ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من thaliana نبات الأرابيدوبسيس البذور. ما يصل الى 40 الأجنة يمكن أن تكون معزولة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. هذا الإجراء هو مناسبة لTranscriptome على، الحامض النووي، مراسل التعبير الجيني، المناعية ومضان في الموقع تحليلات التهجين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في النباتات المزهرة، الجنين يتطور داخل الأنسجة مغذية - السويداء - محاطة integuments البذور الأمهات (أو معطف البذور). ونتيجة لذلك، وعزل الأجنة النباتية في المراحل المبكرة (1 الخلية إلى مرحلة كروي) يمثل تحديا تقنيا بسبب عدم إمكانية الوصول النسبية. هو ضعف كفاءة تشريح دليل في المراحل الأولى بقوة من قبل صغر حجم بذور نبات الأرابيدوبسيس الشباب والإلتصاق من الجنين إلى الأنسجة المحيطة بها. هنا، نحن تصف طريقة التي تسمح للعزلة كفاءة الأجنة نبات الأرابيدوبسيس الشباب، مما أسفر حتى 40 الأجنة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. يتم الإفراج الأجنة في عازلة العزلة عن طريق سحق البذور قليلا 250-750 مع مدقة البلاستيك في أنبوب إيبندورف. كوب microcapillary تعلق إما مختبر ماصة القياسية (عن طريق أنبوب المطاط) أو يتم استخدام microinjector التحكم هيدروليكيا لجمع الأجنة من مكان قطراتد على شريحة متعددة أيضا على ضوء المجهر المقلوب. المهارات الفنية المطلوبة هي بسيطة وقابلة للنقل بسهولة، والإعداد الأساسية لا تتطلب معدات مكلفة. الأجنة التي تم جمعها هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب مثل RT-PCR، RNA تسلسل، تحليلات الحامض النووي، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، المناعية، ومراسل المقايسات الجينات.
المقدمة
ويحيط الجنين من النباتات المزهرة من السويداء، والأنسجة الغذائية المستمدة من حدث الإخصاب الثانية. ويحيط كل من الجنين والسويداء من قبل عدة طبقات الخلية من معطف البذور. هذه الأنسجة بشكل جماعي تشكيل البذور، التي تنمو داخل الفاكهة. وبالتالي، يعانون من ضعف الأنسجة وتحليلات خلية محددة من الأجنة نبات الأرابيدوبسيس بشدة بسبب عدم إمكانية الوصول لها. ومع ذلك، الأجنة في المراحل المتأخرة كروي أو في وقت لاحق نسبيا قابلة جيدا لتشريح اليدوي باستخدام الإبر التنغستن غرامة بموجب stereomicroscope، أو عن طريق تطبيق ضغط طفيف على البذور باستخدام ملقط لاستخراجها. واستخدمت هذه التقنيات بنجاح لTranscriptome على تحليلات أو التنميط epigenome مثل تهجين ميكروأري، التسلسل بيسلفيت، أو الحمض النووي الريبي التسلسل (على سبيل المثال 1-3). في المقابل، دراسات الأجنة في البيضة الملقحة إلى مرحلة كروية في وقت مبكر تظل تحديا تقنيا. حتى الآن، سوى عدد قليل من الدراسات لديهم معدل تقييمتحليلات Transcriptome على orted على الأجنة الشباب باستخدام إما تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) من الأنسجة الجنينية من أقسام البذور ثابت 4 أو استخراج دليل من الأجنة الفردية من داخل البذور باستخدام أدوات غرامة 5. ومع ذلك، معدات LCM لا تتوفر عادة واستخراج الجنين دليل في مراحل مبكرة وقتا طويلا وتتطلب مهارات تشريح الممتازة التي هي غير قابلة للتحويل بسهولة. بالإضافة إلى تحليل الجينوم واسعة، الموقع التحليلات التعبير الجيني في هي أيضا من الصعب تنفيذها على الشباب والأجنة كله يشن من نبات الأرابيدوبسيس. إلى حد ما، يمكن الإفراج الأجنة الشباب على شرائح المجهر من قبل ضغط لطيف على البذور واستخدامها لمراسل المقايسات الجين أو البروتين عن طريق الكشف المناعية (انظر على سبيل المثال 6،7). هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يسمح العزلة الجنين عالية الإنتاجية، مما يعيق التحليل الكمي.
لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول فعالة وسريعةلعزل الجنين في وقت مبكر من بذور نبات الأرابيدوبسيس التي هي بسيطة لإعداد، للتحويل بسهولة، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. المبدأ الأساسي هو سحق بلطف البذور - تشريح من siliques الشباب في أنبوب إيبندورف باستخدام مدقة البلاستيك في وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة. يتم وضع استخراج البذور في قطرات على شريحة متعددة بشكل جيد ويتم فحص لوجود الأجنة صدر في مرحلة المطلوب باستخدام مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary تعلق على microinjector أو ماصة المختبر القياسية. لتطبيقات الجزيئية، يتم غسلها مرتين من قبل الأجنة الإفراج المتكررة إلى قطرات من العازلة العزلة جديدة قبل نقلهم إلى المخزن المؤقت الوجهة في حجم الحد الأدنى. للتطبيقات الخلوي (المقايسات مراسل، المناعية، FISH)، يمكن حذف غسل الخطوات.
الأسلوب يوفر العديد من المزايا: (ط) لأنها تعود 25-40 الأجنة في ~ 45 دقيقة عن التطبيق الخلويlications أو في 3-4 ساعة لتطبيقات الجزيئية (بما في ذلك الخطوات الغسيل)، (الثاني) أنها تتيح العزلة من المراحل الجنينية محددة، (الثالث) فمن السهل نقلها إلى الأشخاص ومختبرات أخرى بسبب الإعداد لها بسيطة، (الرابع) أنه يتطلب معدات متناول الإعداد الأساسية والتي هي قابلة للترقيات، و(V) قد تم استخدامه بنجاح لمختلف التطبيقات المصب مثل RNA تسلسل 8، تحليل الجينات المحددة DNA-مثيلة 9، المقايسات مراسل (10 و Raissig وآخرون، في الإعدادية.)، والأسماك (J. Jaenisch، U. Grossniklaus، C. Baroux غير منشورة، انظر الشكل 5).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتتلخص الإجراء في المخطط الانسيابي هو مبين في الشكل 1. يتم عرض microcapillaries والإعداد فعال في الشكل 2 والشكل 3، ويتم عرض خطوات نموذجية من العزلة الجنين في الشكل 4.
1. المواد وإعداد الواق
1.1 سيليكون طلاء الزجاج microcapillaries
- وضع microcapillaries في 15 مل أنبوب فالكون مع ~ 5 مل من Sigmacote (سيغما) وعكس عدة مرات.
- إزالة الحل، وضع أنبوب فالكون يحتوي على الشعيرات الدموية في رقائق الألومنيوم ويخبز لهم لمدة 3 ساعة على 60 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
1.2 ~ 50-100 ميكرون الحصول قطرها نصائح microcapillary
- سحب 1 مم القطر الزجاج الشعيرات الدموية إما يدويا على الموقد بنسن أو باستخدام ساحبة التجارية (العمودي خيوط ساحبة أو مجتذب micropipette).
- استخدام الماسالقلم غيض أو شفرة لقطع غيض من سحبت الشعرية لخلق افتتاح المرجوة. حدد على شكل أفضل الشعيرات الدموية تحت المجهر ستيريو. وينبغي أن يكون افتتاح 50-100 ميكرون (الشكل 2).
1.3 إعداد الشرائح
- Siliconize الشرائح نظيفة من خلال تغطية جميع الآبار مع Sigmacote (~ 1 مل / الشريحة) لمدة 5 دقائق، وإزالة. خبز 3 ساعة في رقائق الألومنيوم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- غسل متعددة أيضا شرائح زجاجية مجهرية لمدة 10 دقيقة في 10٪ SDS، 2 × 2 دقيقة في nuclease خالية من المياه (تعقيمها DEPC-ده 2 O)، 2 دقيقة في الايثانول 70٪، 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪، والهواء تجف. تتم جميع الخطوات في الجرار Coplin تعقيمها. الشرائح ويمكن إعادة استخدامه عدة مرات توفير تنظيف شامل بين كل استخدام.
- فقط قبل الجنين انتشار العزلة ~ 0.5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) مع ماصة على سطح كامل من كل بئر والهواء الجاف.
1.4 المجهر والإعداد الشعرية
- استخدام مجهر مقلوب مع 10X 20X الهدف والتكبير. تحسين النقيض من الضوء (أجنة شفافة تماما).
- وضع مياداة مجهرية لعقد الزجاج الشعرية بجوار المجهر. يتم توصيل الزجاج الشعرية إلى microinjector (الشكل 3A) أو إلى العادية P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط (الشكل 3B، انظر المناقشة للحصول على وصف مفصل لهذا الإعداد).
- ضع الشعرية فوق شريحة المجهر في زاوية ~ 70 درجة (الشكل 3) وضبط الموقف أن يكون فتحة في مجال الرؤية.
- قبيل العزلة الجنين يستغرق والافراج ~ 5-10 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل) لمعطف الشعرية.
1.5 المخازن المؤقتة
يسرد الجدول 1 العزلة والمقصد مخازن بالاعتماد على التطبيقات المصب.
- إعداد ~ 1 مل العازلة العزلة لكل عينة استخدام طازجة قبل وابقائه على الجليد.
- إعداد المخزن المؤقت الوجهة في مل أنبوب إيبندورف 0.5 ملزم منخفض على الجليد (تطبيقات الجزيئية) أو على شريحة المجهر (تطبيقات الخلوي) في غرفة رطبة.
2. تشريح البذور واستخراج الأجنة
2.1 المزامنة من تطوير البذور
- إضعاف الزهور والاحتفاظ بها 2 أيام في غرفة النمو مع تجنب الاتصال من المدقات يتعرض مع غيرها من الزهور، ثم تلقح لهم (على سبيل المثال 11).
- اختبار تلك المرحلة من التطور في ظل ظروف النمو الخاص بك عن طريق التحقيق المجهرية من البذور تطهيرها. مع ظروف النمو لدينا (16 ساعة ضوء في 21 ° C، 8 ساعة مظلمة عند 18 درجة مئوية والرطوبة 70٪) جمع البذور 2.5 أيام بعد التلقيح (DAP) أسفرت أساسا 2-4 أجنة الخلية والبذور التي تم جمعها 3،5-4 DAP أسفرت كروي الأجنة.
2.2 تشريح البذور وتمزق
- إزالة الصورةeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) تحت stereomicroscope مع ملقط وإبر الأنسولين.
- تزج البذور في 20 ميكرولتر العازلة العزلة في 2 مل جولة القاع أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
- سحق بلطف البذور مع مدقة البلاستيك (قبل تنظيفها مع 10٪ SDS، تشطف مع DEPC-ده 2 O وغسلها مع الايثانول 70٪) للافراج عن الأجنة حتى استخراج البذور هو غائم. القوة لتقديم الطلبات هو يحدده كل مستخدم على المحاكمة.
- شطف مدقة مع 300 ميكرولتر من العازلة العزلة لغسل مدقة وتمييع العينة.
- تدور باستمرار استخراج في 5،000 x ج لمدة 5 ثوانى. resuspend بلطف استخراج مكعبات من قبل pipetting صعودا ونزولا 2-3 مرات.
- تحديد استخراج مع شبكة من النايلون 30 ميكرومتر (التي شنت على محولات أنبوب، على سبيل المثال من PartecCelltricks). شطف شبكة مع 200 العازلة ميكرولتر إضافية العزلة.
3. عزل الجنين
3.1 إعداد الشرائح
- <لى> مكان نظيف والشرائح المتعددة جيدا BSA المغلفة وsiliconized على مسرح المجهر المقلوب، resuspend واستخراج البذور تمت تصفيتها من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا وماصة 2 قطرات من 40-50 ميكرولتر استخراج البذور في 1 أو 2 الآبار . فحص فقط 1 أو 2 قطرات في وقت يمنع التبخر من العينة.
- مكان 50 ميكرولتر من العازلة العزلة الطازجة (1 شارع انخفاض غسل) في بئر من شريحة مختلفة أعدت كما كان من قبل. إبقاء هذه الشريحة في غرفة تجارة وصناعة المغطاة الرطبة لمنع التبخر.
3.2 الشاشة، وتنظيف، وجمع
- فحص قطرات من استخراج البذور من أجل أجنة في مرحلة المطلوب مع هدف التكبير 10x. إذا لزم الأمر، تأكيد المسرح مع التكبير 20X. الأجنة عادة تنزل الى القاع من الشريحة.
- إزالة يدويا الحطام حول الجنين مع إبرة التنغستن، إبرة الأنسولين أو معدات مماثلة.
- نقل الزجاج الشعرية بالقرب من جنين باستخدام مياداة مجهرية، رأك يصل الجنين مع كحل أقل قدر ممكن.
- جمع العديد من الأجنة (على سبيل المثال كل من القطيرات واحدة) وإطلاق سراحهم في 1 شارع انخفاض غسل (تطبيق الجزيئية) أو في المخزن المؤقت الوجهة (تطبيقات الخلوي). يجب أن تبقى كل جولة جمع في غضون 5-10 دقيقة وينبغي جمع الأجنة في حجم الحد الأدنى (الحجم الكلي للجميع الجولات جمع يجب أن يكون <5 ميكرولتر).
- تكرار الفحص وجمع حتى يتم جمع المبلغ المطلوب من الأجنة في 1 شارع انخفاض غسل (مركزيا، إذا كان ذلك ممكنا، لتسهيل تذكر).
- يتذكر جميع الأجنة في آن واحد من قطرة غسل (إذا نفذت أكثر من الحطام، إزالتها بإبرة قبل تذكر).
- الإفراج عن الأجنة إلى قطرة غسل الثانية 2 من 50 ميكرولتر. كرر 3.2.6.
- الإفراج عن الأجنة في المخزن المؤقت الوجهة. نقل وينبغي أن تشمل فقط الاتصال، وليس الغمر، من طرف الشعرية.
- استبدال microcapilلاري للعينة القادمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لدينا إجراء العزل الجنين (الشكل 1) يسمح العزلة لمدة تصل إلى 40 الأجنة في 4 ساعة إذا يتم تنفيذ يغسل، وعلى سبيل المثال لتطبيقات الجزيئية، أو في أقل من ساعة إذا تم حذف يغسل، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. يعرض الشكل 2 العالية والمنخفضة نصائح microcapillary الجودة والشكل 3 يبين الإعداد من الجهاز العزلة الجنين. يعرض الشكل 4 عملية عزل الأجنة على مجهر مقلوب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وضعنا بروتوكولا العزلة الجنين الذي هو سريع، فعال، ويمكن نقلها بسهولة إلى مختبرات أخرى.
المعدات وصفها هنا يتكون من مجهر مقلوب، وهو مياداة مجهرية، زجاج microcapillaries، مجتذب خيوط الرأسي وmicroinjector (الشكل 3A). الإعداد هو مماثلة لتلك التي وصفها لاحد العزلة الخلية الحيوانية لتحاليل transcriptomics 17. كما عملنا بنجاح مع إعداد أكثر الأساسية حيث امتدت الزجاج microcapillaries يدويا فوق ل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر تل ناوي ومارتن باير لنصائحهم على العزلة الجنين. MTR، VG، UG وCB ابتكر أجهزة العزلة الجنين. وضعت MTR، VG وCB بروتوكول العزلة الجنين. أنشئت MTR، VG وCB البروتوكول، عزل الأجنة، والجنين ولدت [كدنا]، ينجز VG على JJ PCR، MTR تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، والتجارب على الأسماك. MTR، VG، CG وUG كتب مخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة زيوريخ، وزمالة من مؤسسة أبحاث روش (لMTR)، والمنح المقدمة من المؤسسة السويسرية الوطنية (لUG وCB).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
EQUIPMENT< / قوي > الحياة
td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| REAGENTS< / strong> | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (تقنيات الحياة) | 10777-019 | |
| أول حبلا عازل | Invitrogen (تقنيات الحياة) | 18064-022 | المضمنة في حزمة Superscript II |
| DTT | Invitrogen (تقنيات الحياة) | 18064-022 | الواردة في عبوة Superscript II |
| ألبومين مصل البقر (BSA) 100x = 10 مجم / مل | New England Biolabs Inc. | سيعمل موردون مختلفون أيضا | |
| على الشعيرات الدموية رقيقة الجدار 1.0 مم | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ م | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 مم قطرها شرائح | علوم المجهر الإلكتروني | 63421-10 | |
| محلول الفورمالديهايد | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus الشريحة | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gl&# 228; ser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| كريات SDS | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| محاقن الأنسولين الدقيقة | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| الإيثانول | Schaurlau | ET00102500 | |
| ملقط N5 | Dumont | 0108-5 | |
| محلل حيوي Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513< | |
| مجهر مقلوب | نيكون TMS (اليابان) ، | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 مسبار | Leica microsystems | 39430101 | ستقوم علامة تجارية مختلفة أيضا بالعمل |
| مجتذب الخيوط العمودي | أداة Sutter | نموذج P-20 | نموذج آخر مناسب أيضا |
| خلية الترام vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| كيوبيت فلورومتر | Invitrogen (تقنيات |
المراجع
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
