مقالة منهجية

على

18.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50332

⸱

يونيو 12, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

في هذه المقالة

ملخص

الضامة الوحيدات المستمدة هي خلايا مهم من نظام المناعة الفطرية. هنا، نحن تصف وسيلة سهلة لاستخدام في المختبر نموذج لتوليد هذه الخلايا. باستخدام الطرد المركزي المتدرج، والعزلة حبة السلبية والظروف والثقافة خلية معينة، يمكن أن تتولد الضامة الوحيدات المستمدة للدراسات المظهرية والوظيفية.

الملخص

الضامة الوحيدات المستمدة تمثل نوع من الخلايا مهم من نظام المناعة الفطرية. نماذج الماوس دراسة البيولوجيا بلعم يعانون من الاختلافات المظهرية والوظيفية بين الضامة الوحيدات المستمدة الفئران والإنسان. ولذلك، فإننا هنا وصف نموذج في المختبر لتوليد ودراسة الضامة الإنسان الأساسية. لفترة وجيزة، بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم المحيطي مستمدة من وريد الساعد، يتم عزل حيدات الخلايا وحيدات النوى من الدم المحيطي باستخدام السلبية العزلة حبة المغناطيسي. ثم يتم استزراع هذه حيدات لمدة ستة أيام في ظل ظروف معينة للحث على أنواع مختلفة من التمايز بلعم أو الاستقطاب. هذا النموذج هو سهل الاستخدام وتلتف المشاكل الناجمة عن الاختلافات بين أنواع محددة الماوس والرجل. وعلاوة على ذلك، فمن أقرب إلى الجسم الحي في ظروف من استخدام خطوط الخلايا خلده. في الختام، النموذج الموصوف هنا هو مناسبة لدراسة macrophagه علم الأحياء، وتحديد آليات المرض وأهداف علاجية جديدة. حتى وإن لم يكن تماما لتحل محل التجارب على الحيوانات أو الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها بعد الوفاة، ونموذج الموصوفة هنا يسمح تحديد الهوية والتحقق من آليات المرض والأهداف العلاجية التي قد تكون ذات أهمية كبيرة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.

المقدمة

تمثل الضامة الوحيدات المستمدة عنصرا الخلوية مهم من نظام المناعة الفطرية والمساهمة في العديد من العمليات الالتهابية الحادة أو المزمنة 1. الضامة تلعب دورا هاما في كثير من الأمراض الالتهابية مثل تصلب الشرايين أو السرطان 2. تظهر الضامة درجة عالية من المرونة وقادرة على تحمل الظواهر مختلفة اعتمادا على micromilieu المحلية 3. وهكذا، ودراسة التمايز بلعم وعدم التجانس أمر ضروري لزيادة معرفتنا الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض وحتى يمكن التعرف على أهداف علاجية جديدة وتطوير علاجات جديدة.

في كثير من الحالات، يتم استخدام نماذج الفئران للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لأمراض معينة. ومع ذلك، ودراسة علم الأحياء بلعم باستخدام نماذج الماوس يرافقه العديد من أوجه القصور: (1) نسبة أعداد فرعية الكريات البيض (أي حيدات والمحببة) في peripهيرال الدم من الفئران أو البشر تختلف بشكل ملحوظ مما يدل الأدوار المختلفة للحيدات في الفيزيولوجيا المرضية الفئران والإنسان. (2) هناك اختلافات جوهرية في التعبير الجيني بين الفئران والإنسان حيدات الدم المحيطي مما يوحي اختلافات جوهرية في وظيفتها أثناء الصحة والمرض 4. (3) وهناك عدد من العلامات التي تستخدم لتحديد حيدات الفئران والضامة (F4/80، LYC، الخ.) غير موجود في خلايا الدم النخاعي الإنسان، مما يجعل نقل النتائج في نماذج الماوس إلى الوضع الإنساني الصعب إلى حد ما.

وبالتالي، من أجل زيادة فهمنا للتمايز بلعم وعدم التجانس في الأمراض التي تصيب البشر، ونحن بحاجة إلى الاستفادة من نماذج العمل مع الضامة الإنسان. ولذلك، فإننا هنا تصف نموذجا للجيل بلعم الإنسان الأساسية التي هي سهلة الاستخدام وتتيح دراسة الضامة الوحيدات المستمدة البشرية في المختبر تحت ظروف مختلفة مما يؤدي إلى مختلف بلعم ص.أنواع larization. في العديد من الدراسات، ونحن قد استخدمت في نموذج المختبر من الوحيدات المستمدة الضامة الإنسان الأساسية لتحليل البيولوجيا بلعم وصلته المحتملة للتصلب الشرايين الإنسان 5-7.

حتى وإن لم يكن تماما لتحل محل التجارب على الحيوانات أو الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها بعد الوفاة، ونموذج الموصوفة هنا يسمح تحديد الهوية والتحقق من آليات المرض والأهداف العلاجية التي قد تكون ذات أهمية كبيرة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بروتوكول

  1. إعداد المخازن المؤقتة على النحو التالي:
    1. إعداد العازلة للعزلة PBMC: "غسل العازلة" = 0.02٪ EDTA في برنامج تلفزيوني (استخدام 0.5 M EDTA).
    2. إعداد عازلة لعزل الوحيدات: "MACS الشطف العازلة" = 0.5٪ BSA (250 ملغ) + 2 مم EDTA (200 ميكرولتر) + برنامج تلفزيوني (50 مل). ديغا المخزن المؤقت.
    3. إعداد العازلة للFACS تلطيخ وتخزين الخلايا: "نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة" = 10٪ FCS في برنامج تلفزيوني و"العازلة التثبيت" = 1٪ PFA في برنامج تلفزيوني.
  2. رسم 30 مل من الدم الكامل من الوريد الساعد. استخدام EDTA كما تخثر.
  3. عزل PBMC (histopaque) على النحو التالي:
    1. إعداد اثنين العقيمة 50 مل أنابيب (البولي ستايرين لا).
    2. تمييع الدم من الخطوة 2 مع برنامج تلفزيوني 1:1.
    3. إضافة 25 مل + 25 مل histopaque الدم الكامل / برنامج تلفزيوني في أنبوب. تأكد من أن histopaque والدم لا يختلطان.
    4. الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في RT، لا الفرامل.
    5. نضح البلازما وتجاهل.
    6. نضح واجهة غير واضحة ونظيفة ماصة في 50 مل حوض استحمامه.
    7. إضافة 20 مل من EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني.
    8. الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. تجاهل طاف.
    10. إضافة 10 مل من EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني.
  4. عد الخلايا على النحو التالي:
    1. مزيج جيد من قبل vortexing لمدة 10 ثانية.
    2. تأخذ 200 ميكرولتر تعليق خلية + 300 ميكرولتر EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني + 500 ميكرولتر من التريبان الأزرق (200-500 cells/10 الساحات، وتغيير وإلا عامل التخفيف).
  5. أداء العزلة السلبية للحيدات كما يلي:
    1. أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.10 لمدة 10 دقيقة، 120 ز س. تجاهل طاف.
    2. غسل بيليه الخلية 2X بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة، 120 ز س.
    3. إضافة 9 مل ماء معقم لمدة 3 ثوانى، إضافة 1 مل 10X PBS.
    4. يغسل مرة واحدة مع أكثر PBS + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة، 120 ز س.
    5. الاعتماد خلال الطرد المركزي.
    6. تمييع في المخزن EasySep في 5 × 10 7 / مل.
    7. إضافة 50 ميكرولتر / مل الديك تخصيب الوحيداتالذيل.
    8. احتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    9. حبات دوامة لمدة 30 ثانية.
    10. إضافة 50 ميكرولتر الخرز / مل.
    11. احتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    12. تملأ مع EasySep عازلة لإكمال حجم 2.5 مل. ويبدو أن الحل الآن البني.
    13. وضعت في المغناطيس.
    14. الانتظار 2.5 دقيقة في RT. خلال هذا الوقت الخلايا غير منضمة إلى الوحيدات حبة المغناطيسي سينتقل إلى الجدار أنبوب والعصا هناك.
    15. صب العازلة مع حيدات غير ملزم في أنبوب العقيمة الطازجة. هذا الحل يبدو بيضاء.
    16. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة، 120 ز س.
  6. لوحة الخلايا في طبق من البلاستيك أو لوحة متعدد الطبقات في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 6 / سم 2. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة / 1 × 10 6 خلايا.
  7. خلايا الثقافة في ظل ظروف من الفائدة ل6-14 أيام.
  8. تغيير وسائل الإعلام بعد 3 أيام عن طريق استبدال 50٪ من وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل).
  9. بعد ستة أيام حصاد الخلايا لعزل مرنا، التدفق الخلوي، النشاف الغربية، الخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه، ونحن بشكل روتيني الحصول على 25.1 الدم × 10 6 ± 2.2 × 10 6 monocytes/100 مل (متوسط ​​± الخطأ المعياري من 26 تجارب مستقلة، الشكل 1A). نقاء الوحيدات على النحو الذي يحدده تلطيخ تدفق cytometric لCD14 هو روتيني أكبر من 95٪ (97.1 ± 0.4٪، ومتوسط ​​± الخطأ المعياري من 3 تجارب مستقلة، 1B الشكل). بقاء الخلية من حيدات معزولة حديثا على النحو الذي يحدده التريبان الأزرق تلطيخ أكبر بصورة روتينية من 95٪ (لا ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الضامة الوحيدات المستمدة تمثل نوع من الخلايا الرئيسية لنظام المناعة الفطرية. أنها تلعب دورا هاما في كثير من الأمراض الالتهابية بما في ذلك تصلب الشرايين أو السرطان 2. وهكذا، ودراسة علم الأحياء بلعم أمر ضروري لزيادة المعرفة لدينا في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض والسماح تطوير علاجات جديدة.

تطبيق العديد من الدراسات من الماوس نماذج overexpressing أو تفتقر إلى جينات معينة من الفائدة. في حالة الضامة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لم يكن لديك للكشف عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر Wambsganss نادين للحصول على المساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من جمعية الألمانية للبحوث (GL599/1-1) وجزئيا من خلال منحة من صندوق الابتكار الحدودي (جامعة هايدلبرغ) إلى CAG

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي 50 مل (معقم) فيشر055398
D-PBS (1X) ، سائل (بدون كالسيوم أو مغنيسيوم)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep مجموعة تخصيبالجذعية البشرية19059
EasySep MagnetStemCellTechnologies 18000
أنابيب FACSفيشر352008
البلاعم-SFM (1X)Invitrogen12065-074
البنسلين الستربتومايسينSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
الإنسان M-CSF 10 & mu ؛ زPeprotech300-25
لوحات زراعة الخلايا 6 بئرفيشر07-200-80
الخلايا

المراجع

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

M1 M2

مقالات ذات صلة