مقالة منهجية

تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

DOI:

10.3791/50362

⸱

يونيو 30, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصفها تقنيات لتشريح الآليات الكامنة وراء من إفراز من فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف في exosomes. تم استغلال الببتيدات قصيرة محددة المستمدة من NEF وترنسفكأيشن البروتين لتحديد هيكل، وظيفة، والشركاء ملزم من نيف للسفر إفراز تعديل المنطقة. هذه الإجراءات ديك صلة عامة بالموضوع في العديد من الدراسات الآلتي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، في حالتنا HIV-1 نيف، في الحفاظ ليس فقط وظيفة بيولوجية، ولكن يمكن أيضا أن تمنع بشكل تنافسي وظيفة البروتين كامل طول. واستخدمت مجموعة من 20 نيف الببتيدات المسح، 20 الأحماض الأمينية في الطول مع كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، لتحديد العناصر الزخرفية في نيف المسؤولة عن تحريض له من موت الخلايا المبرمج. الببتيدات التي تحتوي على هذه العناصر الزخرفية التي يسببها موت الخلايا المبرمج أفكارك عند مستويات مماثلة لبروتين نيف كامل طول. A الببتيد الثانية، والمستمدة من إفراز تعديل المنطقة (SMR) من نيف، والإبقاء على القدرة على التفاعل مع البروتينات الخلوية تشارك في إفراز نيف في exosomes (exNef). وقد استخدم هذا الببتيد SMRwt باسم "الطعم" البروتين في التجارب المشتركة مناعي لعزل البروتينات الخلوية التي تربط خصيصا لعزر SMR نيف و. تم استخدام البروتين ترنسفكأيشن والأجسام المضادة تثبيط لتعطيل جسديا الرهان التفاعلوقد تم قياس وين نيف وmortalin، واحد من البروتينات SMR ملزم المعزولة، وتأثير مع القائم الفلورسنت exNef فحص إفراز. قدرة الببتيد SMRwt لتكومبيتي نيف كامل طول لالبروتينات الخلوية التي تربط بين عزر SMR، وجعلها المانع الأول من exNef إفراز. وهكذا، من خلال توظيف التقنيات الموضحة هنا، والتي تستفيد من خصائص فريدة من نوعها من الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، يمكن للمرء أن الإسراع في تحديد الدوافع الوظيفية في البروتينات وتطوير مثبطات القائم على الببتيد من الوظائف المسببة للأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع ظهور العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، وقد تباطأ وباء الإيدز في العالم الغربي، ولكن ليس تقليصها، ويستمر انتشار فيروس نقص المناعة البشرية إلى أن تكون عبئا صحيا كبيرا في جميع أنحاء العالم. مع استثناء من فعالية هامشية RV144 التايلاندية محاكمة، وقد أظهرت حتى الآن لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية فشل للحماية من العدوى. وهكذا، والبحث في مزيد من الأهداف، والإمكانات العلاجية لا تزال يبرره.

جنبا إلى جنب مع نضوب CD4 T-الخلية، وتنشيط المناعة المعمم الثابتة هو السمة المميزة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية. هذا التنشيط المناعي المزمن (سي آي ايه) يؤدي إلى زيادة في حجم الخلية، مجموعات سكانية فرعية لمفاوي تنشيط ومتباينة، واستنفاد الخلوية والشيخوخة، وقتل الخلايا T والخلايا B عن طريق تنشيط الناتج عن موت الخلية (AICD) 1،2،3، و راسخة بأنها واحدة من أقوى المؤشرات على تطور المرض 4،5،6،7،8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء CIA وCD4تبقى خلايا T نضوب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى توضيح بشكل كامل.

الأدلة من مختبرنا وغيرها أدت بنا إلى نموذج لتطور المرض (الشكل 1) حيث البروتين نيف فيروس نقص المناعة البشرية (عامل تنظيم سلبي) يحرض إفراز في exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة 13،14. هذه exosomes المحتوية نيف-(exNef) لحث على موت الخلايا المبرمج في عدد من الأنساب الخلية بما في ذلك CD4 المعافين خلايا تي 15،16. بدلا من ذلك، في حيدات / الضامة exNef يغير أنماط التعبير الجيني، على سبيل المثال التعبير خلوى، ويبدو أن إحداث حالة من التنشيط المناعي غير المجدولة. هذه الهيئة من الأدلة تشير إلى دور مهم لexNef في وكالة المخابرات المركزية ونضوب CD4 T-الخلية.

فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي تثبيط إفراز exNef يقلل من استنزاف CD4 T-الخليةوكالة المخابرات المركزية أن المرضية حملة فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.

لجمع الأدلة التي أدت إلى نموذجنا لفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز تطور المرض والبيانات اللاحقة التي بنيت على هذا النموذج، ونحن وضعت عددا من الكواشف رواية والمنهجيات التي سمحت لنا لتحليل الجينات من exNef إفراز، والبدء في تحديد البروتينات الخلوية المعنية. في العمل الأولي، وجدنا أن البروتين نيف يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المارة ويتم تحريرها خارج الخلية من الخلايا نيف-transfected والمصابين بفيروس الإيدز 15. قد الببتيدات المشتقة من (الخلية اللحمية المستمدة عامل-1، مع بديل ألفا الربط) SDF-1α ثبت سابقا أن تحتفظ بالكثير من النشاط ملزمة ويشير للجزيء كامل طول 17. نحن تكهن بأن الببتيدات من نيف قد يحمل في طياته بعض النشاط أفكارك من البروتين الكامل، والتي من شأنها أن تحتوي هذه الببتيدات بالضرورة المجال أفكارك نيف (ق). لتحديد هذه الببتيدات، وبالتالي نيفمجال أفكارك (ق)، وحصل على مجموعة من 20 HIV-1 نيف الببتيدات المسح الضوئي من المعاهد الوطنية للصحة أبحاث الإيدز وبرنامج الكاشف المرجعي. هذه الببتيدات 20-AA، تتم تسمية كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، من قبل عدد من مشاركة حمض أميني بهم، أي N20 يمتد نيف الأحماض الأمينية 1-20، N30 يمتد الأحماض الأمينية نيف 11-30، الخ 16. وجدنا أن تعريض خلايا تي خارج الخلية إلى الببتيدات محددة تداخل المجالات اثنين 10-AA متميزة في بروتين نيف كامل طول يسببها موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا. كشف تحليل لاحقة من هذه الببتيدات أفكارك نيف المستمدة من قدرتها على التفاعل الجسدي مع مستقبلات chemokine CXCR4 على سطح الخلايا التائية، مع حركية الملزمة التي سمحت هذه الببتيدات لمنع تنافسية ملزمة بين CXCR4 ويجند الطبيعية SDF-1α. وأخيرا، تم العثور على التفاعل الببتيدات أفكارك نيف المشتقة 'مع CXCR4 للحث على الاستجابة للضغط النفسي في هذه الخلايا T-مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج. هذه الأدلة سمح لنا QUICالمجالات الوظيفية KLY خريطة نيف و؛ وهي عملية قد استغرقت وقتا أطول بكثير باستخدام تقنيات الحمض النووي للطفرات قياسية مثل ألانين الطفرات المسح. كما أوضحت أيضا أن هذه الببتيدات نيف المستمدة قصيرة الاحتفاظ الوظيفة البيولوجية من المجالات أفكارك في بروتين كامل طول.

وبعد تحديد دور للنيف خارج الخلية، أي موت الخلايا المبرمج للخلايا تي، سعينا إلى فهم أفضل للكيفية التي كان يفرزها نيف من الخلايا. باستخدام سلسلة من بنيات نيف تحور، ونحن تعيين حفظها للغاية الزخارف بروتين نيف في المناطق N-محطة من فيروس نقص المناعة البشرية على حد سواء نيف، ولها المكاك ريسوس يعادل SIV ماك (قردي فيروس نقص المناعة) نيف، التي تعتبر بالغة الأهمية لexNef إفراز 13. كان، انتقد بشكل خاص، كبديل ألانين من أي من الأحماض الأمينية الخمس إما تقلص إلى حد كبير أو إلغاء إفراز exNef؛ واحدة من هذه الزخارف، وإفراز تعديل المنطقة (66VGFPV70 SMR). عندما سلمت إلى الخلايا عن طريق C الحافز النشطتم العثور على بروتين hariot الكاشف التسليم، الببتيد يحتوي على SMR تعلق على تسلسل الببتيد FLAG (SMRwt) لتثبيط إفراز exNef من كلا نيف-transfected والخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 18. وبناء على تجربتنا السابقة مع الببتيدات، قررنا استخدام هذا الببتيد لإلقاء الضوء على الجزيئات والآليات الكامنة وراء دور نيف SMR في exNef إفراز.

باستخدام الببتيد SMRwt كما لدينا "البروتين الطعم"، اشتركنا في immunoprecipitated شركاء ملزم الخلوية من SMR من المعافين لست] خلية T-18. قدمت تسلسل الببتيد FLAG مقبض مريحة لالتقاط الببتيد SMRwt باستخدام راتنج تقارب المضادة للFLAG. لدينا الحقائق السابقة أن حمض أميني أساسي واحد لألانين طفرة في الببتيد SMRwt كان كافيا لإلغاء تثبيط لها من exNef إفراز تحديد مريحة، الببتيد سيطرة محددة للغاية (SMRmut) التي استخدمناها لاستبعاد البروتينات المشترك immunoprecipitated يست محددة لSMR. باستخدام الببتيد مع لياليمجال pecific من الفائدة بدلا من بروتين كامل طول سمح لنا لتجاوز فحص العشرات من العوامل الخلوية التي تربط إلى المجالات الأخرى في نيف 19.

مرة واحدة حددنا شركاء SMR ملزم، كان الخطوة المنطقية التالية لاظهار أن الشركاء ملزم الخلوية التي تم تحديدها هي مهمة لوظيفة البيولوجية 18. الإجراء العادي لتحقيق ذلك هو أن مستويات البروتين ضربة قاضية باستخدام الهدف ميرنا البروتين محددة أو سيرنا، وبعد ذلك فحص تأثير على الوظيفة البيولوجية. أجرينا ضربة قاضية ميرنا، الذي يثبط ترجمة لمرنا الهدف، والحد من إنتاج هذا الهدف، في هذه الحالة بروتين SMR ملزم. هذا التخفيض من البروتين الهدف هو أثر غير مباشر، وربما له تأثير تأخر عن وظيفة بيولوجية البروتين المستهدفة تلعب دورا فيها وبناء على ذلك، قمنا بتوظيف أيضا أقل شيوعا الضد تقنية تثبيط لتحديد ما إذا تعطيل مباشرة النشاط منالبروتين الهدف يقلل أو يلغي الوظيفة البيولوجية. في هذا الإجراء، رفع أجسام مضادة ضد بروتين المستهدفة و transfected في الخلية باستخدام عربة الكاشف، والتفاعل بشكل مباشر مع البروتين الهدف إما أنه عزل من موقعه من وظيفة، أو عرقلة المجال الخاص به الملزمة ذات الصلة. تثبيط البروتين الهدف من خلال هذا الإجراء يعطل مباشرة وظيفتها، ويمكن أن تكمل إجراءات ضربة قاضية RNA عن طريق زيادة التأكيد على أهمية البروتين الهدف إلى الوظيفة البيولوجية.

بينما عربة الكاشف فعال في تقديم الببتيدات والبروتينات في الخلايا، وهذا هو عملية تستغرق وقتا طويلا ويحد من أنواع التجارب، على سبيل المثال التعرض لفترات طويلة أو متكررة والدراسات على الحيوانات في الجسم الحي التي يمكن القيام بها. ونتيجة لذلك، واضاف نحن الببتيد (CPP) تسلسل لاختراق الخلية إلى SMRwt الببتيد (SMRwt-CPP) 18 لإنشاء الببتيد التي يمكن اتخاذها من قبل الخلايا بشكل سلبيمن وسائل الإعلام الثقافة. وكان هذا الإصدار فعالة مثل السابق في إفراز exNef معرقلة.

الأدلة من هذه التجارب نشرت يدل على قدرة الببتيدات الصغيرة التي تحتوي على زخارف وظيفية محددة لاستعداء ظيفة البروتين كامل طول عن طريق تثبيط تنافسية، وعزل البروتينات التي تربط هذه الزخارف. ويتوقع المرء أن هذه التقنيات ينبغي أن تكون مفيدة في كثير من البروتوكولات التجريبية. وينبغي أيضا أن تكون فعالة في الهندسة رواية مثبطات الببتيد العديد من العمليات الخلوية؛ دالة التي يمكن تعزيزه من خلال الربط إلى متواليات CPP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. استخدام الببتيدات قصير في التحليل البيولوجي

I.1. رسم الزخارف وظيفية بيولوجيا باستخدام الببتيدات

  1. علاج الخلايا مع الببتيدات المسح نيف
    1. شراء مجموعة من الببتيدات مسح المنطقة من الفائدة. لتجاربنا، الببتيدات 20mer، مع 10 التداخل الأحماض الأمينية، والتي تمتد على HIV-1 نيف بروتين كامل (205 ألف)، تم الحصول عليها من برنامج الكاشف الإيدز. ويعاير الببتيدات بشكل فردي على النحو التالي:
    2. إضافة 10 نانوغرام / مل من الببتيد إلى مستنبت الخلية.
    3. إضافة 10 مل من مستنبت لكل لوحة لJurkat الثقافات الخلية.
    4. احتضان الثقافات لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. محطة deoxynucleotidyltransferase بوساطة dUTP البيوتين نيك نهاية وصفها (النفق) مقايسة من موت الخلايا المبرمج
    1. غسل الخلايا مع 1X PBS، وإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4.
    2. غسل مع 1X PBS، وpermeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. شطف الخلايا مرتين مع 1X PBS.
    4. عد الخلايا الملون بواسطة epifluorescence على نظام الفحص المجهري الكمبيوتر التي تسيطر عليها.

I.2. تحليل تثبيط تنافسية باستخدام الببتيدات

  1. شارك في ترنسفكأيشن من الببتيدات باستخدام بروتين التسليم عربة كيت الكاشف
    1. لكل ترنسفكأيشن خليط التفاعل، وتمييع 1 ميكروغرام من wtNef-GFP DNA البلازميد و 100 نانوغرام من الببتيدات إما wildtype المستمدة من المجال SMR، أو التي تحتوي على الببتيدات ألانين الاستبدال من الأحماض الأمينية الفردية في عزر SMR، إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر مع 1X PBS.
    2. تمييع 6 ميكرولتر من 1/10 التخفيف من عربة الكاشف إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر مع الماء المعقم، ويتحد مع المخفف مزيج الحمض النووي الببتيد.
    3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بتشكيل عربة / مجمع الحمض النووي الببتيد.
    4. بيليه 3 × 10 5 خلايا Jurkat بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS، و resuspend في مجمع عربة / DNA-الببتيد.
    6. إضافة 400 ميكرولتر من المصل خالية المتوسط ​​1640 RPMI إلى تعليق واحتضان الخلايا في لوحات الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    7. إضافة 1 مل من المتوسط ​​1640 الطازجة المتوسطة التي تحتوي على FBS 10٪ إلى كل لوحة، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    8. حصاد الخلايا وتحديد كفاءة ترنسفكأيشن بواسطة المجهر الفلورسنت.
  2. NEF-GFP إفراز قارئ لوحة فلوري مقايسة تثبيط الببتيد
    1. جمع وسائل الإعلام مكيفة خالية من الخلايا من الخلايا التي تحصد، ونقل 100 ميكرولتر من الآبار الفردية لوحة microtiter 96-جيدا السوداء.
    2. قياس مضان GFP في وسائل الإعلام على TECAN GENEios مقياس التألق مع الإثارة الطول الموجي 485 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات 515 نانومتر في وحدات الفلورسنت النسبي.
    3. تعيين مستوى من GFP مضان في عنصر التحكم (وسائل الإعلام من الخلايا شارك في transfected مع GFP-نيف وسارعت الببتيد) عند 100٪.
    4. قارن هذا إلى مستوى GFP مضان في وسائل الإعلام من الخلايا شارك في transfected مع مختلف الببتيدات SMR لتحديد التغيرات في نيف-GFP إفراز.

I.3. عزل الحافز الشركاء ملزم باستخدام الببتيدات كطعم

  1. شارك في مناعي مع الببتيدات SMR
    1. تنمو الخلايا Jurkat في المتوسط ​​1640 RPMI تحتوي على FBS 10٪ عند 37 درجة مئوية في T-75 قارورة الثقافة الأنسجة، والخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحديد كفاءة ترنسفكأيشن، من خلال وضع لوحة تحت المجهر الفلورسنت، والتقاط الصور، وبعد ذلك عد الخلايا المشاركات وصفت وتحديد الخلايا المسمى في المئة.
    2. Resuspend وبيليه الخلية في 1 مل 1X PBS، وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف 1.5 مل. microcentrifuge في 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. Resuspend الكرية في 1 مل α-FLAG العازلة تحلل طيف من قبل pipetting. تحلل العازلة: ميكس 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك • درجة الحموضة 7.4، 150 ملي الصوديوم شيليoride [كلوريد الصوديوم]، 1 ملم EDTA، و 1٪ تريتون X-100، مع 1 ملي phenylmethylsulfonyl فلوريد [PMSF]، و 10 ميكرولتر / مل البروتياز كوكتيل المانع للاستخدام مع خلايا الثدييات ومقتطفات الأنسجة [الموافقة المسبقة عن علم؛ سيجما]. جعل فورا قبل استخدام.
    3. تفاضلي microcentrifuge الايقاف في 2،000 x ج لمدة 5 دقائق، وعلى 13،000 XG لمدة 10 دقيقة لتكوير الحطام الخلية والحمض النووي، على التوالي. جمع طاف (المشار إليها فيما يلي باسم "المحللة").
    4. إضافة 1 ملغ من البروتين المحللة و1 ميكروغرام إما SMRwt أو SMRmut الببتيد إلى 20 ميكرولتر من مكافحة FLAG M2 الانجذاب جل (وتسمى فيما بعد "الراتنج"؛ سيغما). علما أن كلا SMRwt وSMRmut المستخدمة هنا لديهم تسلسل علامة FLAG جزءا لا يتجزأ من الببتيدات. جلب الخليط إلى الحجم النهائي من 1 مل في المخزن المشارك IP (α-FLAG تحلل العازلة ناقص PMSF وPIC). احتضان الخليط في 4 درجات مئوية خلال الليل مع التناوب نهاية الإفراط في نهاية المطاف. كعنصر تحكم السلبية، احتضان المحللة مع الراتنج في غياب إما الببتيد.
    5. بيلير الراتنج بواسطة microcentrifugation في 5،000 - 8،000 x ج لمدة 30 ثانية. تسمح الراتنج لتسوية لمدة 2 دقيقة قبل التعامل مع عينة وثم نضح طاف. إزالة طاف مع طرف ماصة ضيقة نهاية، أو حقنة هاميلتون، والحرص على عدم نقل أي الراتنج. ضيق نصائح نهاية ماصة يمكن إجراؤها باستخدام ملقط لقرصة افتتاح غيض ماصة بلاستيكية حتى يتم إغلاقه جزئيا. غسل الراتنج أربع مرات مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة (50 ملي تريس • حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم). أزل البروتينات الخلوية المربوطة مع 15 ميكروغرام من 3X الببتيد FLAG (سيغما) في 50 ميكرولتر من غسل العازلة واحتضان على الكرسي الهزاز / شاكر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. تركيز eluates عن طريق الترسيب الأسيتون، تليها الغليان في عينة العازلة Laemmli (بيو راد). فصل بين البروتينات التي كتبها SDS-PAGE على 4-20٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك الفرقان سابقة الصب هلام (بيو-راد). وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق R-250 (بيو راد). ملاحظة: لقياس الطيف الكتلي تجارب تحديد الهوية ( الشكل 4A)، كل شرط (المشارك-IP مع SMRwt، SMRmut، أو معدومة الببتيد) تم أداء في quadruplicate، وeluates من جميع أربعة وإنشاء نسخ متماثلة وكان يتم تجميع قبل إلى هطول الأسيتون ليصبح المجموع من 4 ملغ نسبة من الكل البروتين الإدخال / شرط).
  2. المشارك-مناعي مع البروتين نيف-GFP
    1. خلط 50 ميكرولتر من Dynabeads بروتين G الخرز المغناطيسي (إينفيتروجن) مع 2 ميكروغرام من الفأري وحيدة النسيلة المضادة-GFP في 1 مل من 1X PBS مع 0.02٪ توين 20 (PBS-T). احتضان الخليط مع تناوب نهاية-الإفراط في نهاية في أ إيبندورف أنبوب 1.5-مل لمدة 1 HR في تمام الساعة 4 ° C.
    2. فصل بين الخرز من المخزن المؤقت عن طريق وضع أنبوب على 1.5-مل MagnaSphere تكنولوجيا المغناطيسي حامل الفاصل (PROMEGA كورب، [مديسن]، WI) مما يسمح للتبع المنسدلة المغناطيسي التي كتبها إزالة من طاف. تغسل حبات المغلفة المضادة-GFP مع 1 مل من PBS-T باستخدام pipetting للطيف.
    3. ليز نيف-GFP الخلايا Jurkat transfected مع 1 مل من 1X RIPA + المخزن المؤقت طيف من قبل pipetting والحضانة لمدة 15 Mفي على الجليد. RIPA + المخزن المؤقت: 10X RIPA الاحتياطي تحلل، ودرجة الحموضة 7.4 [ميليبور، [بدفورد]، MA] 01:10 المخفف في الماء المعقم، 0.02٪ من الصوديوم آزيد [سيجما]، و 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]، مع 1 ملي مول PMSF و 10 ميكرولتر / وأضاف مل الموافقة المسبقة عن علم على الفور قبل استخدام.
    4. بيليه على الحطام الخلية التي كتبها microcentrifugation في 2،000 XG لمدة 10 دقيقة. جمع طاف (المشار إليها فيما يلي باسم "المحللة").
    5. إضافة 1 ملغ من البروتين المحللة إلى الخرز المغلفة المضادة-GFP، وجلب وحدة التخزين النهائي إلى 1 مل مع 1X RIPA + المخزن المؤقت، واحتضان الخليط مع تناوب نهاية-الإفراط في نهاية لمدة 1 HR في تمام الساعة 4 ° C. ملاحظة ما يلي: للحصول على دراسات المنافسة الببتيد، 1 ملغ من البروتين المحللة قد يتم مسبقا-حضنت مع 2 ميكروغرام من SMRwt أو SMRmut الببتيد في 1 مل من 1X RIPA + المخزن المؤقت، وذلك قبل إلى يجري إضافتها إلى الخرز المغلفة المضادة-GFP.
    6. تغسل حبات من خلال إعادة تعليق في 1 مل من غسل المخزن المؤقت (50 ملي تريس • حمض الهيدروكلوريك ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 0.1٪ توين 20). احتضان مع تناوب نهاية-الإفراط في نهاية لمدة 5 دقائق في تمام الساعة 4 ° C. فصل بين F الخرزROM على غسل باستخدام عدالة في الدوحة الفصل قف المغناطيسي. تغسل حبات وقت واحد الثانية والثالثة مع المخازن المؤقتة غسل التي تحتوي على 250 مم و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، على التوالي.
    7. resuspend والخرز في 200 ميكرولتر من PBS، ونقل خليط إلى أنبوب نظيفة، وفصل بين الخرز من غسل على الوقوف المغناطيسي. تغلي حبات في 50 ميكرولتر من Laemmli عينة المخزن المؤقت 5 دقائق عند 95 ° C، والسماح للخليط لتبرد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وثم ضع الخليط على قف المغناطيسي لالانفصال، ووجمع supernatants ("eluates") .
    8. فصل البروتينات من شطافة بواسطة SDS-PAGE على 8-16٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك الفرقان مسبقة الصنع هلام.
  3. قياس الطيف الكتلي
    1. المكوس النطاقين البروتين من الفائدة من المواد الهلامية Coomassie-الملون.
    2. لحد من عينات في 10 ملي 1،4-dithiothreitol (DTT) لمدة 45 دقيقة عند 37 ° C.
    3. يؤلكل العينات في 55 iodoacetamide ملي مول لمدة 45 دقيقة عند 25 ° C.
    4. إكمال عملية هضم الطعام العينات بين عشية وضحاها مع التسلسل المحاولة الصفpsin (PROMEGA) عند 37 ° C.
    5. Desalt على الببتيدات عينة مع C-18 ZipTip (ميليبور). مزج الببتيدات عينة مع ألفا-CHC ماتريكس (اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، CA)، وبقعة لهم في الصعود إلى MTP الهدف الإطار III (بروكر Daltonics إينك.]، فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA).
    6. أداء جنبا إلى جنب الامتزاز / التأين ليزر مصفوفة المعانة من الوقت من-طيران تحليل الطيف الكتلي (MALDI-TOF/TOF) باستخدام بروكر Daltonics فائق المرونة III TOF / TOF.
    7. مقارنة البيانات MS / MS إلى قواعد البيانات NCBI غير-زائدة عن الحاجة والسويسري-بروت باستخدام خوارزمية التميمة ( www.matrixscience.com ).
  4. تحليل طخة مناعية
    1. فصل بين عينات البروتين التي كتبها SDS-PAGE على 4-20٪ أو 8-16٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك الفرقان سابقة الصب المواد الهلامية (بيو-راد). نقل النطاقين electrophoretically إلى أحد غشاء النيتروسليلوز.
    2. غسل الغشاء في تريس التخزين المؤقت المالحة (TBS؛ بيو-راد) لمدة 5 دقائق. منع مع 5٪ الحليب الخالي في TTBS (TBS مع 0.1٪ توين 20) لمدة 1 HR عن طريق هز في درجة حرارة الغرفة.
    3. معالجة غشاء لimmunoblotting باستخدام الأجسام المضادة الأولية محددة في 5٪ الحليب [نونفت] مع اهتزاز في تمام الساعة 4 ° C بين عشية وضحاها. غسل في TTBS لمدة 20 دقيقة تبع بواسطة أحد HRP مترافق مفتش الحكومة (H + L) الأجسام المضادة الثانوية في 5٪ الحليب [نونفت] لمدة 1 HR في درجة حرارة الغرفة. غسل في TTBS لمدة 30-60 دقيقة.
    4. كشف عن والعصابات البروتين عن طريق ويسترن التنشيف الكاشف وكسيماترين (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، إينك.]، سانتا كروز، CA). فضح مرشح لأفلام التصوير الفوتوغرافي. ملاحظة ما يلي: في بعض التجارب، تم استخدام كاشف تجريد لتجريد غشاء (بيرس، روكفورد، IL) مع التهجين لاحقة مع أ الأجسام المضادة الأولية والثانوية مختلفة.
    5. تفحص هذه الأفلام X-راي في البرنامج المفضل Adobe Photoshop 5.0.2. أداء تحليل قياس كثافة باستخدام البرمجيات يماغيج (المعاهد الوطنية للالصحة، [بثسدا]، MD).

II. استخدام من تثبيط الجسم المضاد في التحليل الدالي

II.1. المشارك-ترنسفكأيشن من Antibodالمنشأ باستخدام الطلبات للمنازل بروتين عربة كيت الكاشف

  1. لكل ترنسفكأيشن خليط التفاعل، وتمييع 1 ميكروغرام من wtNef-GFP DNA البلازميد و1 ميكروغرام إما الأجسام المضادة لمكافحة mortalin أو المضادة للα-تويولين الضد، إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر مع 1X PBS. ملاحظة ما يلي: تم فيها العثور على سابقا انها، وتشترك-ترنسفكأيشن من الأجسام المضادة المضادة-α-تويولين لا يوجد لديه تأثير يمكن كشفها على exNef إفراز،، وبالتالي، لأنها تخدم كما عنصر تحكم السلبية فعالة في هذه التجارب.
  2. تمييع 6 ميكرولتر من غير مخفف عربة الكاشف إلى وحدة تخزين النهائي من 100 ميكرولتر مع الماء المعقم، والجمع بين مع المخفف مزيج الحمض النووي-الأجسام المضادة.
  3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل من عربة / المعقدة الحمض النووي-الأجسام المضادة.
  4. بيليه 3 × 10 5 خلايا Jurkat بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS، و resuspend في عربة / المعقدة الحمض النووي-الأجسام المضادة.
  6. إضافة 400 ميكرولتر من خالية من مصل الدم المتوسط ​​1640 RPMI إلى تعليق واحتضان جells في لوحات ثقافة عند 37 ° C لمدة 2 HR.
  7. إضافة 1 مل من المتوسط ​​1640 الطازجة المتوسطة التي تحتوي على FBS 10٪ إلى كل لوحة، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.

II.2. NEF-GFP إفراز نيون لوحة الفحص قارئ تثبيط الجسم المضاد

  1. جمع وسائل الإعلام مكيفة خالية من الخلايا من الخلايا التي تحصد، ونقل 100 ميكرولتر من الآبار الفردية لوحة microtiter 96-جيدا السوداء.
  2. قياس مضان GFP في وسائل الإعلام على TECAN GENEios مقياس التألق مع الإثارة الطول الموجي 485 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات 515 نانومتر في وحدات الفلورسنت النسبي.
  3. تعيين مستوى من GFP مضان في عنصر التحكم (وسائل الاعلام من الخلايا شارك-transfected مع نيف-GFP والمضادة-α-تويولين الضد) عند 100٪.
  4. مقارنة هذا إلى المستوى من GFP مضان في وسائل الإعلام من الخلايا شارك-transfected مع الأجسام المضادة لمكافحة mortalin إلى تحديد التغيرات في نيف-GFP إفراز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رسم الخرائط الدوافعع وظيفي بيولوجيا باستخدام هضميدات. وقد تم تحديد اثنين من المناطق بشأن البروتينات نيف التي تحفز على موت الخلايا المبرمج. وقد لوحظ موت الخلايا المبرمج-يحركها الببتيد (الشكل 2) بداية مع الببتيد N50 (AA30-50)، وتبلغ ذروتها في N60 (aa40-60) وN70 (aa50-70)، وتناقص إلى مستويات خلفية في الببتيد N100 (aa80-100). على الحافز الرئيسية 1 (M1) الذروة، تتمحور حول aa50-60، يستحث> 80٪ من مستويات أفكارك من البروتين نيف-كامل طول. ولوحظ وجود الث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي أن تثبيط من exNef إفراز يقلل من CD4 نضوب T-الخليوي وكالة المخابرات المركزية الامريكية أن الآلية المرضية محرك الأقراص فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز. وتحقيقا لهذا الهدف، وضعنا عددا من الكواشف رواية والمنهجيات التي سمحت لنا لتحليل الجينات من exNef إفراز، والبدء في تحديد البروتينات الخلوية المعنية. أدى هذا النهج أيضا إلى التنمية التي تضطلع بها المانع أول ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان مدعوما هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS / MBRS (جرانت 58268)، المعاهد الوطنية للصحة / NCRR / RCMI (جرانت G12-RR03034)، جورجيا بحوث التحالف التمويل في شكل منح GRA.VAC08.W، المعاهد الوطنية للصحة / NIAID / NRSA منحة F31AI091484، [إموري] CFAR منحة P30 A1050409. وقد أجريت هذا التحقيق في مركز أو قاعة للالتي شيدت مع الدعم من مرافق لبحوث التحسين جرانت # C06 RR18386 من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR. الخلايا Jurkat، فإن مجموعة من 20 فيروس نقص المناعة البشرية-1 الببتيدات نيف، فضلا عن تم الحصول على أرنب المضادة-فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف مصل ضدي من المعاهد الوطنية للصحة الإيدز بحوث & برنامج الكاشف المرجعي، (روكفيل، MD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة ببتيد 20mer مع 10 أحماض أمينية متداخلةأبحاث الكاشف المرجعي وأبحاث المعاهد الوطنية للصحة للإيدز4641
TUNEL AssayRoche11 684 809 910
كاشف توصيل بروتين العربةالشكل النشط30100
Tecan GENEios fluorimeter(مجموعة Tecan ، سويسرا)
لوحة ميكروتيتر سوداء 96 جيداCorning3792
مكافحة FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Dynabeads Protein G الخرز المغناطيسي Invitrogen100.03D
MagnaSphere Technology حامل الفصل المغناطيسي (وضعان)Promega Corp. ، ماديسون ، WIZ5332
C-18 ZipTip MilliporeZTC18S096راتنج C18 (0.6 مو ؛ لتر أو 0.2 مو ؛ ل أحجام السرير). قليل النوكليوتيدات أو صغيرة (< 50 كيلو دالتون) البروتينات / الببتيدات في محلول مائي
MALDI TOF / TOFBruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF
برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60(2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Peptide ScanningApoptosis AssayCo immunoprecipitationFluorescent MicroscopyFlow CytometryHIV 1 NefSecretion Modification RegionExosome SecretionMortalin BindingPeptide Inhibitors

مقالات ذات صلة