تفاعلات البروتين العابر للخلايا هي محددات هامة من البنكرياس وظيفة خلايا بيتا. مفصلة هنا هو الأسلوب مقتبس من نموذج coculture من synaptogenesis للتحقيق في كيفية تأثير البروتينات عبر الغشاء محددة إفراز الأنسولين. Transfected HEK293 خلايا التعبير عن البروتينات في المصالح؛ خلايا بيتا لا تحتاج إلى transfected أو خلاف ذلك مضطرب مباشرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيق وظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التفاعلات بين البروتينات عبر الغشاء على أسطح خلايا بيتا المجاورة عوامل هامة في تحديد وظيفة خلايا بيتا.
توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط التحليلات للآثار من التفاعلات المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة وربما منع الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات داخل نفس غشاء الخلية لتكون DIStinguished من آثار التفاعلات العابر للخلايا.
هنا يتم تقديم طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا. هذه الطريقة تنطبق على خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1 خلايا، وفصلها إلى خلايا بيتا الأولية. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا البروتينات التي تم تحديدها مهم للقيادة تشكيل المشبك. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن نضوج وظيفية خلايا بيتا قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة. قمنا بتطوير نظام حيث يتم استزراع خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة. في هذا النموذج، يتم بمنأى السيتوبلازم خلايا بيتا في حين خارج الخلية interactio البروتين البروتينيتم التلاعب نانوثانية. على الرغم من أننا نركز هنا في المقام الأول على دراسات من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، وعمليات أخرى يمكن تحليلها، على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني على النحو الذي يحدده immunoblotting أو QPCR.
المقدمة
نحن هنا وصف طريقة لتسهيل التحقيقات في كيفية المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء محددة تؤثر على إفراز الأنسولين. تحقيقات أسلوب آثار تفاعلات البروتين في المصالح مع البروتينات (أو ربما الجزيئات الأخرى) على سطح البنكرياس خلايا بيتا. الأسلوب يسمح التحقيقات لكيفية بروتينات سطح الخلية التي أعربت عنها خلايا بيتا أو بواسطة الخلايا المجاورة الأخرى (مثل الخلايا البطانية، الخلايا العصبية، خلايا ألفا البنكرياس) تؤثر على وظيفة خلايا بيتا من خلال التفاعلات العابر للخلايا (أي من خلال التفاعل مع الشركاء التفاعل على سطح مجاور خلايا بيتا).
الغشاء البلازم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ترنسفكأيشن من HEK293 طبقة
- إعداد HEK293 المتوسطة الخلية عن طريق إضافة إلى 500 زجاجات مل من DMEM (مع 4.5 جم / مل الجلوكوز وأحمر الفينول ودون الجلوتامين): 50 مل FBS، 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين حل، 5 مل 100X حل L-الجلوتامين و 500 ميكرولتر الأمفوتريسين B.
- لوحة من HEK293 الخلايا في 24 لوحة جيدا باستخدام 0.5 مل من وسائل الاعلام HEK293 لكل بئر. تأكد من أن الخلايا تنتشر بالتساوي في جميع أنحاء الجزء السفلي من لوحة.
- عندما الخلايا HEK293 تصل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، لدينا اختبار تأثير أنواع مختلفة من neuroligin البروتين على إفراز الأنسولين. هذا يكمل عملنا نشرت التحقيق في تأثير neuroligin-2 على وظيفة خلايا بيتا 10. الشكل 2، على سبيل المثال، يصور النتائج التي تم الحصول عليها من INS-1 coculturing خلايا بيتا مع HEK293 الخلايا transfected للتعبير عن شكل الإسوي neuroligin المشار إليها هنا كما NL- X. وقد تم تصميم هذه التجربة لاختبار الفرضية القائلة بأن NL-X تشارك في التفاعلات العابر للخلايا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة coculture الموصوفة هنا يوفر وسيلة فعالة لتحديد أهمية الفسيولوجية للبروتينات بيتا على سطح الخلية، الغشاء محددة، وعلى وجه التحديد من المجالات الخاصة بهم خارج الخلية. من قبل خلايا بيتا زراعة الخلايا أو ورم جزيري (مثل الخلايا INS-1 يعمل هنا) في اتصال مع خلايا HEK293 عرض بروتين من الفائدة على سطح الخلية، والتجارب يمكن أن تكون مصممة لتحديد آثار خارج الخلية البروتين البروتين التفاعلات دون إزعاج مباشرة الوسط بين الخلايا من الخلايا. منذ يتم التعبير عن البروتينات من الاهتمام من خلال H.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01DK080971 والأحداث مؤسسة أبحاث السكري منحة 37-2009-44. كما أننا نقدر الدعم الذي تلقته من مركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو لطب الاطفال أبحاث السكري (PDRC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| pcDNA 3.3 ناقلات / العمود الفقري | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| حل القلم / البكتيريا | Mediatech | 45001-652-1 | |
| أمفوتريسين ب | Mediatech | 45001-808-1 / 30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt&# 8211; ثانول | إنفيتروجين | 21985023 | |
| متجرد الخلايا | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 قارورة | BD | 1368065 | |
| المجهر الإلكتروني | بارافورمالدهيد | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA تحلل عازلة | Sigma | R0278 |
المراجع
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates i....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
