وقد ولدت وجود microRNAs مستقرة (miRNAs) في exosomes مصلحة هائلة كوسيلة للاتصال بين الخلايا الرواية، لفائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية وكطريق للتدخل العلاجي. نحن هنا لشرح تنقية exosome من الدم والثقافة وسائل الإعلام تليها الكمية PCR لتحديد miRNAs التي يجري نقلها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توجد miRNAs المستقرة في جميع سوائل الجسم وبعض miRNAs المنتشرة محمية من التدهور عن طريق العزل في حويصلات صغيرة تسمى الإكسوسومات. يمكن أن تندمج الإكسوسومات مع غشاء البلازما مما يؤدي إلى نقل الحمض النووي الريبي والبروتينات إلى الخلية المستهدفة. تشمل وظائفها البيولوجية الاستجابة المناعية وعرض المستضد والتواصل داخل الخلايا. أدى توصيل miRNAs التي يمكنها تنظيم التعبير الجيني في الخلايا المتلقية عن طريق الدم إلى فتح طرق جديدة للتدخل المستهدف. بالإضافة إلى تقديم استراتيجية لتوصيل الأدوية أو العوامل العلاجية للحمض النووي الريبي ، يمكن أن تكون المحتويات الخارجية بمثابة مؤشرات حيوية يمكن أن تساعد في التشخيص وتحديد خيارات العلاج والتشخيص.
سنصف هنا إجراء التحليل الكمي للميرنا والحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) من الإكسوسومات التي تفرز في وسط زراعة الدم والخلايا. سيتم تمييز الإكسوسومات المنقاة باستخدام تحليل اللطخة الغربية للعلامات الخارجية و PCR ل mRNAs ذات الأهمية. سيتم استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ووضع العلامات على الذهب المناعي للتحقق من صحة مورفولوجيا وسلامة الإكسوسوم. سيتم تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من هذه الإكسوسومات للتأكد من أنه يمكننا دراسة كل من mRNA و miRNA من نفس العينة. بعد التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة المحلل الحيوي ، سنقوم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) متوسط الإنتاجية لتحديد miRNA الخارجي باستخدام بطاقات Taqman Low Density Array (TLDA) ودراسات التعبير الجيني للنصوص ذات الأهمية.
يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحديد التغيرات في miRNAs الخارجية في المرضى ونماذج القوارض ووسائط زراعة الخلايا قبل وبعد التدخل الدوائي. تختلف محتويات الإغزومات بسبب مصدر المنشأ والظروف الفسيولوجية للخلايا التي تفرز الإكسوسوم. يمكن أن توفر هذه الاختلافات نظرة ثاقبة حول كيفية تعامل الخلايا والأنظمة مع الإجهاد أو الاضطرابات الفسيولوجية. تظهر بياناتنا التمثيلية اختلافات في miRNAs الموجودة في الإكسوسومات المنقاة من دم الفأر والدم البشري ووسط زراعة الخلايا البشرية.
سنصف هنا إجراء التحليل الكمي للميرنا والحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) من الإكسوسومات التي تفرز في وسط زراعة الدم والخلايا. سيتم تمييز الإكسوسومات المنقاة باستخدام تحليل اللطخة الغربية للعلامات الخارجية و PCR ل mRNAs ذات الأهمية. سيتم استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ووضع العلامات على الذهب المناعي للتحقق من صحة مورفولوجيا وسلامة الإكسوسوم. سيتم تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من هذه الإكسوسومات للتأكد من أنه يمكننا دراسة كل من mRNA و miRNA من نفس العينة. بعد التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة المحلل الحيوي ، سنقوم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) متوسط الإنتاجية لتحديد miRNA الخارجي باستخدام بطاقات Taqman Low Density Array (TLDA) ودراسات التعبير الجيني للنصوص ذات الأهمية.
يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحديد التغيرات في miRNAs الخارجية في المرضى ونماذج القوارض ووسائط زراعة الخلايا قبل وبعد التدخل الدوائي. تختلف محتويات الإغزومات بسبب مصدر المنشأ والظروف الفسيولوجية للخلايا التي تفرز الإكسوسوم. يمكن أن توفر هذه الاختلافات نظرة ثاقبة حول كيفية تعامل الخلايا والأنظمة مع الإجهاد أو الاضطرابات الفسيولوجية. تظهر بياناتنا التمثيلية اختلافات في miRNAs الموجودة في الإكسوسومات المنقاة من دم الفئران والدم البشري ووسائط زراعة الخلايا البشرية
المقدمة
miRNAs غير مكود قصيرة تعدل التعبير الجيني عن طريق الربط إلى الهدف مرنا. البذور تسلسل التكامل بين ~ 7 أزواج قاعدة تمكن ميرنا لربط مرنا الهدف مما أدى إلى تثبيط الترجمة أو في انخفاض في استقرار مرنا، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في التعبير عن بروتين الهدف 1. حيث أثبت بحث علمي على مدى العقد الماضي بشكل لا لبس فيه دورا أساسيا لmiRNAs في التوسط في الوظائف الخلوية. وكان هناك أيضا جهدا كبيرا توجه نحو تشريح ميرنا التغيرات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض المختلفة بوساطة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتحديد الأخيرة لل miRNAs مستقرة في سوائل الجسم 4-6 مهدت الطريق لاستخدامهم المؤشرات الحيوية رواية قابلة للتشخيص السريري.
وضع واحدة من وسائل النقل ميرنا في سوائل الجسم هو عبر exosomes، حويصلات صغيرة التي تحمل mRNAs و، البروتينات، الدهون وسطاء، وmiRNAs إلى خلايا المتلقي عبر النظامية circulat الدمأيون 7-14. هذه النتائج في التشكيل التعبير الجيني في الخلايا المتلقية ويمثل آلية جديدة للاتصالات الخلوية. على سبيل المثال، يمكن أن الخلايا المناعية تعدل العمليات التنظيمية عن طريق إفراز و / أو exosomes امتصاص الجزيئات الحيوية التي تحتوي على المشاركة في التهاب مثل انترلوكين 1β (IL1β)، عامل نخر الورم α (TNFα)، وتحويل عامل النمو β5 (TGFβ5)، و وmiRNAs التي تنظم هذه الجينات 13. كما الشاذة التعبير ميرنا هو سمة مشتركة في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، وهذه الجزيئات فرصا جديدة مثيرة لاكتشاف والتحقق من أهداف علاجية جديدة 2.
miRNAs تعميم موجودة في جميع سوائل الجسم وأنه من المعروف أن تكوين exosomes يختلف استنادا إلى الخلايا المصدر الذي تم الإفراج عنهم. وبالتالي فإنها تقدم وسيلة لدراسة الحالة الفسيولوجية للخلايا وكيف الخلايا يغير إشارة حتىTS ردا على الإجهاد بما في ذلك الأمراض. يمكن دراسة تغيرات في تكوين exosome توفير نظرة ثاقبة نقل الإشارة والتحقيق فائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية أو المسارات التدخل العلاجي.
هنا سوف نظهر تنقية exosomes من مصادر متعددة استنادا إلى البروتوكولات التي تم نشرها. وسوف تستخدم هذه exosomes لعزل الحمض النووي الريبي تليها QPCR لتحديد وقياس مستويات لل miRNAs موجودة في exosomes.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأعدم جميع التجارب باستخدام عينات دم من الإنسان والقوارض في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. التحق البشر بعد إعطاء الموافقة المسبقة على النحو الذي أقرته جامعة دريكسيل كلية الطب مجلس المراجعة المؤسساتي وجميع إجراءات الدراسات التي أجريت باستخدام حيوانات وافق عليها المؤسسي رعاية الحيوان دريكسيل واستخدام اللجنة.
1. تنقية Exosome من الدم (~ 5.5 ساعة)
TIPS
- نحن resuspend exosomes من أنبوب واحد من الدم (~ 10 مل دم الإنسان و~ 2 مل دم الماوس) في 300 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي الريبي من mirVana ميرنا عدة العزلة.
- لتنقية exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، ونسج وسائل الإعلام في 500 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الخلايا وتصفيتها أيضا من خلال مرشح 0.22 ميكرون بعد الطرد المركزي في 12،000 ز س. تنقية exosome من وسائل الإعلام ثقافة الخليةلا يتطلب التخفيف في برنامج تلفزيوني، ويغسل PBS أو الخطوة الثانية تنبيذ فائق.
- إذا كان سيتم استخدام exosomes تنقيته للدراسات البروتينات، إضافة السكروز التدرج خطوة الطرد المركزي بعد خطوة تنبيذ فائق سوف تقلل من كمية البروتين المجاميع والملوثات 15.
- مورفولوجية المرصودة من exosomes يمكن أن تختلف اعتمادا على كل من المصدر والخطوات اللازم للتجهيز لTEM. نحن لم تراع التشكل على شكل كوب لexosomes التي ويعزى سابقا إلى الاختلافات في تجهيز العينات 9،15. لدينا صور TEM بما في ذلك وضع العلامات immunogold مماثلة لتقارير سابقة من مصادر مختلفة بما في ذلك الدم، الصفراوي والثقافة القشرية المستمدة exosomes 9،16،17.
- عكس EDTA أنبوب المغلفة التي تحتوي على الدم 5X ومكان تستقيم في درجة حرارة الغرفة ل10-60 دقيقة.
- الطرد المركزي في 2،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. لى>
- جمع الطبقة العليا، والبلازما، في 15 مل أنابيب والحفاظ على الجليد.
- تمييع السائل مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 2،000 XG في 4 درجات مئوية.
- نقل إلى أنابيب الطرد المركزي، إضافة 1X PBS لوحدة تخزين ما مجموعه 24 مل، وأجهزة الطرد المركزي 45 دقيقة في XG 12،000 في 4 درجات مئوية.
- نقل إلى أنابيب منبذة فائقة وأجهزة الطرد المركزي 2 ساعة على 110،000 XG في 4 درجات مئوية.
- بيليه resuspend في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي 1 ساعة على 100،000 XG في 4 درجات مئوية.
- بيليه resuspend في المخزن المناسب (العازلة تحلل الحمض النووي الريبي).
- resuspend في برنامج تلفزيوني أو RIPA العازلة للفحص المجهري الإلكترون وتحليل لطخة غربية على التوالي.
2. RNA تنقية باستخدام mirVana كيت عزل ميرنا التعديل (~ 1 ساعة)
TIPS
- إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
- الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن بروتوكول من البائع يعطي الخيار لتنقية ميرنا فقط، ونحن دائما عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك مرنا وميرنا حتى نتمكن من دراسة كلا من نفس العينة.
- مضيفا إن على من عمود خطوة العلاج الدناز يزيل آثار من الحمض النووي التي قد تكون موجودة. اعتمادا على مصدر exosomes، تم الإبلاغ عن الحمض النووي لتغيبه في exosomes تنقيته من بعض المصادر بما فيها الماوس وخطوط الخلايا البدينة الإنسان 8 ولكن تم الكشف عن تسلسل الحمض النووي الكروموسومات في exosomes تنقيته من وسائل الإعلام من العضلية مثقف 18.
- خفضنا حجم محلول الغسيل 1-350 ميكرولتر (الخطوة 2.4 أدناه) لأن البائع يقدم فقط ما يكفي من غسل حل 1 ل700 واحد بالإضافة ميكرولتر. إذا لم يتم خفض حجم ليس هناك حلا كافيا تركت لاستخدام محتويات عدة كامل. أجريت الخطوات المتبقية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- إضافة 1/10 VOلوم من ميرنا المضافة جناسة (30 ميكرولتر)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- استخراج مع حجم حمض الفينول: الكلوروفورم مساويا لحجم المحللة الأولية. أجهزة الطرد المركزي واستعادة المرحلة العليا في أنبوب جديد.
- إضافة 1.25 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ (375 ميكرولتر). دوامة. تطبيق لتصفية خرطوشة وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
- إضافة نصف أوصت حجم ميرنا غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
- إضافة 10 ميكرولتر الدناز 1-70 ميكرولتر العازلة نشر الإشعاعات (QIAGEN) لكل عينة. إضافة 80 ميكرولتر إلى العمود واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
- أضف غسل الحل 2/3 (500 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س. تكرار.
- أزل مع 40 ميكرولتر 95 ° C nuclease خالية-H 2 O.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ويخفف من الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر.
3. التنميط ميرنا من Exosomes من فيلات الفندقيةد عن طريق Taqman صفيف منخفض الكثافة (TLDA) بطاقات (~ 6.5 ساعة)
TIPS
- إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
- ينصح قبل التضخيم (قبل أمبير) خطوة ل1-350 نانوغرام الحمض النووي الريبي (350-1،000 عينات نانوغرام لا تتطلب خطوة ما قبل أمبير بعد التوليف [كدنا]). ومن المهم تحديد ما إذا كان ما قبل أمبير هو ضروري لعينتك لأنه يجب معاملة جميع العينات تحت ظروف متساوية. الخطوة ما قبل أمبير يضيف التكلفة والقيم المقطعية لديهم انخفاض خفض قبالة مقبول (32 بدلا من 40).
- ومن المفيد لإعداد رد فعل [كدنا] في أنابيب الشريط بدلا من لوحة اعتمادا على عدد من البطاقات التي يمكن تشغيلها في يوم واحد. وهذا سيقلل تجميد أذاب عينات من [كدنا] التي لن تتم معالجتها في نفس اليوم.
- Exosomes تم جمعها من مصادر مختلفة لها diffeاستئجار كميات من الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول يسمح بحد أقصى 3 ميكرولتر قالب الحمض النووي الريبي للتفاعل التوليف [كدنا]. اعتمادا على مصدر، وكمية من الحمض النووي الريبي exosomal التي يمكن أن تكون معزولة محدودة ربما. في حين أن الأنسجة نموذجية سيحقق ما يكفي من الحمض النووي الريبي التي من شأنها أن كدنا] أن تكون مصنوعة من 100 نانوغرام في الحمض النووي الريبي 3 حجم ميكرولتر، exosomes من الدم البشري أو وسائل الإعلام ثقافة الخلية البشرية غالبا ما تحتوي على أقل RNA وكدنا] يجب أن تكون مصنوعة من مواد أقل البداية. exosomes الدم الماوس تحتوي على مستويات أعلى من الحمض النووي الريبي ويمكن الحصول عليها لا يقل عن 100 نانوغرام في 3 ميكرولتر.
- لإعداد [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجمعات ميجابلكس عكس الاشعال الناسخ (A بركة وبركة تحتوي على الاشعال لmiRNAs على بطاقات ميكروفلويديك B صفيف A و B)، أذاب المكونات رد فعل على الجليد.
- تسمية اثنين من ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنابيب لرد فعل RT جانب حمام سباحة للالاشعال أو بركة B الاشعال وإضافة مكونات من أجل التخطيط. إضافة واحد على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل رانه بائع.
| RT مكون رد فعل | تركيز عنصر | حجم العينة ل1 (مجموع V / عينة = 4.5 ميكرولتر) |
| المياه nuclease خالية- | 0.20 ميكرولتر | |
| ميجابلكس RT العازلة (10X) | 1X | 0.80 ميكرولتر |
| dNTPs (100 ملم) | 4.4 ملي | 0.20 ميكرولتر |
| MgCl 2 (25 ملم) | 5 ملي | 0.90 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز المانع (20U/μl) | 2 U | 0.10 ميكرولتر |
| ميجابلكس RT الاشعال A أو B (10X) | 1X | 0.80 ميكرولتر |
| MultiScribe الناسخ العكسي | 75 U | 1.50 ميكرولتر |
- عكس أنابيب 6 مرات والمائةrifuge لفترة وجيزة. ثم، ماصة 4.5 ميكرولتر RT مزيج التفاعل إلى MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري.
- إضافة 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وضبط مستوى الصوت إلى 3 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC أو إضافة 3 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع، وإثارة مع طرف ماصة، وختم أنابيب أو لوحة. تدور لفترة وجيزة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- تحميل رد فعل في الجهاز PCR وتشغيله وفقا للشروط التالية (على النحو الموصى به من قبل النظم البيولوجية ميجابلكس بروتوكول مجمعات التطبيقية):
| مرحلة | درجة الحرارة | وقت |
| دورة (40X) | 16 ° C | 2 دقيقة |
| 42 ° C | 1 دقيقة | |
| 50 ° C | 1 ثانية | |
| عقد | 85 ° C | 5 دقائق |
| عقد | 4 ° C | ∞ |
- تخزين [كدنا] في -20 ° C (جيد لمدة أسبوع واحد على الأقل) أو الاستمرار في الخطوة ما قبل أمبير التي يمكن تخزينها لمدة أسبوع واحد.
- ذوبان الجليد الاشعال PREAMP للسباحة وبركة A B على الجليد وعكس إلى المزيج. دوامة Taqman قبل الأمبير ماستر خلط والحفاظ على الجليد أيضا.
- متابعة الرسم البياني إضافة واحدة على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل البائع.
| قبل أمبير مكون رد الفعل | حجم العينة لمدة 1 |
| المياه nuclease خالية- | 7.5 ميكرولتر |
| Taqman ميكس ماستر PREAMP (2X) | 12.5 ميكرولتر |
| الاشعال PREAMP ميجابلكس A أو B (10X) | 2.5 ميكرولتر |
- ماصة 2.5 ميكرولتر RT الم ÙCT في MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري والاستغناء 22.5 ميكرولتر مزيج رد فعل PREAMP في كل بئر.
- ختم لوحة، واحتضان على الجليد 5 دقائق ثم تحميل العينة في الجهاز PCR. تعمل تحت الشروط التالية.
| مرحلة | درجة الحرارة | وقت |
| عقد | 95 ° C | 10 دقيقة |
| عقد | 55 ° C | 2 دقيقة |
| عقد | 72 ° C | 2 دقيقة |
| دورة (12X) | 95 ° C | 15 ثانية |
| 60 ° C | 4 دقيقة | |
| عقد | 99.9 ° C | 10 دقيقة |
| عقد | 4 ° C | ∞ |
- بعد الانتهاء من رد فعل PREAMP، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على أنابيب أو لوحة ثم قم بإضافة 75 ميكرولتر 0.1X TE 8.0 درجة الحموضة إلى كل بئر أو أنبوب.
- ختم وخلط وتدور لفترة وجيزة. تخزين المنتج المخفف لمدة أسبوع عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو الاستمرار على لتحميل لوحة.
- الجمع بين ما يلي في ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنبوب على الجليد.
| عنصر | الصوت لبطاقة 1 |
| Taqman العالمي PCR ماجستير ميكس، لا AmpErase UNG (2X) | 450 ميكرولتر |
| المنتج PREAMP المخفف | 9 ميكرولتر |
| المياه nuclease خالية- | 441 ميكرولتر |
- عكس أنبوب لخلط وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. الاستغناء عن 100 ميكرولتر PCR مزيج التفاعل إلى كل منفذ من الرنا الميكروي بطاقة صفيف Taqman.
- أجهزة الطرد المركزي في بطاقة 2 × 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. ختم البطاقة وتشغيلها باستخدام النموذج المقدم مع الاشعال في النظم البيولوجية التطبيقية اليدوي وكذلك Taqman منخفض الكثافة 384 إعدادات صفيف. نحن نستخدم النظم البيولوجية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي التطبيقية.
4. مرنا التحليل من قبل Taqman (~ 1.5 ساعة)
- لإعداد رد فعل QPCR، مزج المكونات في رد فعل النظام في التخطيط. وسوف يتم تحليل جميع العينات مع تحقيقات التمهيدي لالجينات في المصالح وكذلك 18S الرنا الريباسي كما الجين الامور الى حالة طبيعية.
| Taqman مكون رد الفعل | حجم العينة لمدة 1 |
| المياه nuclease خالية- | 7 ميكرولتر (ضبط استنادا إلى عينة الفردية) |
| Taqman سريعة ماستر ميكس (2X) | 10 ميكرولتر |
| تحقيقات التمهيدي Taqman (20X) | 1 ميكرولتر |
| [كدنا] من الحمض النووي الريبي 100 نانوغرام | 2 ومو، L (ضبط على عينة الفردية) |
- تشغيل لوحة جيدا باستخدام 96 بلوك 96 جيدا سريعة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (النظم البيولوجية التطبيقية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد عزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الدم أو خلية، ونقاء exosomes يمكن اختبارها من قبل المجهر الإلكتروني (EM) والغربية وصمة عار (أرقام 1A و 1B). أكدنا الاستعدادات exosome لدينا من مصادر مختلفة مع EM وطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة متعددة. الشكل 1A يظهر EM الصور تؤكد أن exosomes سليمة التي يبلغ قطرها 30 نانومتر ~ -100 وتحتوي على CD81 بواسطة وضع العلامات immunogold. علامات exosomal شيوعا هي بروتينات سكرية الأسرة HSP70 وtetras...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، وتبين لنا من القياس الكمي لل miRNAs وmRNAs وتنقيته من exosomes بواسطة الطرد المركزي المغاير من الدم والثقافة وسائل الإعلام. Exosomes على مكونات متنوعة تعتمد على أصلهم وتشارك في عدد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة المناعية، العرض مستضد، الاتصال بين الخلايا، ونقل الحمض النووي الريبي والبروتينات 9،11،12،19،20. بينما حجم وشكل هو أحد المحددات من النقاء exosome، عددا من ورقات تظهر EM البيانات من exosomes تشير إلى أن هذه الحويصلات يمكن أن تتراوح ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة من جانب صناديق من ريتا منحة مؤسسة ألين لاجيت سينا. فإن الكتاب أود أن أنوه اريكا بالوغ والدكتور سوميترا Ghoshroy من جامعة ولاية كارولينا الجنوبية مركز المجهري إلكترون للاستخدام الصك، المساعدة العلمية والتقنية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| vacutainer المطلي ب EDTA (أنابيب 10 مل) | Diagnostics | 366643 | لتنقية الإكسوسوم من دم الإنسان |
| المغلفة ب EDTA (أنابيب 2 مل) | Diagnostics | 367841 | لتنقية الإكسوسوم من دم الفأر |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | لعزل miRNA من إجمالي |
| الدم miRVana microRNA Kit | Ambion | AM1561 | |
| حمض الفينول: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix ، No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | لبطاقات TLDA |
| مجموعة تجمع القوارض Megaplex RT v3.0 | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4444746 | |
| مجموعة تجمع القوارض Megaplex preamp v3.0 | الحيوية التطبيقية | مجموعة 4444747 | |
| Taqman Array MicroRNA MicroRNA A + B مجموعة V3.0 | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4444909 | |
| Megaplex RT مجموعة حمام السباحة البشرية V3.0 | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4444745 | |
| Megaplex Preamp مجموعة تجمع بشرية v3.0 | أنظمة حيوية تطبيقية | 4444748 | |
| مجموعة بطاقات MicroRNA البشرية A + B مجموعة البطاقات v3.0 | الحيوية التطبيقية | 4444913 | |
| تقم مجموعة MicroRNA RT | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4366596 | |
| Taqman مزيج رئيسي تفاعل البوليميراز المتسلسل العالمي | السريع للأنظمة الحيوية التطبيقية | 4366072 | ل mRNA qRT-PCR |
| عامل نخر الورم (مسبار أولي) | الأنظمة الحيوية التطبيقية | Hs01113624_g1 | |
| عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (مسبار أولي) | الحيوية التطبيقية | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand (cDNA طقم توليف ل RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | للجسم المضاد mRNA |
| HSP70 | Abcam | ab94368 | للبقعة الغربية |
| المضادة للأرانب IgG-Gold | Sigma | G7402 | للفحص المجهري الإلكتروني |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| النيكل 300 شبكة شبكات الكربون formvar | علوم المجهر الإلكتروني | FCF300-Ni | |
| النحاس 300 شبكة الكربون formvar الشبكات | علوم المجهر الإلكتروني | FCF300-Cu | |
| <قوي>الجدول 1.< / قوي> جدول الكواشف المحددة. |
المراجع
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148(2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282(2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653(2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
