مقالة منهجية

عالية الإنتاجية، استخراج الآلي من DNA و RNA من العينات السريرية باستخدام تكنولوجيا TruTip على الروبوتات مناولة السائل المشترك

35.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50356

⸱

يونيو 11, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Application Development, Akonni Biosystems, Inc., 2Manufacturing, Akonni Biosystems, Inc., 3Engineering, Akonni Biosystems, Inc., 4Research & Development, Akonni Biosystems, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

TruTip هو بسيط الحمض النووي تكنولوجيا استخراج بموجبها يتم إدراج مسامية، مصفوفة ملزمة متجانسة في تلميح ماصة. وبالتالي، فإن تنسيق إعداد عينة متوافقا مع الصكوك التعامل مع معظم السائل، ويمكن استخدامها لكثير من متوسطة إلى التطبيقات السريرية عالية الإنتاجية وأنواع العينة.

الملخص

TruTip هو بسيط الحمض النووي تكنولوجيا استخراج بموجبها يتم إدراج مسامية، مصفوفة ملزمة متجانسة في تلميح ماصة. الشكل الهندسي للمتراصة يمكن تكييفها للحصول على نصائح ماصة محددة تتراوح في الحجم 1،0-5،0 مل. المسامية كبيرة من متراصة تمكن العينات لزج أو معقدة لتمرير بسهولة من خلال ذلك مع الحد الأدنى من احداهما فلويديك. تدفق ثنائي الاتجاه يزيد من وقت الإقامة بين متراصة والعينة، وتمكن أحجام عينة كبيرة لتتم معالجتها ضمن TruTip واحد. الخطوات الأساسية، بغض النظر عن حجم العينة أو الهندسة TruTip، وتشمل تحلل الخلية، الحمض النووي ملزمة لالمسام الداخلية للTruTip متراصة، تجرف عينة مكونات غير منضم ومخازن تحلل، ويبلغ حجمه تنقية الأحماض النووية وتتركز في وجود مخزن مؤقت المناسبة. وأظهرت سمات والقدرة على التكيف من TruTip في ثلاثة بروتوكولات تجهيز العينات السريرية الآلي باستخدام epMotion إيبندورف 5070، هاميلتون نجم وSTARplus الروبوتات مناولة السائل، بما في ذلك عزل الحمض النووي الريبي من نضح البلعوم، والعزلة الحمض النووي الجيني من الدم الكامل، واستخراج الحمض النووي الجنيني والإثراء من كميات كبيرة من البلازما الأمهات (على التوالي).

المقدمة

تنقية الحمض النووي أمر ضروري لتشخيص معظم الجزيئية، واستخدام البحوث فقط، وتطبيقات علوم الحياة. ظهرت مناهج مختلفة منذ وقت الفينول / كلوروفورم الاستخراج، وتستند كثير منها على مبدأ أساسي من الحمض النووي ملزمة لالسيليكا في وجود الأملاح chaotropic 1. وقد كانت عملية استخراج المبسطة والآلية من خلال استخدام مختلف الأشكال وحبة التي تعتمد على الأغشية، مع مرشحات تدور، حبات مغناطيسية والمناهج ذات الصلة تهيمن على صناعة علوم الحياة (انظر الأمثلة في 2-13). في حين فعالة، والجسيمات والأغشية ويعرف القيود عندما واجه مع المصفوفات السريرية الصعبة. على سبيل المثال، الأغشية والأعمدة المستندة إلى حبة متوافقة، ذات أحجام مسام صغيرة (وبالتالي، والضغوط مرة أخرى عالية)، وتتطلب بعض نوع من الدعم من أجل أن تكون معالجتها بواسطة نظام الطرد المركزي أو فراغ. الخصائص الفيزيائية للأغشية والأعمدة حبة نتيجة فيالمقاومة فلويديك كبيرة، الأمر الذي يحد من نوع من العينات التي يمكن معالجتها بكفاءة دون انسداد الاستهلاكية، و / أو مجموع (المدخلات) حجم العينة التي يمكن معالجتها من خلال مسار تدفق أحادي إتجاهي. على العكس، يجب أن توزع جزيئات مغناطيسية في جميع أنحاء عينة من الانفعالات. الحاجة إلى توزيع متجانس الجزيئات المغناطيسية ضمن حل يحد من إجمالي حجم العينة المدخلات التي يمكن معالجتها مع معظم المواد الاستهلاكية حبة المغناطيسي. سمات عينة سريرية (مثل اللزوجة أو تعقيد) يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاءة تركيز الجسيمات المغناطيسية على جانب أنبوب أو قضيب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الجسيمات الدقيقة السيليكا بقطع من الخرز أثناء عملية الاستخراج، وفقدان مغنطة وتلويث العينة النهائية.

وقد تم تطوير هذه التكنولوجيا TruTip للتغلب على بعض هذه عينة الحمض النووي المعوقات والقيود تجهيز 14. عن طريق دمج متراصة مسامية داخلماصة، وخفضت فلويديك احداهما، والتي تمكن التحكم في التدفق من فراغ (أي ماصة الطموح). تمكن هذه الميزة عملية الاستخراج والأجهزة اللازمة لتنقية الأحماض النووية من أنواع عينة يصعب تبسيطها إلى حد كبير (الشكل 1). تم تصميم وهندسة والمسامية للمتراصة للحد من انسداد، في حين أن سمك متراصة توفر القدرة الكافية الحمض النووي ملزمة لحجم العينة تتراوح 1،0-5،0 مل. تدفق ثنائي الاتجاه خلال عينة الطموح والاستغناء يسمح لمرات الإقامة لفترات طويلة بين عينة استخراج ومتراصة ملزمة لكفاءة الانتعاش الحمض النووي وشطف، وتمكن أحجام عينة كبيرة نسبيا بحيث تتم معالجتها التي تتجاوز سعة وحدة التخزين من طرف ماصة نفسها. نحن ذكرت سابقا وضع وتطبيق إجراء TruTip دليل لتنقية الحمض النووي الريبي من عينات إنفلونزا البلعوم باستخدام راي واحد أو متعدد القنواتنين pipettor 15. تم الحصول على الكفاءات استخراج ما يعادل بين QIAcube الآلي وطرق TruTip دليل في 10 6 نسخ الجين إنفلونزا A لكل مل نضح البلعوم. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى إثبات، الآلي النووي إجراءات متوسطة وعالية الإنتاجية TruTip حمض تنقية لنضح البلعوم (NPA) وغيرها من أنواع عينة ذات الصلة سريريا، وذلك باستخدام الروبوتات التعامل مع السائل التي توجد عادة في المختبرات السريرية المرجعية.

البروتوكول

موصوفة ثلاثة بروتوكولات استخراج TruTip الآلي وأثبت هنا: 1) متوسط ​​الإنتاجية في استخراج الحمض النووي الريبي من NPA على إيبندورف epMotion 5070؛ 2) عالية الإنتاجية الجينوم استخراج الحمض النووي من انخفاض أحجام من الدم الكامل على هاميلتون نجم، و 3) العزلة انتقائية وإثراء مجزأة DNA الجنين من كميات كبيرة من البلازما الأمهات على هاميلتون STARplus. هي النصوص التلقائية المتاحة من Akonni ويتم توفيرها اصف برنامج رفيع المستوى هنا فقط. يتم الاستغناء عن الكواشف استخراج وشطف تلقائيا من أحواض كاشف السائبة لوحات 96 جيدا من قبل البرنامج النصي الآلي (ق) قبل تتم معالجة العينات السريرية.

1. استخراج الحمض النووي الريبي الآلي من نضح البلعوم

ويتم تكييف الدليل هو موضح سابقا طريقة TruTip 15 الآن لتشغيل على إيبندورف epMotion 5070 الروبوت مناولة السائل، وذلك باستخدام مصفوفة TruTip المسام الكبيرة جزءا لا يتجزأ من 1.0 مل إيبندورف الأنابيبتتي نصائح، A 2 مل لوحة في آبار عميقة (الولايات المتحدة الأمريكية العلمية)، Akonni TruTip الكواشف الاستخراج، وNPA كنوع العينة. وepMotion 5070 الروبوت مناولة السائل يحمل ما يصل إلى 8 نصائح في وقت واحد، لذلك يوصف بروتوكول الآلي خط الأساس لمدة 8 الاستخراج موازية. ومع ذلك، يمكن معالجة ما يصل الى 24 عينة خلال برنامج واحد في واحدة من الآبار العميقة لوحة عينة 96-جيدا. برنامج epMotion منفصلة يتوفر (والمطلوب) من أجل معالجة 16 أو 24 عينة. بروتوكول المبينة أدناه هي للبرنامج نصي الآلي 8 عينة.

الإعداد

  1. جلب عينات البلعوم إلى RT قبل بدء الاستخراج.
  2. الاستغناء عن 100 ميكرولتر نضح البلعوم بالإضافة إلى 150 ميكرولتر nuclease خالية من المياه في العمود 1 من لوحة عينة (الشكل 2A).
  3. وضع لوحة العينة إلى B1 موقف على المنضدة epMotion (الشكل 2B).
  4. مكان نصائح ماصة، TruTips و 30 أحواض كاشف مل على Worktab epMotion كل منهامواقف جنيه (الشكل 2B).
  5. فتح البرنامج epBlue إيبندورف، حدد ملف تشغيل التي تقدمها Akonni لمدة 8 عينات، وتحميل طريقة بالنقر على زر RUN على علامة التبويب RUN.
  6. ضمن إعدادات الاستشعار المستوى، حدد مستويات ونصائح، وانقر على زر RUN.
  7. إدخال حجم العينة في البرنامج وانقر فوق تشغيل.
  8. سيقوم البرنامج النصي epMotion مطالبة المستخدم لإضافة استخراج وشطف الكواشف إلى الخزانات كاشف تقع في B2 موقف على المنضدة. إضافة وحدات التخزين الموصى بها من كل كاشف على الحوض الصغير منها. لمدة 8 عينات، والحد الأدنى وحدات التخزين كاشف هي:
الكاشف حجم (مل) الحوض الصغير الموقع
95٪ من الإيثانول 3.5 2
غسل العازلة D تسعة 3
غسل العازلة E تسعة 4
شطف العازلة A2 1.3 5
تحلل وملزمة العازلة D 11.0 6
  1. إدخال كميات كاشف في الجدول التي قدمها البرنامج خلال epMotion موجه من الخطوة 8 أعلاه. يجب أن تعكس قيمة المدخلات الحجم الفعلي من العازلة الاستغناء من قبل المستخدم في كل خزان كاشف منها، ويجب أن تكون أكبر من أو يساوي الحد الأدنى للكميات المشار إليها أعلاه. مقالات حجم غير صحيحة يمكن أن تؤدي إلى كميات غير صحيحة تسليمها من قبل الأجهزة epMotion إلى كل أنبوب أو جيدا في لوحة 96 كذلك (ق).

البرنامج الآلي

  1. اختر تشغيل لبدء الأسلوب الآلي. سيقوم البرنامج النصي الآلي التحرك من خلال الخطوات التالية بدون تدخل من المستخدم:
    تحلل العينة وتوزيع الكاشف:
    1. الاستغناء عن 375 ميكرولتر العازلة تحلل D إلى العمود 1 وتخلط لمدة 10دورات (apirate + الاستغناء = 1 دورة). هذه الخطوة تبدأ عملية تحلل الحضانة بينما aliquotted الكواشف المتبقية.
    2. الاستغناء 1.6 مل الاحتياطي اغسل D في العمود 2.
    3. الاستغناء 1.6 مل الاحتياطي اغسل E في العمود 3.
    4. الاستغناء عن 50 ميكرولتر العازلة شطف A في العمود 4.
    5. وقفة لمدة 6 دقائق لاستكمال عينة دقيقة 10 حضانة في الاحتياطي تحلل D.
    6. إضافة 375 ميكرولتر الإيثانول إلى كل بئر في العمود 1، خلط كل عينة مع الايثانول من خلال 10 دورات pipetting ل.
    استخراج:
    1. تحميل 8 TruTips من A2 موقف على المنضدة، وتبدأ عملية الاستخراج المبين في الشكل 1.
    2. نضح والاستغناء عينة / تحلل العازلة / الإيثانول المخلوط من العمود 1 من لوحة عينة لمدة سبع دورات لربط الحمض النووي لTruTip متراصة. على الرغم من أن تدفق عينة من خلال TruTip قد تختلف (بسبب وجود خلافات في عينة اللزوجة السريرية)، وكان العائد الحمض النووي لهذه العينة لار المتضررين من تباين التدفق. يتم وصف الخيارات لتحسين تدفق عينة في المناقشة.
    3. تحرك TruTips إلى عينة لوحة العمود 2، ودورة الغسيل العازلة D 5X خلال متراصة لإزالة العازلة تحلل المتبقية ومصفوفة عينة.
    4. تحرك TruTips إلى لوحة عينة العمود 3، ودورة الغسيل العازلة E 5X خلال متراصة لإزالة البروتينات وغيرها من الملوثات من الحمض النووي ملزمة.
    5. تحرك TruTips إلى فارغ كاشف موقف الخزان 1 (في الموقع المنضدة B2) ودورة 80X (بمعدل تدفق سريع) لتجفيف متراصة. من المهم أن يجف تماما وTruTip، كما المذيبات المتبقية في مزال الاستعدادات الحمض النووي سوف يؤثر سلبا الإنزيمات مثل إنزيم النسخ العكسي وطق البلمرة DNA.
    6. تحرك TruTips إلى عينة لوحة العمود 4 ودورة 5X في شطف ألف الاحتياطي الحامض النووي المستخرج وتنقيته هو الآن في شطف العازلة في عينة لوحة العمود 4 آبار.
    7. إخراج TruTips في سلة النفايات epMotion.
    8. عند الانتهاء من البرنامج، يدويا إزالة لوحة عينة من الصك ونقل الحمض النووي المنقى إلى أنابيب جديدة للتخزين طويل الأجل أو استخدامها مرة أخرى. يمكن للمستخدمين المتقدمين إضافة epMotion تعليمات إلى ملف تشغيل لنقل عينات مزال في أنابيب تخزين منفصلة أو لوحات PCR، إذا رغبت في ذلك.

سيقوم البرنامج لمدة 16 مجموع العينات كرر الخطوات من خلال 10.1 10.13 باستخدام أعمدة لوحة عينة 5-8. وبالنسبة لبرنامج 24 عينة، من خلال الخطوات 10.1 10.13 تتكرر 2X باستخدام أعمدة لوحة عينة 5-8 و 9-12، على التوالي.

2. 96-جيدا استخراج الحمض النووي الجينوم من الدم الكامل

ويستخدم هاميلتون نجم الروبوت التعامل مع السائل لإثبات استخراج الآلي من 96 عينات في وقت واحد من الدم الكامل. هاميلتون نجم يختلف عن نظام epMotion في أن سخان اختياري / وحدة شاكر يتوفر على سطح السفينة، وهو أمر مهم لعملية الهضم الأنزيمي من بعض كلينيالمصفوفات كال، مثل الدم الكامل. لأن النظام يمكن تركيبها مع رئيس ماصة 96 قناة، وهناك لوحة 96 جيدا مخصصة لكل من الخطوات TruTip والكواشف.

الإعداد

  1. بدوره على صك النجوم والكمبيوتر.
  2. فتح هاميلتون برنامج التحكم تشغيل.
  3. فتح ملف تشغيل التي تقدمها Akonni لمدة 96 عينات.
  4. مكان معدات المختبرات على سطح السفينة نجوم كما هو مبين في الشكل (3).
  5. الاستغناء الكواشف إلى أحواض يناظرها (وحدات التخزين دلالة على الحد الأدنى اللازم لتجهيز 96 عينات):
الكاشف حجم (مل) الحوض الصغير الموقع
تحلل وملزمة العازلة F 75 5
95٪ من الإيثانول 100 6
غسل العازلة J 175 7
غسلالعازلة K 175 8
شطف العازلة A2 12 9
بروتين K (20 ملغ مل -1) 8 15

6. تسمح عينات لتتوازن لRT.

7. وضع أنابيب العينات في رفوف الناقل عينة (المركز سطح 4 في الشكل 3). مكان نموذج 1 في الجزء الخلفي من الناقل اليسار المتطرف والتحرك بالتتابع أسفل كل الناقل مع عينة 96 وتنتهي في موقف الجبهة اليمنى.

البرنامج الآلي

  1. حدد زر PLAY في الجزء الأيمن العلوي من نافذة ملف تشغيل وإدخال عدد من العينات التي يتم معالجتها. سيقوم البرنامج النصي الآلي ثم التحرك من خلال الخطوات التالية بدون تدخل من المستخدم:
    تحلل العينة وتوزيع الكاشف
    1. نقل 200 ميكرولتر من كل أنبوب العينة إلى لوحة الحضانة عند موقف 14 على أنهالعاطر / شاكر وحدة (الشكل 3).
    2. الاستغناء عن 80 ميكرولتر K بروتين في كل عينة بئر من لوحة الحضانة.
    3. الاستغناء عن 600 ميكرولتر العازلة تحلل F في كل بئر من لوحة الحضانة.
    4. مزيج الحل لمدة 10 دورات، ثم احتضان لمدة 20 دقيقة عند 70 درجة مئوية و 500 دورة في الدقيقة. 70 ° C درجة الحرارة مجموعة النتائج في ~ 60 درجة مئوية درجة حرارة عينة داخل لوحة الآبار العميقة، والذي هو ضمن مجموعة من بروتين K النشاط. بينما تحتضن العينات، ونظام مناولة السائل يستمر التشغيل عن طريق الاستغناء الكواشف في لوحات يناظرها والآبار:
      • 100 ميكرولتر العازلة شطف A في كل بئر من لوحة بئر عميقة في موقف 13.
      • 800 ميكرولتر الإيثانول في كل بئر من لوحة بئر عميقة في موقف 10.
      • 1.6 مل K غسل العازلة في كل بئر من لوحة بئر عميقة في موقف 12.
      • 1.6 مل غسل J العازلة في كل بئر من لوحة بئر عميقة في موقف 11.
    5. وبعد دقيقة الحضانة 20، يتم نقل الخليط عينة من لوحة إلى لوحة الحضانة بئر عميقة في موقف 10، ويخلط من خلال 12 دورات pipetting ل.
    6. نصائح إخراج كاشف في سلة النفايات.
      استخلاص
      هذا الجزء من الإجراء الدم gDNA هي مشابهة جدا لبروتوكول إنفلونزا epMotion، باستثناء تكوين الكواشف غسل وأرقام دورة. هاميلتون نصائح TruTips هم من السود، وبالتالي فإن تدفق السوائل من خلال TruTip غير مرئية.
    1. تحميل 96 TruTips من موقف سطح السفينة 3.
    2. نضح والاستغناء العينة / تحلل العازلة / الإيثانول المخلوط في موقف 10 لمدة 10 دورات لربط الأحماض النووية إلى TruTip متراصة.
    3. تحرك TruTips لوضع 11 ودورة الغسيل العازلة J 5X خلال متراصة لإزالة العازلة تحلل المتبقية ومصفوفة عينة.
    4. تحرك TruTips لوضع 12 ودورة الغسيل العازلة K 5X لإزالة البروتينات وغيرها من الملوثات من الحمض النووي ملزمة.
    5. دورة TruTip 40X بسرعة عالية للهواء الجاف.
    6. تحرك TruTips إلى موقف 13 ودورة 5X في شطف العازلة A2. على الحمض النووي المستخرج وتنقيته هو الآن في شطف العازلة في لوحة البئر عميقة.
    7. إخراج TruTips في سلة النفايات.

عند الانتهاء من البرنامج، إزالة لوحة شطف من الصك ونقل العينات المستخرجة للأنابيب المناسبة للتخزين أو تطبيقات المصب.

3. استخراج الحمض النووي من عينات كبيرة حجم البلازما

يتم استخدام أداة STARplus هاميلتون لإثبات وجود بروتوكول الآلي لاستخراج بحرية تعميم DNA الجنين من 5 مل من البلازما الأمهات. يمكن للنظام STARplus دعم اثنين من الأسلحة الآلية قناة ماصة، واحدة مع 8 × 5 قنوات مل واحد مع 8 × 1 قنوات مل. ويمكن لهذه الأسلحة تعمل بشكل متواز لمعالجة متداخلة في دفعات من 8 عينات لكل منهما. ويستخدم 5 مل TruTip للتر الأولييتم استخدام استخراج الدو الحجم، و1 مل TruTip لحجم الفصل وزيادة تركيز الحمض النووي المستخرج.

انشاء

  1. بدوره على صك STARplus والكمبيوتر.
  2. فتح هاميلتون برنامج التحكم تشغيل.
  3. فتح ملف تشغيل التي تقدمها Akonni لمدة 8 عينات كبيرة حجم البلازما.
  4. مكان معدات المختبرات على سطح السفينة STARplus كما هو مبين في الشكل (4).
  5. الاستغناء الكواشف في الخزانات يناظرها:
الكاشف حجم (مل) الحوض الصغير الموقع
CN-W1 17 5A
CN-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
بروتين K (20 ملغ مل -1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 6C
CN-W3 5 6D
CN-B2 5 6E
CN-B3 5 6F
CN-L1 52 7
CN-B1 175 8
  1. تسمح عينة لكي تتوازن لRT.
  2. وضع أنابيب العينات في رفوف الناقل عينة (المركز سطح السفينة 3 في الشكل 4). مكان نموذج 1 في الخلفية والتحرك بشكل تسلسلي نحو الجزء الأمامي من سطح السفينة.

البرنامج الآلي

نظرا لحجم عينة مساهمة كبيرة، يجب إجراء تحلل والتجانس خطوات الخروج من صك STARplus هاميلتون في حمام مائي. يشار إلى الخطوات التي تتطلب تدخل المستخدم في إطار بروتوكول الآلي بعلامة النجمة (*) في بدأت لز من الجملة، وبخط عريض.

تحلل العينة وتوزيع الكاشف: يتم تحضين العينة مع K بروتين وتحلل العازلة إلى التجانس العينة والإفراج عن الحمض النووي.

  1. حدد زر PLAY في الجزء الأيمن العلوي من نافذة ملف تشغيل. إدخال عدد من العينات التي يتم معالجتها، وموقع نصائح ماصة على سطح السفينة، وموقع TruTips على سطح السفينة.
  2. يضيف النصي الآلي 615 ميكرولتر K بروتين، 5 مل بلازما، و 6.2 مل العازلة تحلل CN-L1 إلى كل أنبوب مخروطي 50 مل، وبعد ذلك سوف PAUSE.
  3. * إزالة أنابيب مخروطية 50 مل من سطح العينة، ودوامة لمدة 30 ثانية على سرعة عالية، واحتضان خارج الخط لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة الحرارة. بعد إزالة أنابيب مخروطية من على سطح السفينة هاميلتون، استئناف النصي الآلي لمواصلة الاستغناء الكواشف في لوحات كل منها والآبار (الشكل 4B و 4C):
    • 2 مل CN-W1 إلى كل بئر أخرى في موقف 9 العمود 1.
    • 2 مل CN-W2 إلى كل بئر أخرى في موقف 9 العمود 2.
    • 2 مل CN-W4 إلى كل بئر أخرى في موقف 9 العمود 3.
    • 250 EBA2 ميكرولتر إلى كل بئر أخرى في موقف 9 الأعمدة 4 و 5.
    • 495 ميكرولتر CN-B2 إلى كل بئر أخرى في موقف 10 عمود 1.
    • 1 مل EBB إلى كل بئر أخرى في موقف 10 عمود 2.
    • 500 ميكرولتر CN-W3 إلى كل بئر أخرى في موقف 10 العمود 3.
    • 500 ميكرولتر CN-W4 إلى كل بئر أخرى في موقف 10 العمود 4.
    • 50 EBA2 ميكرولتر إلى كل بئر أخرى في موقف 10 عمود 5.

لأن القنوات 5 مل واسعة جدا لاستخدام الآبار المجاورة لكل عينة، ويوزع البرنامج الآلي الكواشف في كل بئر أخرى من لوحة بئر عميقة في موقف سطح السفينة 9. الذراع الميكانيكية المستخدمة للقنوات مل 1 يتطلب أيضا استخدام كل بئر أخرى في لوحات كاشف لاستبعاد والحادي والعشرين تركيزربحية السهم من البروتوكول.

بعد الكواشف وصرفها، وسيقوم البرنامج PAUSE.

  1. * بعد 30 دقيقة، 60 ° C الحضانة، ووضع أنابيب مخروطية 50 مل على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. * العودة أنابيب مخروطية 50 مل إلى مواقعها الأصلية داخل العينة الناقل رف في موقف سطح 4، واستئناف النصي الآلي.
  3. إضافة 12 مل تجليد العازلة CN-B1 إلى كل أنبوب عينة ومزيج 10X.

استخراج كمية كبيرة: وتستخدم 5 مل TruTips لاستخراج الحمض النووي من مجموع عينة البلازما هي lysed.

  1. التقاط 5 TruTips مل من موقف (2) لكبيرة الحجم استخراج الحمض النووي.
  2. دورة العينة mixture15 مرات في مل أنبوب مخروطي 50، بدءا من الجزء السفلي من الأنبوب ونقل 3 مم أعلى بعد كل دورة pipetting ل. هذه الخطوة يربط مجموع الحمض النووي للTruTip متراصة.
  3. تحرك TruTips إلى لوحات بئر عميقة في موقف 6 العمود 1، وقبرصيCLE 1X في غسل العازلة CN-W1.
  4. تحرك TruTips لوضع 9 العمود 2 ودورة 1X في غسل CN-W2.
  5. تحرك TruTips لوضع 9 العمود 3 و 2x دورة في غسل CN-W4.
  6. تحرك TruTips لوضع 9 العمود 4 ودورة 40X بسرعة عالية لتجف مصفوفة ملزمة.
  7. تحرك TruTips لوضع 9 العمود 5 ودورة 10X لأزل الأحماض النووية متجهة من 5 مل TruTips. هذا هو شطف كبيرة الحجم # 1.
  8. تحرك TruTips إلى العمود 6 وكرر الخطوة مع قسامة الثاني من شطف العازلة. هذا هو شطف كبيرة الحجم رقم 2.
  9. نقل شطف # 2 في الموقف 9 العمود 5 إلى الجمع بين ذلك مع شطف # 1، وتجاهل TruTips.

تتم إزالة جزيئية عالية DNA الوزن من العينة المستخرجة، ويتم عزل الحمض النووي المتبقية وتتركز: الإقصاء والتركيز.

  1. إضافة eluant مجتمعة من الخطوة 22 لوضع 10 عمود 1 وتخلط جيدا 10X.
  2. التقط 1 مل TruTiPS من موقف 13 ودورة 20X لربط عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي للمتراصة.
  3. نقل TruTips لوضع 10 عمود 2 ودورة 5X لشطف غيض وإزالة عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي. يتم الاحتفاظ TruTips وضعها مرة أخرى في رف طرف في موقف 13.
  4. مع نصائح كاشف من موقف 12، إضافة 575 ميكرولتر من الاحتياطي ملزم CN-B3 إلى العينة في موقف 10 عمود 1 ومزيج 10X.
  5. التقاط TruTips من الخطوة 25، والعودة إلى وضع 10 عمود 1، ودورة 20X لربط الحمض النووي المتبقي من العينة إلى 1 مل TruTip.
  6. تحرك TruTips لوضع 10 عمود 4 ودورة 1X في غسل CN-W3 لإزالة أي مثبطات المتبقية.
  7. نقل TruTips لوضع 10 عمود 5 ودورة 1X في غسل CN-W4 لشطف الأملاح المتبقية من CN-W3.
  8. رفع TruTips أكثر من 10 موقف العمود 5 والهواء من خلال دورة نصائح 35X لتجفيف متراصة.
  9. تحرك TruTips لوضع 10 عمود 6 ودورة 10X في EBA2 إلى أزل تنقيته، الحجم سلكتيد والحمض النووي المركزة.
  10. تجاهل TruTips.
  11. نقل العينة مزال من العمود 6-1،5 مل أنابيب في موقف 11. العينات المستخرجة مستعدون للتخزين أو معالجة المصب.

النتائج

وتظهر البيانات PCR الوقت الحقيقي للأنفلونزا استخراج الحمض النووي الريبي من NPA في الشكل 5A. يقدر الحمض النووي كفاءة الاستخراج مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها مع إصدار دليل من البروتوكول 15. ويلاحظ وجود استجابة خطية في متوسط ​​قيم C ر بين 10 و 10 4 6 نسخ الجين مل -1 المعدلة الأنفلونزا (R 2 = 0.99 و 0.98 لA الأنفلونزا وباء، على التوالي)، مع الانحرافات المعيارية في متوسط ​​C ر قيم أقل من 1 دورة. ويتجلى غياب التلوث المتبادل مع نظام epMotion في الشكل 5B، حيث كان يتخلل 12 عينة إيجابية NPA تحتوي على 10 مل 6 نسخ الجين -1 NPA مع 12 الفراغات العازلة. متوسط ​​C T لعناصر إيجابية كان 30.16 ± 0.14، وكانت جميع الفراغات العازلة سلبية. مجموع عينة زمن هو 16 و 28 و 40 دقيقة لمدة 8 و 16 و 24 عينات، على التوالي.لأن نضح البلعوم السريرية النموذجية أو مسحة سوف تحتوي على 10 7 الجين نسخ مل -1 (على افتراض 1،000 virions في TCID 50 16 و> 10 4 TCID 50 مل -1 إنفلونزا 17)، ومن المتوقع أن تكون فعالة على أغلبية بروتوكول epMotion الآلي من العينات السريرية NPA.

وبالنظر إلى مجموعة من الاختبارات الجزيئية التي أجريت على الحمض النووي الجيني البشري، والهدف الأساسي من استخراج الحمض النووي من الدم الكامل هو إنتاج خالية من الملوثات، وارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني. اكتمال بروتوكول الآلي لمدة 96 العينات في غضون 1 ساعة، وهو ما يشكل تحسنا خلال النظم الآلية الأخرى يظهر (على سبيل المثال PROMEGA MagneSil = 90 دقيقة وQIAGEN QIAamp DNA الدم BioRobot MDX نظام = 2.5 ساعة). الشكل 6A الأشعة فوق البنفسجية / فيس محات الامتصاصية لل 45 عينات الدم إيجابية معالجتها في وقت واحد مع 45 الفراغات كاشف على بروتوكول هاميلتون نجم، بمتوسط ​​A 260/280 نسبة 1.96 ومتوسط ​​نسبة A 260/230 من 1.93. وA 260/280 النسبة بين 1،7-2،0 ونسبة 260/230> 1.7 تدل عموما من الحمض النووي نقية جدا، وخالية من الأملاح المتبقية والبروتينات أو المذيبات، ومقبولة للتطبيقات الجزيئية معظم المصب. 1٪ agarose هلام في الشكل 6B يدل على أن gDNA الناتجة من ارتفاع الوزن الجزيئي (> 24 KB)، مع الحد الأدنى من القص. ومتوسط ​​العائد الحمض النووي من مجموعة كاملة من 45 عينات إيجابية هو 5.26 ± 0.46 ميكروغرام الحمض النووي البشري في 200 ميكرولتر من الدم الكامل، استنادا إلى الحياة تكنولوجيز Quantifiler الإنسان DNA كيت الكمي. وقد أجريت دراسات التلوث المتبادل مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 5B مع الفراغات السلبية العازلة السيطرة تتخللها عينات إيجابية واستخراج بالتوازي، وكانت جميع الفراغات السلبية مرة أخرى عن طريق PCR (لا يظهر). المطهرون gDNA هو أيضا مناسبة للعديد من التحليلات الأخرى المستندة إلى PCR (لا يظهر).

وتظهر النتائج في الوقت الحقيقي من ثماني عينات تكرار لعينة البلازما الأمهات المجمعة معالجتها مع الإجراء TruTip كبيرة الحجم في الشكل 7. الانتهاء من بروتوكول كامل (بما في ذلك خارج الخط K بروتين الحضانة) في حوالي 2.5 ساعة، على غرار دليل QIAGEN اعارة كيت الأحماض النووية (أي مجموعات استخراج الآلي للمقارنة متاحة حتى الآن). متوسط ​​القيم ر C على جميع مكررات هي 34.58 ± 0.66 و 29.76 ± 0.50 للذكور الجنين (CHY) ومجموع الحمض النووي (CH1)، على التوالي، والذي يدل على التكرار ممتازة من طريقة استخراج الآلي. يتم حساب تركيز الحمض النووي الجنين داخل تجمع DNA مجموع (في مكافئات الجينوم)، على أساس تحليل نقطة مناسبا بالمقارنة مع المعايير، مع٪ متوسط ​​الناتج DNA الجنين عبر جميع العينات من 2.8٪. الحمض النووي الفعلي٪ الجنين لهذه العينة هو غير معروف لأنه تم تجميع عينات قبل تنفيذ الاستخراج. تكوين الحمض النووي الجنينياستخراج عينات البلازما في غير المجمعة باستخدام طريقة TruTip وعادة ما تكون 1.5 أضعاف مقارنة النتائج مع QIAGEN كيت الأحماض النووية اعارة (لا يظهر).

figure-results-1
الشكل 1. ويمكن إدراج عملية الاستخراج TruTip وتدفق العمل، بغض النظر عن نظام مناولة السائل. أخرى تحضير العينة أو خطوات التعامل مع السائل في الأعمال الروتينية الآلي اعتمادا على قدرات أداة التعامل مع السائل محددة والبرمجيات.

figure-results-2
الشكل 2. (A) إيبندورف epMotion 5070 عينة لوحة التخطيط. (B) ترتيب الكواشف / consumaBLES على المنضدة. يمكن تكوين لوحة عينة لمدة تصل إلى 24 عينة (أعمدة 1 و 5 و 9، على التوالي)، على الرغم من أن epMotion سيقوم بمعالجة فقط كحد أقصى من 8 عينات في وقت واحد. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-3
الشكل (3). هاميلتون نجم تخطيط سطح السفينة لتنقية الحمض النووي الجيني من الدم الكامل (وليس على نطاق و) الطابق المركز 1 = 1 مل هاميلتون نصائح تصفيتها؛ 2 = هاميلتون 1 مل نصائح غير مفلتر، 3 = Akonni / هاميلتون 1 مل LPT 2 مم TruTips؛ 4 = المدخلات الدم شركات الطيران عينة (أنابيب جمع الدم أو أنابيب microcentrifuge)؛ 5-9 = 290 مل أحواض كاشف للتحلل العازلة F، والإيثانول، وغسل العازلة J، K الاحتياطي اغسل وشطف العازلة A2، على التوالي؛ 10 = 96 دالآثار البيئية لوحة تجليد جيدا؛ 11 = 96 بئر عميقة غسل J؛ 12 = 96 عميق يغسل جيدا K؛ 13 = 96 لوحة عميق شطف جيدا؛ 14 = هاميلتون HHS2 سخان / شاكر مع نونك 96 عميق لوحة الحضانة جيدا؛ 15 = 50 مل حوض كاشف تحتوي على بروتين K. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-4
الشكل 4. وقد تم تجهيز هاميلتون STARplus تخطيط سطح السفينة لتنقية الحمض النووي من عينات بلازما حجم كبير (وليس إلى نطاق). النظام مع 8 × 5 قنوات مل و 8 × 1 مل قنوات (لا يظهر في تخطيط سطح السفينة). سطح السفينة المركز 1 = 4 مل هاميلتون نصائح تصفيتها؛ 2 = Akonni / هاملتون 5 مل TruTips؛ 3 = عينات البلازما مصدر؛ 4 = 50 مل أنابيب مخروطية؛ 5 = 120 مل تحتوي على أحواض كاشف CN-W1، W2 وCN-CN-W4 reageNTS؛ 6 = أحواض كاشف المنخفض التي تحتوي على بروتين كاف، CN-B2، B3-CN، EBA2، المد وCN-W3 الكواشف؛ 7 = 290 مل تحتوي على حوض كاشف كاشف CN-L1؛ 8 = 290 مل تحتوي على حوض كاشف CN -B1 كاشف؛ 9 = 96 لوحات جيدة العميق لخطوة 1 و 10 = 96 لوحات بئر عميق للخطوة 2؛ 11 = شركات الطيران عينة لالمنقى، والمنتج النهائي؛ 12 = هاميلتون 1 مل نصائح فلتر؛ 13 = Akonni / هاميلتون 1 مل LPT 4 مم TruTips. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-5
الشكل 5. (A). في الوقت الحقيقي PCR النتائج من استخراج TruTip الآلي من فيروس إنفلونزا أضاف ضمن نضح البلعوم (NPA). المدخلات حجم NPA = 100 ميكرولتر، حجم شطف = 50 ميكرولتر. النتائج هي متوسط ​​3 مكرر هxtractions من 5 الخلفيات NPA متميزة (ن = 15) في مستوى التخفيف والهدف الأنفلونزا. تم إجراء QPCR على النظام LightCycler 480 مع ظروف مقايسة هو موضح سابقا 15. (B) يتم الكشف عن أي انتقال التلوث عندما تتناثر 12 عينة إيجابية NPA مع عدم وجود ضوابط قالب والخاضعة لإجراء الاستخراج الآلي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-6
الشكل (6). نتائج الإنسان استخراج الحمض النووي الجيني من الدم الكامل. A) آثار الأشعة فوق البنفسجية و المرئية من 1000 معمل NanoDrop (ThermoFisher) من 10 اختيارها عشوائيا مكررات. B) agarose هلام 1٪ من TruTip المنقى gDNA. M = فيشر 24 KB ماكس DNA سلم. الممرات 1-4 = ~ 100 نانوغرام المنقى gDNA من أربعة عشوائيا مختارة مكررات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-7
الرقم 7. تم استخراج النتائج في الوقت الحقيقي PCR من ثمانية تكرار TruTip الاستخراج تعميم بحرية الحمض النووي من البلازما. عينات الرمز بواسطة العلامات النجمية (* أو **) في أيام منفصلة. CHY الكمي DNA الجنين من الذكور وCH1 الكمي الاجمالي الحالي الحمض النووي (الجنين والأم). تم إجراء QPCR على نظام 480 LightCycler (روش) مع المقايسات التي تم نشرها مسبقا استهداف CHY وCH1 18.

المناقشة

بساطة مفهوم TruTip وسير العمل (الشكل 1) جعلها تتكيف بسهولة، الآلي، وكفاءة وفعالية بالنسبة لعدد من المصفوفات السريرية العينة، حجم العينة المدخلات، ونظم مناولة السائل. وينبغي الاعتراف، مع ذلك، أن كل عينة سريرية هي فريدة من نوعها، وسوف تختلف واحدة إلى أخرى في اللزوجة، والجسيمات، والمخاط، والملوثات السطحية، الميكروبية، و / أو الخلفيات الوراثية البشرية. نظرا الاختلافات المتوقعة في تكوين العينة السريرية والاستخدامات المقصودة من بروتوكول إعداد عينة TruTip الآلي، وبالتالي قد يكون من الضروري تعديل بعض الخطوات في إجراء TruTip من أجل تحقيق النتائج المرجوة لنوع عينة محددة. بغض النظر عن نوع العينة، ومع ذلك، المعلمات TruTip التي عادة ما يكون لها الأثر الأكبر على نقاء الحمض النووي و / أو استرداد ما يلي:

  1. عينة الاختلاط والتجانس مع العازلة تحلل (والكحول). بينما TruTips ديك إعادةحجم المسام الكبيرة latively، تجانس العينة وتسييل الغاز الطبيعي مهم جدا لكفاءة تحلل الخلية، والخطوات اللاحقة ملزمة لTruTip متراصة. مع المحللة متجانسة وجيدة المسال، يمكن أن العينات التحرك من خلال TruTip مع معدلات التدفق العالي، مما يقلل من الوقت الكلي تجهيز العينات. كبير حجم البلازما بروتوكول يدل على إمكانات للمستخدمين لالتجانس بدقة وتسييل عينات من الصعب (على الخط أو خارج الخط)، على الرغم من حجم العينة مساهمة كبيرة.
  2. معدلات التدفق. معدلات التدفق أبطأ خلال ملزم الحمض النووي أو شطف يؤدي عادة إلى ارتفاع غلة الحمض النووي، وإن كان ذلك على حساب مجموع وقت المعالجة. قد معدلات التدفق أبطأ أيضا أن يقلل من مدى قص الحمض النووي.
  3. أرقام دورة. العدد الأمثل من الطموح والاستغناء دورات تعتمد على نوع العينة، ومجموع حجم العينة، ومعدلات التدفق. الخطوة 1 في الشكل رقم 1 هو عادة النقطة التي numbe دورةRS (ومعدلات التدفق) قد تتطلب بعض التحسين التجريبية، مع عينات مثل نضح البلعوم (الشكل 5) التي تمثل واحدة من أكثر تحديا لست] لتحسين ويرجع ذلك إلى مجموعة من اللزوجة NPA من مختلف المرضى.
  4. التجفيف. التجفيف الكامل للTruTip متراصة لا بد من منع المذيبات العضوية المتبقية من زملاء يبلغ حجمه مع تنقيته عينة الحمض النووي وعمليات المصب تثبيط أو الاختبارات. لأنه لم يتم تجفيفها TruTip عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح فراغ، فمن المهم لزيادة كل من معدل تدفق وأرقام دورة خلال خطوة التجفيف. أحيانا هناك قطيرة المتبقية من محلول الغسيل على محطة من TruTip بعد الانتهاء من دورات التجفيف. هاميلتون الروبوت لديه القدرة على تنفيذ عملية "لمسة طرف" على جانب البئر للافراج عن قطرة، وبالتالي ضمان شطف الخالية من المذيبات. لا يملك النظام epMotion هذه الميزة، ولكن قبل شطف من محطة TruTip في مدرسةيمكن برمجتها العازلة ution لتحقيق التأثير نفسه.

لأن الهندسة، المواد ماصة الحافة، وطريقة التعلق أحضان قناة الروبوتية هي فريدة من نوعها لكل مصنع صك، مطلوب بناء TruTip مختلفة لكل نظام مناولة السائل. أبعاد متراصة TruTip (قطر، سمك، وحجم المسام) لا ترتبط مع القدرة النووية ملزمة حمض (والكفاءة شطف)، كما هو متوقع لأي تقنية استخراج المرحلة الصلبة. بينما سميكة (> 4 مم) المصفوفات قد تكون جزءا لا يتجزأ في TruTip 1 مل إلى زيادة قدرة الحمض النووي ملزم للحصول على عينات كبيرة الحجم و / أو تحقيق المساواة في قدرة ملزم عبر صيغ TruTip محددة، وهناك علاقة تبادلية بين سماكة TruTip ومعدلات التدفق خلال الخطوة الأولي ملزم (في وجود لست] الخام). وهكذا، فإنه في بعض الأحيان من المفيد تضمين كتل أكبر قطرها إلى أكبر حجم ونصائح ماصة للخطوات الأولية لبروتوكول الآلي، (على سبيل المثال </ EM> في 5 مل هاميلتون / Akonni TruTips لقلع كبيرة الحجم). ونظرا للتكوينات TruTip محددة تمليها الشركات المصنعة من الروبوتات مناولة السائل، ومع ذلك، فإننا لا نتوقع بالضرورة TruTip غلة الحمض النووي لتكون مماثلة عبر منصات التعامل مع السائل من مصنعين مختلفين، أو عبر أحجام مختلفة TruTip.

سوف العينات السريرية (حسب التعريف) تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الجيني الإنسان ما لم يتم الحصول عليها من مواقع العقيمة عادة (مثل السائل الشوكي الدماغي). أحيانا هو المطلوب الحمض النووي الجيني البشري (كما في الشكل 6)، في حين أنه في تطبيقات أخرى في الحمض النووي البشري يمثل خلفية الجيني غير المرغوب فيها (أما بالنسبة الشكل 5). وجود الحمض النووي الخلفية هي عادة ليست مشكلة طالما أن المبلغ الإجمالي للحامض النووي في العينة لا تتجاوز قدرة ملزم للمتراصة، والحمض النووي الخلفية يمكن أن تكون بمثابة الناقل إذا كان الهدف المنشود النوويحمض موجود في كميات ضئيلة. الهدف من ارتفاع حجم استخراج بروتوكول البلازما (الشكل 7) هو عزل (مجزأة) DNA الجنين في وجود فائض 10-20 أضعاف من الحمض النووي الأمهات، والذي يشبه إلى الهدف إعداد عينة من اختبارات الأمراض المعدية إلا أن تسلسل متطابقة للغاية ولا يمكن تمييزها عن طريق اختبار الجزيئي محددة للغاية و / أو التمييز الحجم. في هذه الحالة، يتم عزل الحمض النووي مجموع تعميم باستخدام 5 مل TruTip، والجزيئية العالية وانخفاض الوزن الجزيئي DNA الجنين اللاحقة يتم فصل من خلال اللاحقة ملزمة وشطف إلى مل TruTip 1 عن طريق تغيير الظروف العازلة ملزمة. انتقائية فصل حجم وإثراء الأحماض النووية المستهدفة على أساس ملزم وممتلكاتهم شطف إلى متراصة السيليكا هو وضع يختلف كثيرا من العمل من تحقيقه عن طريق الأغشية أو حجم الأعمدة تدور الاستبعاد. فصل حجم وإثراء الحمض النووي الميكروبي من الحمض النووي الجيني الإنسان قد يكونccomplished في التطبيقات المستقبلية عن طريق تخصيص ملزمة TruTip ومخازن شطف.

أظهرت البروتوكولات الآلي هنا التأكيد على فائدة متراصة TruTip نفسها لتجهيز العينات السريرية متنوعة، وكيف يمكن تكييفها لكميات كبيرة ومحددة الروبوتات التعامل مع السائل. يؤدي أساليب مبسطة عادة في البروتوكولات استخراج أسرع مقارنة مع النظم الآلية الأخرى. بساطة التكنولوجيا TruTip، ومع ذلك، يتيح أيضا بعض المزايا من حيث التكلفة للراغبين في شراء، مؤتمتة نظام لتنقية حمض النووي الجديد، وذلك لأن الأجهزة الأساسية اللازمة لأتمتة إجراءات TruTip هي الذراع ماصة قناة نفسها بدلا من قضبان المغناطيسي، وأنظمة فراغ ، أو على متن جهاز طرد مركزي. يمكن استخدام لوحات كاشف معبأة سلفا أيضا تقليل مساحة والمواد الاستهلاكية المطلوبة، وضعف الإنتاجية في المدى. التقليل من مساحة سطح السفينة مع بروتوكولات TruTip يتيح أيضا للمستخدمين متقدمة لدمج المنبع أو دالعمليات المؤتمتة ownstream مع TruTip. على سبيل المثال حل easyBlood هاملتون إلى الدم الكامل يجزئ يمكن إدراجها مع طريقة استخراج الآلي TruTip، التي من شأنها تبسيط العمليات الحيوية بشكل كبير المصرفي. عمليات ما بعد الاستخراج مثل الكميات الحمض النووي، تطبيع، PCR انشاء، أو تسلسل الحمض النووي يتم أيضا دمجها بسهولة مع TruTip على منصات أكبر مناولة السائل.

الإفصاحات

والكتاب والعاملين في Akonni النظم البيولوجية، وشركة الذين ينتجون المواد المستخدمة في هذه المقالة.

وترعى حرية الوصول والإنتاج من هذه المادة بواسطة Akonni النظم البيولوجية، وشركة

شكر وتقدير

وقدم الدعم لأجزاء من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت منحة R 44 AI072784. نشكر الدكتور كيرستن سانت جورج، سارة B. Griesemer، داريل امسون وايمي عميد مختبر للأمراض الفيروسية، مركز وادز ورث، جديد قسم الصحة لولاية نيويورك لvirions إنفلونزا كميا والوصول إلى التحقق من صحة سريريا الأنفلونزا في الوقت الحقيقي المقايسات PCR.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف/المادة
طقم استخلاص الإنفلونزا TruTip (EPM TruTips)figure-materials-1 Akonni Biosystems, Inc.300-11120
إيثانول بنسبة 95%Acros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
أسيتون بتركيز 99%Sigma-Aldrich٢٧٠٧٢٥-٤ل
ماء معالج بـ DEPCLife TechnologiesAM9906
خزان الكاشف، 30 ملEppendorf960050100
لوح آبار عميقة 962,000 μlUSA Scientific30502302
رؤوس الترشيح المتحركة epT.I.P.S. Motion Filtertips، 1,000 μlEppendorf960050100
الأجهزة والمعدات
نظام epMotion 5070Eppendorf5070 000.000
أداة توزيع TM1000-8960001061
حامل الخزانات960002148
جدول 1. الكواشف والأجهزة اللازمة لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الآلي من مسحات الأنف والبلعوم (NPA).
الكاشف/المادة
طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي من الدم TruTip (Hamilton TruTips)figure-materials-2 Akonni Biosystems, Inc.300-20341
إيثانول بتركيز 95%Acros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
بروتيناز كAMRESCO LLCE195
حامل رؤوس ماصات Hamilton CO-RE 96 المرشحة سعة 1 ملHamilton Robotics, Inc.235905
حامل رؤوس ماصات Hamilton CO-RE 96 غير المفلترة سعة 1 ملHamilton Robotics, Inc.235904
حوض كاشف سعة 50 ملHamilton Robotics, Inc.187297
لوح آبار عميقة سعة 2 ملUSA Scientific1896-2800
Nunc 96 DWP-2 mlThermofisher27874
حوض الكواشففيشر14-222-412
الأجهزة والمعدات
نظام Hamilton STARHamilton Robotics, Inc.173027
قنوات ماصة مستقلة سعة 1 مل / ذراع نمطيHamilton Robotics, Inc.173081/173050
رأس بقنوات عددها 96 وسعة 1 ملHamilton Robotics, Inc.199090
حوامل الرؤوسHamilton Robotics, Inc.182085
حوامل/أدراج العيناتHamilton Robotics, Inc.173400/182238
حوامل الأطباقHamilton Robotics, Inc.182090
حامل MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
وحدة الرج والتدفئة HHS2Hamilton Robotics, Inc.199033
حامل الرفوفHamilton Robotics, Inc.188047
الجدول 2. الكواشف والمعدات لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) من الدم الكامل باستخدام لوحة ذات 96 بئراً.
الكواشف/المواد
طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) المتداول TruTip R+D (رؤوس Hamilton TruTips)figure-materials-3 Akonni Biosystems, Inc.اتصل للاستفسار
إيثانول 100%Sigma-Aldrich459828-1L
إيزوبروبانولAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC327270010
بروتيناز ك (Proteinase K)AMRESCO LLCE195
رؤوس ماصات مُفلترة سعة 4 مللترHamilton Robotics, Inc.184022
رؤوس ماصات سعة 1 مل غير مرشحةHamilton Robotics, Inc.235939
أطباق ذات آبار عميقة سعة 96 بئراًUSA Scientific1896-2800
أنابيب مخروطية سعة 50 ملCorning/ThermoFisher Scientific05-526B
أحواض كواشف سعة 50 ملHamilton Robotics, Inc.187297
أحواض كواشف سعة 120 ملHamilton Robotics, Inc.182703
أحواض كواشف ذات سعة كبيرة بـ 96 موقعاًThermoFisher Scientific14-222-412
المعدات
وحدة القاعدة / المنصة لمحطة عمل التحميل التلقائي STARplusHamilton Robotics, Inc.173025/190012
قنوات/أذرع ماصة مستقلة سعة 1 ملHamilton Robotics, Inc.173081/173052
5 مل قناة مستقلة / ذراع نمطيHamilton Robotics, Inc.184090/173050
حوامل الأطباقHamilton Robotics, Inc.182090
حامل MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
حامل رفوف لأحواض الكواشف سعة 50 ملHamilton Robotics, Inc.188047
حامل حوض كواشف سعة 120 ملHamilton Robotics, Inc.185290
حوامل الرؤوسHamilton Robotics, Inc.182085
حوامل أنابيب سعة 50 ملHamilton Robotics, Inc.182245
حوامل عينات ذات 24 موضعاًHamilton Robotics, Inc.173400
حامل عينات بـ 32 موضعاًHamilton Robotics, Inc.173410
الجدول 3. الكواشف والمعدات اللازمة لاستخلاص الحمض النووي (DNA) بكميات كبيرة من البلازما.

المراجع

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  2. Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
  3. Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
  4. Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32(2002).
  5. Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
  6. Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
  7. Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
  8. Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
  9. Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
  10. Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
  11. Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
  12. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
  13. Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
  14. Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , US7759112 (2010).
  15. Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
  16. Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
  17. Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
  18. Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hamilton Star

مقالات ذات صلة