يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

10.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50300

⸱

أبريل 2, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University

في هذه المقالة

ملخص

هذه التقنية يوفر طريقة لجني، وتطبيع وقياس النمو داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية التي تم مسبقا المزروعة في الطبيعية الخلايا المضيفة الأوالي قبل التهابات خلايا الثدييات. يمكن تعديل هذه الطريقة لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة للمرحلة فتيلة وكذلك أنواع الخلايا المستهدفة.

الملخص

العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استخدام الخلايا الأوليات المياه العذبة الطبيعية كمستودع للانتشار في البيئة. الفيلقية المستروحة، العامل المسبب للالتهاب الرئوي يدجينيرز "، يسعى إلى اكتساب ميزة على الممرضة في المختبر البكتيريا مثقف عندما تحصد الأولى من الخلايا وحيدة الخلية قبل إصابة الضامة الثدييات. هذا يشير إلى أن هناك عوامل قد لا يمكن التعبير عنها الفوعة المهم بشكل صحيح في المختبر. قمنا بتطوير نظام للين العريكة L. فتيلة المستروحة من خلال المضيف الطبيعي الأوالي الشوكميبة castellanii قبل للإصابة خلايا الثدييات. يمكن فحص مساهمة أي عامل الفوعة بمقارنة النمو داخل الخلايا متحولة إلى سلالة البرية من نوع البكتيريا بعد فتيلة الأوالي. ، معربا عن GFP L. البرية من نوع ومتحولة وتستخدم سلالات المستروحة لتصيب monolayers الأوالي في خطوة فتيلة وسمح للوصول إلى المراحل المتأخرة من نمو الخلايا. ثم يتم حصاد هذه البكتيريا الفلورسنت من الخلايا المصابة وتطبيع بواسطة القياس الطيفي لتوليد أرقام قابلة للمقارنة من البكتيريا لعدوى لاحقة في الضامة الثدييات. لالكمي، ويتم رصد البكتيريا الحية بعد الإصابة باستخدام المجهر مضان، التدفق الخلوي، والطلاء مستعمرة. هذه التقنية تعتمد على الضوء ومساهمة الجينات التعبير المضيف الخلية التي تعتمد على عن طريق محاكاة البيئة التي ستواجه في طريق اكتساب الطبيعية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب أي بكتيريا يستخدم المضيف الوسيط كوسيلة لكسب ميزة المسببة للأمراض.

المقدمة

وقد تكيفت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استراتيجيات عامة لاستغلال الخلايا المضيفة من أجل البقاء والتكرار في حجرة داخل الخلايا. في كثير من الحالات، وآليات متشابهة بين الممرضة والخلايا metazoan الأوالي. ومع ذلك، فإن هذه microenvironments مختلفان جدا ويمكن أن يؤدي إلى التعبير الفرق من عوامل الفوعة 1-4. ويرتبط بتواجد مطلق هذه الكتائب 'المرض بكتيريا البكتيريا المستروحة مع بيئات المياه العذبة في جميع أنحاء العالم 5. الأهم من ذلك، L. المستروحة المزروعة في خلايا الأوالي قبل إصابة الإنسان حيدات اكتساب ميزة المسببة للأمراض، مما يوحي بأن ملامح التعبير الجيني العالمي للبكتيريا تخرج خلية الأوالي مختلفة من أن من يزرع في المختبر الكائن 6-8. في الطبيعة، الأميبات المياه العذبة توفير حدود الغنية بالمغذيات لتضخيم السريع للبكتيريا الغازية. الإنسان اقتناء L. pneumophوغالبا ما تعزى إلى دائرة الأراضي استنشاق قطرات المياه الملوثة التي تحتوي على البكتيريا. ومن المرجح أن هذه قطرات الميناء الأوالي الخلية المرتبطة البكتيريا؛ حيث الخلايا وحيدة الخلية هي أكثر مقاومة للممارسات التقليدية لمعالجة المياه 9،10. إصابة عائدات الرئة الضامة السنخية بطريقة مماثلة تقريبا لدورة حياة الخلايا من البكتيريا في الخلايا المضيفة الأوالي 11-13.

من أجل البقاء على قيد الحياة والتكاثر في الخلايا حقيقية النواة، L. المستروحة يستخدم نظام IVB المتخصصة إفراز نوع يسمى دوت / ICM لتقديم ما يقرب من 300 "المستجيب" البروتينات في العصارة الخلوية للخلية المضيفة 14-16. هذه البروتينات تعمل بشكل جماعي المستجيب لتخريب العمليات الخلوية من أجل توليد حجرة النسخ المتماثل للبكتيريا الإباحية 17،18. الحذف في أي من الجينات ال 26 التي تتألف منها نتيجة نقل دوت / ICM في سلالات الخلايا التالفة لmultiplication 19-23. تاريخيا، حذف الجينات الفردية ترميز المستجيب نادرا ما أسفرت سلالات موهنة للنمو داخل الخلايا. وقد تعزى هذه الظاهرة إلى عدة فرضيات بما في ذلك وظيفة زائدة عن الحاجة ونسخ paralogous من المستجيبات.

وأعرب فقط بعض عوامل الفوعة في سياق النمو داخل الخلايا المضيفة الخلية المرتبطة 24. ترشيد أننا إذا وأعرب سوى المستجيب سيما في سياق الإصابة الأوالي، ثم لا يمكن أن مساهمة المستجيب يمكن مقارنتها مع سلالة من النوع البري عندما تم تربيتها على حد سواء في المختبر. L. المستروحة التحولات من تنسخي قابل للنقل إلى مرحلة وهي تدخل مرحلة ثابتة في الثقافة 25. النمط الظاهري التحول يمثل مرحلة نضوب المغذيات واجهتها خلال النمو داخل الخلايا ويتمثل من خلال جمعية حركية للسياط 26. لأن L. المستروحة أكثر invaسعينا SIVE وضراوة عندما تحصد من الخلايا وحيدة الخلية، وضع مقايسة أن أكثر بأمانة تمثل الدولة المسببة للأمراض من البكتيريا عندما واجهت الضامة المضيف.

ولهذه الغاية، قمنا بتطوير فتيلة الأوالي تنوعا الفحص التي يمكن أن تستوعب أي مضيف مناسبة لكلا من الإصابات الأولى (الخلية فتيلة) والمرحلة الثانية (الخلية الهدف). عملية العدوى لين العريكة من خلال استخدام البكتيريا التعبير عن ثابت بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نموذج للعدوى castellanii الشوكميبة الأوالي يتبع المنهجية المستخدمة على نطاق واسع في مجال 27. للخطوة فتيلة، L. تزرع سلالات المستروحة في المختبر لمرحلة ثابتة في وسائل الإعلام لإنتاج السائل "قابل للنقل" المسمى البكتيريا (الشكل 1A). وتستخدم القادمة البكتيريا لتصيب monolayers من A. castellanii لمدة 18 ساعة لتحقيق مرحلة متأخرة من دورة الحياة داخل الخلايا. فجوات كبيرة تحتوي علىويمكن تصور جي البكتيريا في هذه المرحلة باستخدام المجهر مضان الوقت (الشكل 1A). وهي lysed ثم الخلايا الأوالي ويتم قياس البكتيريا التي عثر عليها على المحللة للالانبعاثات في 512 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مضان. ويرتبط مضان مع الكثافة البصرية لحساب تعدد من بين العدوى (وزارة الداخلية) لإصابة الخلايا المستهدفة (الشكل 1، * كيرف الارتباط). بعد ساعة الغزو (T 0) و 18 في مرحلة ما بعد الغزو (T 18)، وكمية الخلايا المستهدفة لمضان، تمثل البكتيريا داخل الخلايا. يمكن رصدها مضان المجهري والتدفق الخلوي، ويمكن قياس التهم قابلة للحياة من خلال الطلاء مستعمرة. ويرافق دائما الفحص عن طريق العدوى مع فتيلة من النوع البري L. المستروحة وسلالة عيب في النظام نوع دوت / ICM إفراز الرابع (Δ DOTA) (الشكل 1A). هذا يوفر الأهم الضوابط الداخلية للمقارنات مباشرة بين البرية من نوع أالثانية أي سلالات متحولة إسوية الجينات المستخدمة في عملية العدوى. إدراج سلالة عديم الفوعة DOTA Δ خلال المرحلة فتيلة يحدد الحد الأدنى لمراقبة الظواهر يضعف من نمو المرتبطة سلالات متحولة إسوية الجينات التي يتم تربيتها في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الثقافات المستروحة البكتيريا لعدوى مرحلة الاشعال

  1. تحويل جميع L. سلالات المستروحة المستخدمة في الفحص مع pAM239 البلازميد، ترميز الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) قابل للتحريض بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 28. خط السلالات البكتيرية على الحديد والسيستين تستكمل N-(2-Acetamido)-2-حمض aminoethanesulfonic (ACES) مخزنة أجار الفحم خلاصة الخميرة (CYEA) التي تحتوي على 6،25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CM) (للصيانة بلازميد) واحتضان لمدة 72 ساعة في 37 ° C.
  2. نقل مجموعة اللقاح من السلالة البكتيرية في ACES تستكمل مخزنة الخميرة مرق استخراج (آي) مع 6،25 ميكروغرام / CM مل و 1 IPTG ملم وزراعة إلى الطور الثابت (O / N) على شاكر المداري في 37 ° C.
  3. تأكيد التعبير GFP في المختبر في الثقافات باستخدام المجهر مضان. نقل 10 ميكرولتر من الثقافة على شريحة زجاجية تحت غطاءزلة والصورة باستخدام الهدف 60X مع الإثارة GFP / مكعب الانبعاثات (AMG EVOS فلوريدا).
  4. تمييع 100 ميكرولتر مأخوذة من كل في الثقافة المختبر ل1:10 باستخدام معقم H 2 O. جعل فارغة باستخدام 100 ميكرولتر AYE وسائل الاعلام مع IPTG مم 1 و 6.25 ميكروغرام / مل الطول والماء. اتخاذ OD600 قياسات التخفيفات باستخدام الطيف (بيو راد الذكية المواصفات زائد). حساب حجم اللازمة لنقل العدوى بشكل جيد في ل20 = وزارة الداخلية لكل ثقافة في المختبر: V = [(الأميبا المصنف) × زارة الداخلية] / [OD 600 × (عامل تخفيف) × (الثابتة)] = [(1 X 10 6 ) × (20)] / [OD 600 × (10) × (1 × 10 6)] = 2/OD 600. يتم تحديد تركيز البكتيريا وOD 600 = 1.0 = 1 × 10 9 CFU / مل.

2. فتيلة العدوى عن طريق الشوكميبة المرحلة castellanii

  1. صيانة وزراعة الأميبات في المتوسط ​​ATCC PYG 712 في 175 سم 2 القوارير في RT.
  2. استبدال وسائل الإعلام في طريق مسدود الأميباتتوريس 24 ساعة قبل بدء الثقافات البكتيرية السائلة. في نفس اليوم تم تشغيلها الثقافات البكتيرية السائلة، وجمع والاعتماد على الخلايا المجهر ضوء باستخدام عدادة الكريات.
  3. تمييع الأميبات مع وسائل الاعلام جديدة لتركيز النهائي من 1 × 6 10 خلايا / مل. بذور ثقافة الخلية 12-وحات جيدة مع مليلتر مأخوذة 1 من الأميبات باستخدام pipettor تكرار واحتضان في O RT / N.
  4. بعد الحضانة، وغسل الآبار لوحات خلية ثقافة 12-3X جيدا مع 1 مل العقيمة PBS باستخدام 10 مل ماصة المصلية والمساعدات ماصة اليدوي.
  5. بعد تطلع PBS، إضافة 1ml من وسائل الإعلام العدوى (712 ATCC سائل الإعلام PYG ناقص الجلوكوز، ببتون، وخلاصة الخميرة) مع IPTG مم 1 و 6.25 ميكروغرام / مل سم إلى كل بئر. احتضان لوحات في لRT 1 ساعة.
  6. تصيب آبار في وزارة الداخلية 20 =. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق (إيبندورف 5810R) وتطفو في حمام مائي 37 ° C لمدة 5 دقائق. نقل لوحة إلى C ° 37، 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 18 ساعة.
  7. تأكيد العدوى باستخدام الحية التصوير الخلية على المجهر مضان قبل استضافة تحلل الخلايا والحصاد من البكتيريا.

3. بذر THP-1 لخلايا الخلية المستهدفة العدوى المرحلة

  1. (بدء هذه العملية 24 ساعة قبل إقامة الثقافات البكتيرية السائلة). زراعة THP-1 الخلايا في قوارير 75 سم 2 إلى ثقافة confluency القريب في وسائل الإعلام مع RPMI 1640 مصل الجنين 10٪ للحرارة المعطل البقري (FBS).
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات التعليق، تخفيف-1 THP الخلايا في وسائل الإعلام مع FBS 1640 RPMI 10٪ و 100 نانوغرام / مل phorbol-12-ميريستات-13-خلات (PMA) إلى تركيز الخلايا من 1 X 6 10 / مل ، وصفيحة في 1 مليلتر مأخوذة في 12 لوحات جيدة ثقافة الخلية. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

4. تجهيز البكتيريا لعدوى الخلية المستهدفة بعد مرحلة الاشعال العدوى المرحلة

  1. نضح وسائل الإعلام من الأميبات معبي.
  2. ليز اmoebae باستخدام 500 ميكرولتر من الجليد الباردة، عقيمة جدا تصفيتها (UF) O 2 H واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
  3. بركة لست] وفقا لنوع سلالة واتخاذ قياس نانومتر E 512 للكل من المجمعة لست] باستخدام قارئ لوحة مضان (الجزيئية الأجهزة Spectramax الجوزاء EM).
  4. حساب بقيمة 600 OD قياس لتجميع لست]: 600 = 0.0008 calcOD (E 512 - المحللة الخلفية) + 0.0019. وقد سبق تحديدها الصيغة من الرسوم البيانية المقارنة المباشرة لOD ​​كل من 600 و لE القياسات نانومتر 512 من التخفيفات من L. المستروحة البرية من نوع GFP التعبير من الطور الثابت في الثقافة المختبر (الشكل 1 *). يتم استخدام لست] من الأميبا غير مصاب، مع مراعاة الشروط التجريبية نفس الاميبا المصابة، وفارغة، وقدمت قيمة التصحيح (على سبيل المثال خلفية المحللة)، والتي تأسست في المعادلة. ر حجم اللازمةس تصيب بئر في وزارة الداخلية ويتم احتساب = 20 لكل تجمع المحللة: V = [(THP-1 المصنف) × زارة الداخلية] / [calcOD 600 × (الثابتة)] = [(1 × 10 6) × (20)] / [calcOD 600 × (1 × 10 6)] = 20 / calcOD 600.
  5. غسل-1 THP الخلايا 3x مع PBS وإضافة 1 RPMI مل الطازجة 1640 (10٪ FBS) إلى كل بئر. احتضان خلايا THP-1: 1 ساعة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.
  6. تصيب الخلايا THP-1 في وزارة الداخلية محسوبة باستخدام لست] المجمعة. تسمح مجموعة من الآبار في البقاء غير مصاب، بمثابة المراقبة السلبية لتدفق تحليل cytometric. وينبغي استكمال تجهيز المرحلة فتيلة في أقل من 30 دقيقة. يتم الاحتفاظ لست] على الجليد للحد من أي تغييرات في التعبير الجيني البكتيري قبل الإصابة.
  7. لوحة أجهزة الطرد المركزي، تطفو الى رفع درجة الحرارة، واحتضان كما هو الحال في المرحلة فتيلة.
  8. ساعة واحدة بعد الإصابة، وإزالة وسائل الإعلام من الطموح وغسل الآبار 3x مع PBS لإزالة البكتيريا خارج الخلية.
  9. إضافة 1 مل الصحائفSH RPMI 1640 (10٪ FBS) إلى الآبار والعودة إلى لوحة الحاضنة. الوقت مباشرة بعد استبدال وسائل الإعلام بمثابة صفر الوقت (T 0). احتضان خلايا THP-1 ل14-16 ساعة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.

5. التجريبية التحليل

5.1 التصوير الخلية الحية

صورة الآبار المصابة باستخدام مجهر مضان (AMG EVOS فلوريدا) في 10X 20X التكبير أو (أرقام 1A-D). ويمكن مقارنة هذه الصور نوعيا أو كميا لتحديد مستويات الإصابة في كل مرحلة فتيلة والتهابات الهدف مرحلة الخلية.

5،2 تدفق الخلوي

  1. ويمكن مقارنة القمم الانبعاثات من الإصابات المختلفة من خلال التدفق الخلوي (BD FACS Calibur). يعرض للتريبسين المصابين THP-1 الخلايا وغسل بلطف لهم من الآبار عن طريق خلط في برنامج تلفزيوني مع ماصة.
  2. تجمع الخلايا وفقا لنوع السلالة إلى 15 أنابيب فالكون مل وبيليه عند 1،800 XG لمدة 2دقيقة في الجدول الطرد المركزي الأعلى.
  3. تعليق الكريات في 1 مل PBS ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  4. أجهزة الطرد المركزي في المعلقات في ز X 1800 (5424 إيبندورف) واعادة تعليق الكريات في 1 مل PBS. إذا عكرا عاليا المعلقات الناتجة يجب (OD 600 ≥ 1.0) أن تضعف أنها في PBS إضافية (1:3) لمنع انسداد خطوط تدفق عداد الكريات في.
  5. استخدام معقم PBS تصفيتها لموازنة تدفق عداد الكريات من وإلى اتخاذ خطوات غسل بين الحقن العينة. رسم مبعثر إلى الأمام / جانب من الخلايا المستهدفة غير مصاب قبل حقن العينات المستهدفة عدوى الخلية.
  6. جمع 20000 الأحداث الإجمالية لكل حالة استخدام 488 الإثارة الليزر نانومتر وقناة FL1.
  7. السكان بوابة الخلية بعد التقاطها لاستبعاد الخلايا غير المصابة وشدة المؤامرة مضان في الرسم البياني (FlowJo) (الشكل 1E).

5.3 CFU الطلاء

  1. دراسة كفاءة سالعدوى و من الطلاء CFU من الخلايا حصاد لالتدفق الخلوي. إعداد التخفيفات التسلسلي للعينات في فائقة تصفيتها O 2 H في 10 -1، 10 -2، و10 -3.
  2. لوحة 20 ميكرولتر من كل تخفيف على 1/3 من لوحة CYEA مع 6،25 ميكروغرام / مل CM.
  3. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة 72 ساعة.
  4. عد المستعمرات باستخدام مسواك ومكافحة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأوجز نتيجة نموذجية لعملية العدوى كامل في الشكل 1. يعيش micrographs مضان الخلية تصور monolayers من A.castellanii المصابين من النوع البري L. ويرد المستروحة خلال المرحلة فتيلة في 1A الشكل. ومن شأن الإجراء الناجح للخطوة تؤدي إلى فتيلة يبلغ عدد سكانها ما يقرب من 90٪ من الخلايا التي تحتوي على فجوات كبيرة المضيف ملؤها مع GFP المسمى البكتيريا في هذه MOI. في 18 ساعة العدوى آخر، فإن معظم A. حققت الخلايا castellanii

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم التحكم بإحكام البكتيرية التعبير الجيني من خلال مزيج من تقدم دورة الحياة والاستجابة لإشارات في المكروية المحيطة بها. فجوي مسببات الأمراض مثل L. المستروحة الاستجابة لعدد وافر من العظة الخلية المستمدة من المضيف عند مجزأة في يبلوع. ونتيجة لذلك الجماعي استنفاد المغذيات في الخلية المضيفة، والبكتيريا يعوض بالإعراب عن العوامل اللازمة لنشر ناجحة لخلية المضيفة لاحقة 25. L. تكييفها لالمستروحة تتطفل بكفاءة مجموعة متنوعة واسعة من الخلايا وحيدة الخلية و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور كريج روي والدكتور Zamboni داريو لتقديم نموذج للالتهابات الخلايا وحيدة الخلية. نشكر الدكتور Jagdeep Obhrai الدكتور بوردي جورجيانا، الدكتور فريد Heffron وتود ويزنر للمعدات والكواشف، والدكتور Cambronne ولو لمراجعة نقدية للمخطوطة. تم إجراء التدفق الخلوي في قياس التدفق الخلوي OHSU مرفق الموارد المشتركة. وأيد هذا العمل في جزء من منحة من مؤسسة أبحاث الطبية ولاية أوريغون ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R21 AI088275 (EDC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td colspan = "4" > Reagent < / strong> وسائل الإعلام < td colspan = "4" ><قوي> المعدات< / قوي> مركزي الأجهزة مساعدة مقياس برنامج
chloramphenicolFisher ScientificBP904-100المضاد الحيوي
IPTGFisher ScientificBP1755-10
ACESSigmaA9758-1KGمكون الوسائط
ATCC المتوسط: 712 PYGATCCوسائط النمو للكائنات
الأولية 1X PBSFisher الفوسفاتالعلمي SH30256FSالمخزن الملحي
الفحم المنشطفيشر ScientificC272-212مكون الوسائط
مستخلص الخميرةفيشر ScientificBP1422-500مكون الوسائط
الببتونBD التشخيص211677مكون الوسائط
أجارفيشر ScientificBP1423-2مكون
الوسائطL-cysteine ، 99٪ +Acros organics173601000مكمل الوسائط
نترات الحديديك غير الهيدراتفيشر ScientificI110-100ملحق
EVOS فلوريداAMGEVOS فلوريدامجهر مضان
ذكي المواصفات بالإضافة إلىBio-Rad170-2525مقياس الطيف الضوئي
5810 R جهاز طرد مركزيEppendorf22627023مقاعد البدلاء أعلى جهاز طرد
مكرر بالإضافة إلىEppendorf22230201ماصة متكررة
SpectraMax Gemini EMالجزيئيةقارئ الألواح
الدقيقة Softmax Pro 5.3الأجهزة الجزيئية0200-310برنامج قارئ الألواح
الدقيقة 5424 جهاز طرد دقيقEppendorf22620401سطح الطاولة جهاز طرد مركزي
دقيق مضخة ماصة سريعة الإطلاق IIماصة379111010 Scienceware
FACS CaliburBD Bioscienceالتدفق الخلوي
FlowJo 7.6.1قياس التدفقالخلوي لترخيصFlowJo
15 مل أنبوبBD Falcon352096أنبوب مخروطي البولي بروبلين
1.6 مل أنبوب ميكروفوجنبتون3745.Xأنابيب الطرد المركزي الدقيقة

المراجع

  1. Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
  2. Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
  3. Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
  4. Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
  5. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  6. Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
  7. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
  8. Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60(2011).
  9. Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
  10. King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
  11. Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
  12. Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
  13. Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
  14. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508(2009).
  15. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638Forthcoming.
  16. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136(2011).
  17. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
  18. Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
  19. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  20. Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
  21. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  22. Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
  23. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  24. Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
  25. Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
  26. Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
  27. Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
  28. Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
  29. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  30. Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Legionella pneumophilaتحضير الأولياتعدوى الخلايا الثدييةالمجهر الفلوريقياس التدفق الخلويوحدات تشكيل المستعمراتAcanthamoeba castellaniiتعبير GFPتحليل عوامل الضراوةالنمو داخل الخلايا
لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.