يوصف أسلوب سهل وموثوق بها لتصور وقياس حركية الهوائية أهداب أهداب وتدفق تم إنشاؤها باستخدام الماوس القصبة الهوائية. يمكن تعديل هذه التقنية لتحديد كيف يمكن لمجموعة واسعة من العوامل التي تؤثر على حركية الأهداب، بما في ذلك وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة السابقين فيفو التصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة الأهداب في القوارض مجرى الهواء الظهارة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أنشئت تقنية فيفو السابقين للتصوير الماوس الهوائية ظهائر للتحليل الكمي من أهداب متحركة وظيفة مهمة لنظرة ثاقبة وظيفة التخليص مخاطي هدبي. يتم قطع المقطوع حديثا الماوس القصبة الهوائية طوليا من خلال العضلات رغامية والتي شنت في غرفة الجدران الضحلة على طبق زجاج القاع. يتم وضع عينة القصبة الهوائية على طول محورها الطويل للاستفادة من العضلات رغامية إلى حليقة طوليا. وهذا يسمح التصوير من الحركة الهدبية في الملف الشخصي على طول القصبة الهوائية بأكملها. ويتم الحصول على أشرطة الفيديو في 200 لقطة / ثانية باستخدام التدخل التفاضلية المجهري التباين وعالية السرعة كاميرا رقمية للسماح التحليل الكمي من تردد ضربات أهداب والموجي الهدبية. مع إضافة الخرز الفلورسنت أثناء التصوير، وأهداب ولدت تدفق السوائل أيضا يمكن تحديده. الوقت بروتوكول يمتد ما يقرب من 30 دقيقة، مع 5 دقائق لإعداد غرفة، 5-10 دقيقة لعينةتصاعد مستمر، و 10-15 دقيقة للvideomicroscopy.
المقدمة
تحليل وظيفة أهداب متحركة في مجرى الهواء ظهائر المهم تجريبيا لتوضيح العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر التخليص مخاطي هدبي والصحة الرئوية 1. بروتوكول بسيط وضعت لتصوير الماوس الهوائية ظهائر يوفر وسيلة فعالة لاستجواب مجرى الهواء حركية الأهداب في نماذج الماوس متحولة وخروج المغلوب، وتتطلب فقط المهارات الأساسية في الماوس القصبة الهوائية تشريح الأنسجة والتصوير فيفو السابقين من الشعب الهوائية أهداب حركية مع ارتفاع videomicroscopy القرار. أنشئ هذا البروتوكول وصقلها على نطاق واسع خلال شاشة الطفرات الماوس للسماح للتقييم السريع للوظيفة أهداب متحركة (تردد فاز أهداب، شكل فوز أهداب، الأهداب تدفق ولدت) في المسوخ مع أمراض القلب الخلقية المرتبطة توضع مغاير 2-5.
ويمكن تصنيف التقنيات الحالية المستخدمة لدراسة مجرى الهواء حركية الأهداب إلى إما حادة السابقين نوع الجسم الحي أو LONGER المصطلح في مناهج تجريبية في المختبر. وتشمل التجارب الحادة التصور فيفو السابقين من الأنف / الهوائية الخزعات فرشاة الإنسان 6،7 وتحليل بسيط المقاطع الهوائية عرضية 8. النهج في المختبر استخدام مختلف تقنيات زراعة الخلايا لتوليد ورقة من ظهائر مهدبة متباينة مثل في الهواء واجهة الثقافات السائل أو مجرى الهواء الثقافات التعليق 9-11. ومع ذلك، هذه الهوائية ظهائر تقنيات reciliation تتطلب استثمارات كبيرة جدا في الوقت والتدريب قبل أن يتم إنتاج أي الخلايا الظهارية مهدبة صالحة للاستخدام لإجراء التجارب (4-6 أسابيع 9،10). في حين تحليل فيفو السابقين الحاد في مجرى الهواء الخزعات فرشاة الظهارية تستخدم عادة للدراسات اكلينيكية على البشر، وهذه الطريقة غير قابلة للاستخدام في دراسات الماوس بسبب تفاقم إصابة الأنسجة الميكانيكية 12.
هذه التقنية المبينة في هذا البروتوكول لتحليل مذكرات التفاهمه القصبة الهوائية مجرى الهواء ظهائر ليست بسيطة فقط لتنفيذ، لكنه لا يتطلب مهارات خاصة ولا تشريح أي معدات متخصصة إلى جانب تلك القياسية للتصوير بواسطة videomicroscopy. هناك العديد من المزايا في هذا البروتوكول بسيطة. أولا، لأن الحصاد الأنسجة القصبة الهوائية الفأر هو سريعة وسهلة لتنفيذ، لأنها تتيح للتقييم السريع للمجرى الهواء وظيفة الأهداب في عدد كبير من الفئران. هذا ويمكن أن تشمل تحليل حاد من الآثار على المدى القصير من مختلف العلاجات في المختبر. ثانيا، كونه تقنية فيفو السابقين، يبقى ظهارة مهدبة مجرى الهواء مرفقة به الكامنة وراء الأنسجة الداعمة وبالتالي الاحتفاظ المرتبطة الخلية مسارات الإشارات. ولذلك بالمقارنة مع مجرى الهواء في المختبر reciliated ظهائر، هذا الإعداد هو تمثيل أفضل للبيئة الطبيعية في أنسجة الجسم الحي. ثالثا، يسمح هذا البروتوكول الاستحواذ على عدد من العوامل الكمية المختلفة التي يمكن أن توفر تقييما موضوعيا لمتحركة و أهدابمرهم. أخيرا، وعلى النقيض من الأساليب الحالية أخرى لمجرى الهواء التصور أهداب، وهذا البروتوكول يسمح لتصور من أهداب في زوايا الحق في اتجاه فوز أهداب، والسماح مشاهدة الملف الشخصي للأهداب التي هي الأمثل لتصوير عالية الدقة من فوز أهداب وتوليد موجة metachronal .
هذا البروتوكول يمكن تعديلها في عدد من الطرق لمعالجة مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية مثل دور وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط على مجرى الهواء وظيفة الأهداب وتوليد / صيانة الهوائية أهداب فوز وmetachronal انتشار الموجات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
1.1 تشريح والتصوير متوسطة
وتستكمل L-15 متوسطة ليبوفيتش (L15) مع FBS (10٪)، والبنسلين، الستربتوميسين (100 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم و 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتوميسين) يستخدم على حد سواء أثناء الحصاد والتصوير من عينات القصبة الهوائية.
2. الضحلة المسورة الجمعية غرفة الثقافة
يظهر غرفة تستخدم لعقد أنسجة القصبة الهوائية في الشكل 1. أرضية الغرفة هو الزجاج القاع 35 مم طبق الثقافة. يتم إنشاء ورأس الجانب من الغرفة عن طريق وضع قطعة صغيرة من 0.3 ملم الأغطية سيليكون سميكة على طبق زجاج. يتم قطع حافة الورقة لتناسب الطبق السفلي جولة وقلص المركز كذلك على تشكيل الغرفة المركزية الضحلة (انظر الخطوات 2،1-2،3). على رأس هذا التجمع، ويتم وضع 18 ملم جولة غطاء زجاجي زلة لإنشاء غرفة مغلقة مناسبة للتصوير.
- تغطي كامل 18 ملم جولة زجاج الغطاء زلة مع مربع من 0.3 ملم الأغطية سيليكون سميكة.
- مع معيار مقص تشريح حاد تقليم قبالة الأغطية سيليكون الزائدة من حول حافة الغطاء زلة (مما أدى إلى طبقة دائرية من ألواح السيليكون).
- مع مشرط حاد قطع وإزالة الساحة المركزية من ألواح السيليكون (حوالي 10 مم مربع) من الوسط من انزلاق الغطاء مغطاة (وبالتالي تشكيل الجزء العلوي والجانبين من غرفة التصوير).
3. القصبة الهوائية الحصاد وإعداد
- الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية المحلية واستخدام اللجنة و / أو المبادئ التوجيهية الحكومية وإزالة القصبة الهوائية إلى البلاستيك 35 مم طبق ثقافة معيار مع ما يكفي من L15 وسائل الإعلام إلى الأنسجة يغرق (قد استخدمت من الكتاب الفئران قبل الولادة في يوم من الحمل 16.5، وصولا إلى حديثي الولادة، الأطفال حديثي الولادة، والكبار الحيوانات 2).
- إزالة غير القصبة الهوائية الأنسجة المرتبطة بها ثبتت على الجزء الخارجي منالقصبة الهوائية باستخدام تشريح حادة.
- إزالة الحنجرة مع قطع عرضية أسفل الغضروف الحلقي باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2A، خط 1).
- إزالة الفروع القصبية الأساسي الأيمن والأيسر مع قطع عرضية فقط فوق كارينا باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2A، سطر 2).
- عقد بلطف القصبة الهوائية مع ملقط غرامة وتدفق التجويف 2-3 مرات مع ~ 1 مل من الاستحمام L15 المتوسطة مع Pipetman P1000 P1000 وتلميح لإلغاء تحديد أي المخاط والدم.
- قطع جزء من حلقة 3-4 القصبة الهوائية باستخدام قطع عرضية مع مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2B، خط 1).
- قطع طولي خلال منتصف العضلات رغامية من هذا الجزء القصبة الهوائية قصيرة باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2B، سطر 2).
- قطع طولي خلال منتصف الحلقات غضروف القصبة الهوائية باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2C ، خط)، وترك قسمين من القصبة الهوائية الأنسجة مناسبة للتصوير (مقطع واحد هو مبين في الشكل 2D).
4. التصوير أهداب
- نقل شرائح الأنسجة القصبة الهوائية، والجانب التجويف أسفل، على منتصف 35 مم أسفل الزجاج طبق الثقافة مع 100-200 ميكرولتر من L-15 متوسطة.
- لقياس التدفق ولدت أهداب إضافة كمية صغيرة من الفلورسنت 0.20 ميكرون المجهرية إلى المتوسطة L-15 الاستحمام عينة أنسجة القصبة الهوائية (~ 1 × 10 11 الجسيمات / مل أو 20 ميكرولتر / مل من Fluoresbrite 2.5٪ مائي التعليق المكروية).
- وضع غرفة التصوير أعدت من قبل (انظر الإجراءات 1-3 أعلاه) على أعلى من السيليكون عينة القصبة الهوائية الجانبية ورقة أسفل، مع عينة القصبة الهوائية تقع في منتصف الدائرة الجدران الضحلة التي شكلتها نافذة يقتطع من الأغطية سيليكون (الشكل 1 ).
- دفع بلطف إلى أسفل على ساترة لتأمين في مكان وإزالة أي فائض L-15 وسائل الاعلام من النقيب حوافGA P1000 P1000 طرف وPipetman.
- تحميل أسفل الزجاج 35 مم طبق الثقافة وعينة القصبة الهوائية على مجهر مقلوب مع البصريات الهدف 100X ومدينة دبي للإنترنت.
- باستخدام كاميرا عالية السرعة وفيلم برنامج الحصول على جمع الأفلام من حركية الأهداب في 200 + لقطة في الثانية على طول القصبة الهوائية ظهائر مهدبة من كرة لولبية من فوق حافة العضلات رغامية (الشكل 2D الوارد في الإطار، E: المثال لا تزال صورة من فيلم مسجل) (الفيلم تكميلية 1).
- باستخدام التصوير epifluorescent FITC والإضاءة الخافتة CCD الكاميرا (انظر قائمة المعدات المذكورة أعلاه)، جمع أفلام الحركة المكروية الفلورسنت عبر السطح من ظهائر القصبة الهوائية مهدبة للسماح الكمي في وقت لاحق من أهداب تدفق ولدت (السينما التكميلية 2).
5. الكميات في القدرة على الحركة الأهداب
- تحميل الأفلام المصورة في مدينة دبي للإنترنت حزمة البرامج يماغيج وبعد هذه التقنية التي وصفها أناعين دروموند 13 استخدام أداة خط لرسم خط النقطية عبور أهداب الضرب. A "reslice" من هذا الخط يولد نوع مخطاط التموج الصورة حيث حركة أهداب عبر خط يولد نمط الموجة. عدد وحدات البكسل بين كل ذروة الموجة لهم قياس (واحد بكسل = واحد إطار الفيلم) التي من خلالها عدد من نبضة في الدقيقة (أي هرتز) ويمكن بعد ذلك أن تحسب.
- لقياس تدفق أهداب ولدت تحميل الأفلام الفلورسنت حبة في حزمة البرمجيات يماغيج، واستخدام البرنامج المساعد MTrackJ 14 لتعقب يدويا الخرز الفلورسنت عبر السطح من القصبة الهوائية ظهائر والسماح للبرمجيات توليد سرعة حبة وتوجه لتعقب كل حبة.
ينبغي توخي الحذر عند استخدام الخرز الفلورسنت لقياس التدفق والمسافة من أهداب الضرب يمكن أن تؤثر بقوة حجم التدفق المقاسة. حركة حبة في الفيلم التكميلي 2 هو خير مثال على ذلك. في هذا المثال حبةحركة سريعة على سطح أهداب الضرب ويسقط بشكل ملحوظ قبالة لحبات بعيدا في وسائل الإعلام الاستحمام. للسيطرة على هذا، يجب فقط أن تجمع اقتفاء أثر حبة على مسافة ثابتة فوق ظهائر مهدبة في جميع العينات للسماح المقارنات الصحيحة في هذا الشأن. وأخيرا، للحصول على بيانات ممثل على تدفق السوائل، ينبغي تتبع حبات لأطول فترة ممكنة، ونحن نفضل استخدام المسارات الخرزة التي تغطي الخلايا المهدبة 10 + لحساب تدفق السوائل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يجب أن يكون التحكم الهوائية أهداب مرئية وينظر للفوز بطريقة منسقة (الفيلم التكميلي 1؛ وتباطأ تشغيل الفيلم إلى الوقت الحقيقي 15٪) بشكل واضح، مع تدفق ملحوظ في اتجاه فوز أهداب (الفيلم التكميلي 2؛ تشغيل الفيلم هو 100٪ الوقت الحقيقي). تحديد الكميات من الأفلام أهداب ينبغي أن تسفر نتائج مماثلة لتلك التي شوهدت في الشكل 3. مجموعة من الأفلام DIC عالية السرعة يجعل من الممكن تحديد مقدار تردد فاز أهداب (الشكل 3C) ويعطي صورا جيد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قياس تردد فاز أهداب (البرازيلي) من السهل نسبيا باستخدام المجهر أهداف السلطة العليا وصورة سريعة الأجهزة اكتساب 13،15، ويفسر لماذا تشكل قياسات الاتحاد البرازيلي أساس معظم الدراسات التحقيق التخليص مخاطي هدبي أثناء الصحة والمرض. ومع ذلك، في حين أن قياس البرازيلي ضروري لفهم التخليص مخاطي هدبي، وقياس البرازيلي وحده يتجاهل أهمية الكامنة وراء كل الهدبية تدفق لدت وأهداب الموجي فوز، وكلاهما من الصعب قياس، غالبا ما يتم تجاهلها، وربما لم تكن متطابقة مع الاتحاد البرازيلي. وينظر مثال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح U01HL098180 من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد أو المعاهد الوطنية للصحة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لايبوفيتز s L-15 متوسط | Invitrogen | 21083-027 | لا يوجد فينول |
| أحمر مصل بقري للجنين | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x ملقط ناعم | Roboz | RS-4976 | |
| مقص | تشريح Roboz | RS-5676 | |
| مقص تشريح دقيق | Roboz | RS-5620 | |
| مشرط | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson، Inc | F123602 | |
| P1000 نصائح | المنتجات الحيوية الجزيئية | 2079E | |
| 18 مم غطاء زجاجي دائري زلات | فيشر Scientific | 430588 | |
| البلاستيك 35 مم أطباق ثقافة | Corning | 430588 | |
| قاع زجاجي 35 مم أطباق ثقافة | وارنر إنسترومنتس | W3 64-0758 | |
| لوح سيليكون بسمك 0.012 بوصة (0.3 مم) | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 & mu ؛ قطر m Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| مجهر مقلوب ، مع هدف زيت 100x ومرشحات DIC | Lecia | DMIRE2 | ليست حرجة. |
| مصباح زئبق 100 واط ، مرشحات الإثارة / الانبعاث FITC فائقة الفلور | ليست حرجة. | ||
| حاضنة مرحلة المجهر | Lecia | 11521749 | غير مطلوب إذا كان تصوير الأهداب في درجة حرارة الغرفة |
| كاميرا عالية السرعة ساحلا ساطعا | Vision Research | Phantom v4.2 | العلامة التجارية ليست حرجة. يجب أن تكون أسرع من 125 إطارا في الثانية |
| كاميرا الفلورسنت عالية السرعة | العلامة التجارية Hamamatsu | C9100-12 | ليست حرجة. يجب أن يكون أسرع من 10 إطارات في الثانية |
| برنامج تحليل الأفلام | المعاهد الوطنية للصحة | ImageJ مع البرنامج المساعد |
المراجع
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
