب أبخرة من خلال العمل معها في غطاء الدخان. استخدام المطلقة، والإيثانول النقي 100٪ يحتوي على أي أثر للماء. هذا تمييع الإيثانول المطلق لإنتاج تركيزات مختلفة للجفاف.

يوم 2

  1. احتضان لمدة 5 دقائق في الايثانول 50٪ ثم لمدة 5 دقائق في الايثانول 70٪.
  2. احتضان لمدة 15 دقيقة في٪ 1 الطازجة ف فينيلين (PPD) في الايثانول 70٪.
  3. شطف ثلاث مرات في الايثانول 70٪.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق في الايثانول 80٪ ثم لمدة 5 دقائق في الايثانول 95٪.
  5. احتضان في الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين كل 5 دقائق.
  6. إعداد قوارير الزجاج مع الأغطية الملولبة والتأكد من أنها نظيفة وجافة تماما. نقل قوارير الزجاج إلى شرائح وتسمية كل فيال ببساطة ووضوح.
  7. احتضان لمدة 5 دقائق في 01:01 الإيثانول: أكسيد البروبيلين.
  8. احتضان أكسيد البروبيلين في 100٪ مرتين كل 5 دقائق.
  9. إضافة الراتنج (EPON) إلى كل قارورة لجعل مزيج 1:1 مع أكسيد البروبيلين. المزيج بلطف لمدة 2 ساعة. لا يهز قنينة بدقة جدا لمنع الفقاعات التي يمكن أن تتداخل مع التضمين.
  10. إضافة الراتنج لجعل خليط مع أكسيد البروبيلين 03:01، ومزيج لمدة 2 ساعة.
  11. نقل الراتنج إلى 100٪ واحتضان O / N.

اليوم 3

  1. ساندويتش شرائح عينات من البلاستيك بين ACLAR وعلاج ل24 ساعة عند 60 ° C.

3. باجتزاء وتركيب شبكات على

يوم 4

  1. قطع شبه رقيقة (0.5 ميكرومتر) وصمة عار مع أقسام 1٪ + البوراكس زرقة الطولويدين 1٪ لتحديد الاتجاه الصحيح من العينات.
  2. قطع المقاطع سامسونج (60 نانومتر) وجبل على شبكات النيكل، مقطع واحد في الشبكة.

4. المناعية

يجب أن تتم تصفيته جميع مخازن والماء قبل الاستخدام.

اليوم 5

  1. وضع قطرة (~ 50 ميكرولتر) من العازلة Tween-20/phosphate 1٪ (T / PB)، ودرجة الحموضة 7.5، على قطعة من Parafilm نظيفة على سطح مستو. اختيار ما يصل بلطف الشبكة مع ملقط على حافة نظيفة وتطفو على المخزن المؤقت، القسم الأسفل، واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. استنزاف السائل الزائد من الشبكة عن طريق وضع الجانب القسم حتى على ورقة لتصفية ثم تطفو على جليكاين 50 مم في T / PB لمدة 15 دقيقة في RT.

خطوة حاسمة: لتجنب الإفراط في 'ترحيل' من الحلول من حل قطرة واحدة إلى أخرى خلال حضانات، واستنزاف السائل الزائد عن طريق لمس برفق على حافة الشبكة على الورق 1 # التصفية بين كل تغيير الحل. أيضا إزالة أي حل محاصرين بين أحضان EM ملقط عقد الشبكة من فتل بلطف مع قطعة من ورق الترشيح بين الأسلحة ملقط بينما ل ensuدق أبواب لا تجف تماما.

  1. تجفيف الشبكة مع ورقة الترشيح ثم تطفو على منع محلول يحتوي على 2.5٪ BSA والمصل 2.5٪ من الحيوانات من الأجسام المضادة الثانوية في T / PB لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (في T / PB) في RT أو O / N ° 4 في C. الوقت الأمثل ودرجة حرارة الحضانة، فضلا عن تركيز الأجسام المضادة، يجب أن يتم تحديد تجريبيا.
  3. غسل الشبكة ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB.
  4. احتضان الضد الثانوية مع (1:20 المضادة للأرنب أو مكافحة الماوس بالإضافة إلى الذهب نانومتر 10) ل1 ساعة في RT.
  5. يغسل ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB.
  6. POSTFIX مع غلوتارالدهيد 2٪ في T / PB لمدة 5 دقائق.
  7. يغسل ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع T / PB ثم ثلاث مرات (2 دقيقة لكل منهما) مع الماء المصفى.
  8. احتضان مع خلات اليورانيل 2٪ في الماء لمدة 10 دقيقة.

في حين أن الشبكة هو تلطيخ، وإعداد CO 2-مجانا من قبل غرفة placinGA قطعة من Parafilm في وسط طبق بتري الزجاج. ثم ضع 4-6 كريات هيدروكسيد الصوديوم في طبق في جميع أنحاء Parafilm لامتصاص CO 2 في الهواء. الحفاظ على أعلى إغلاق لبضع دقائق. استخدام ماصة باستور ونقل بسرعة حجم صغير من محلول سترات رينولد يؤدي إلى Parafilm في طبق بتري الزجاج. فتح الجزء العلوي يكفي لإدراج ماصة باستور للحد من إعادة إدخال CO 2 في الغرفة.

ملاحظة: لجعل حل رينولد سترات الرصاص، يغلي 100 مل من الماء منزوع الأيونات في فرن ميكروويف والسماح لتبرد في وعاء محكم. في قارورة 50 مل الحجمي بالسدادة، مزيج الرصاص 1،33 ز نترات، 1،76 ز سترات الصوديوم و 30 مل من الماء المغلي عن طريق هز بقوة لمدة 1 دقيقة. ثم يهز بشكل متقطع لمدة 30 دقيقة. لهذا الحل غائم، إضافة 8 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم وعكس ببطء القارورة عدة مرات. والحل أصبح واضحا. تقديم حل ل50 مل مع وا المغليثالثا. يخزن المحلول مغلقة بإحكام. إذا راسب يظهر، تجاهل وجعل واحدة جديدة.

  1. في ثلاثة أكواب أصغر إعداد الدافئة، والمياه المغلية الطازجة منزوع الأيونات. يغسل خلات اليورانيل بواسطة غمس الشبكة في الدورق الأول ودوامة برفق لمدة 30 ثانية حول. كرر هذه الخطوة في الأكواب الأخريين.
  2. فتح الجزء العلوي من الزجاج طبق بتري يكفي لوضع الشبكة في قطرة من محلول سترات رينولد الرصاص. إذا كان ذلك ممكنا، وارتداء قناع أثناء القيام هذا لتجنب التنفس على الرصاص وسترات لمنع تشكيل راسب. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  3. فتح الجزء العلوي يكفي لإزالة الشبكة. تجنب التنفس على سترات الرصاص. غسل الشبكة ثلاث مرات متتالية عن طريق غمس ذلك في ثلاثة أكواب الماء الدافئ مع، المقطر المغلي طازجة. السماح للشبكة الجافة على قطعة من ورق الترشيح، قسم أعلى. العينة هو الآن على استعداد للالمجهر الإلكتروني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرقم 2B مثالا على توزيع جزيئات نج المحلية في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الهرمية CA1 قرن آمون. تمت تغطية شبكات النيكل مع الأنسجة (60 نانومتر) التي تحتوي على سامسونج CA1 منطقة قرن آمون (كما رأينا في الشكل 2A) في 1٪ T / PB، 50 مم جليكاين، ومنعت بعد ذلك مع BSA 2.5٪ و 2.5٪ المصل قبل الحضانة مع المضادة -نج الأجسام المضادة. بعد الغسيل مع T / PB، ثم تمت تغطية شبكات في مكافحة الأرانب الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى 10 نانومتر الذهب. وأخيرا،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، فقد اعتمدنا أسلوب Phend واينبرغ للدماغ والحبل الشوكي الأنسجة لدراسة العمود الفقري شجيري في قرن آمون شريحة الثقافات الفئران. العمود الفقري شجيري في منطقة قرن آمون CA3-CA1 هي الهياكل الحساسة التي تحتوي على مجموعة واسعة من البروتينات التي تلعب دورا هاما في تنظيم وظائف الخلايا العصبية. طريقة عرض يوفر نهج متوازن لتحقيق استضداد تعزيز الحفاظ التركيبية مع الحفاظ على جيد (الشكل 2A)، والسماح كفاءة معقولة ووضع العلامات استنساخ جيدة مفيدة لوصف توزيع مستضدات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر فلورنسا ماثيو لإعداد الثقافات شريحة الحصين. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني الأمريكي للشيخوخة وجمعية الزهايمر لNZG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
60 × 15 مم طبق بتري من البوليسترينFalcon351007
مشرط يمكن التخلص منهEXELINT29552
إدراج ثقافة الخلاياMilliporePICM03050
10 نانومتر الماعز المضاد للأرانبالذهب علوم المجهر الإلكتروني25108
الأجسام المضادة للعصبMilliporeAB5620
100٪ علوم المجهرالبيكريك 19550
96٪ بارافورمالديهايدأكروس عضوياAC41678-0030
25٪ جلوتارالديهايد (درجة EM)SigmaG5882
أسيتات اليورانيلعلوم المجهر الإلكتروني22400
p-PhenylenediamineSigmaP6001
كلوريدالبلاتين (IV)سيجما379840
علوم المجهرالإلكتروني لحمض التانيك21710
الإلكتروني لحمض

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  2. Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
  3. Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
  4. Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
  5. Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
  6. Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
  7. Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
  10. Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275(2012).
  11. Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
  12. Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
  13. Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
  14. Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
  15. Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
  16. Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
  17. Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
  18. Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
  19. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  20. Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
  21. Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
  22. Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
  23. Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة