عزل الكائنات الدقيقة في التربة الأصلية مع المحتملة لتحطيم القابلة للتحلل أفلام الجرثومة البلاستيكية المستخدمة في الزراعة

ملخص

الأفلام البلاستيكية المسمى "تحلل" متوفرة تجاريا للاستخدام الزراعي والجراثيم. الحرث يمثل طريقة التخلص جذابة، ولكن تدهور في الظروف الميدانية غير مفهومة. وكان الغرض من هذه الدراسة إلى تطوير أساليب لعزل الفطريات التربة الأصلية والبكتيريا التي تستعمر الأفلام نشارة البلاستيك بعد الدفن المجال.

الملخص

الفطريات الأصلي إلى التربة الزراعية التي استعمرت المهاد (BDM) الأفلام القابلة للتحلل متاحة تجاريا تم عزل وتقييمها لإمكانية التحلل والبلاستيك. عادة، عندما يكون معروفا تركيبات من مواد بلاستيكية ومصدرا من المواد الأولية المتاحة، البلاستيك مسحوق يمكن تعليقها في وسائل الاعلام القائمة على أجار وتدهور يحددها التصور مناطق المقاصة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يحاكي سيئة تدهور الوضع الطبيعي من BDMs في. أولا، لا تفرق BDMs كما الجسيمات الصغيرة في جميع أنحاء مصفوفة التربة. ثانيا، لا تباع BDMs تجاريا باسم البوليمرات نقية، ولكن بدلا عن الأفلام التي تحتوي على مواد مضافة (مثل الحشو، والمواد البلاستيكية والأصباغ) التي قد تؤثر على نمو الجراثيم. واستخدمت الإجراءات الوارد ذكرها هنا للالعزلات تم الحصول عليها من الأفلام المهاد دفن التربة. تم اختبار العزلات الفطرية المكتسبة من BDMs حفرها بشكل فردي للنمو على قطعة من جديد، BDMs تطهيرها وضعت فوق المتوسطة المحددة التي لا تحتوي على الكربون مصدر هxcept أجار. تم اختبار العزلات التي نمت على BDMs أخرى في وسط سائل حيث كانت BDMs الوحيد مصدر الكربون المضافة. بعد ما يقرب من عشرة أسابيع، تم تقييم الاستعمار الفطرية وتدهور BDM بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحديد العزلات عبر تحليل الحمض النووي الريبي الريباسي تسلسل الجين. يصف هذا التقرير الأساليب لعزل الفطرية، ولكن تم عزل البكتيريا أيضا استخدام هذه الأساليب عن طريق استبدال وسائل الإعلام المناسبة للبكتيريا. منهجيتنا يجب أن تكون مفيدة للدراسات التحقيق في انهيار الأفلام البلاستيكية سليمة أو المنتجات التي المواد الأولية البلاستيكية هي إما غير معروفة أو غير متوفرة. ومع ذلك نهجنا لا يوفر طريقة الكمي لمقارنة معدلات تدهور BDM.

المقدمة

وقد اعتبر تدهور تاريخيا سمة غير مرغوب فيه من البوليمرات البلاستيكية، بسبب انهيار تقصير فترة حياة المنتج والمتانة. في الآونة الأخيرة، جعلت الوعي بالمشاكل البيئية التي عرضتها النفايات البلاستيكية في البيئة الطبيعية ^1،2،3 البلاستيك القابلة للتحلل بديلا جذابا لمواد البلاستيكية التقليدية. تدهور (كما هو موضح التغييرات الهيكلية، والتجزؤ، وانخفاض في الوزن الجزيئي، والنزاهة، وقوة ^4،5) تحدث عبر سلسلة من الأحداث، بما في ذلك العمليات غير الحيوية (الضغط الحراري، صور للأكسدة، والتحلل والتآكل والضغط الميكانيكي)، والتحلل البيولوجي ^6. بينما العمليات غير الحيوية يمكن تغيير حجم جزء وخصائص البلاستيك، يطلب من الكائنات الحية الدقيقة للتمعدن في نهاية المطاف إلى الماء وثاني أكسيد الكربون (في الظروف الهوائية) و / أو الميثان (تحت الظروف اللاهوائية).

A مكانة كبيرة لل البلاستيك القابلة للتحلل موجود في الزراعة، حيث تستخدم الجراثيم من البلاستيك لمنع نمو الأعشاب الضارة، والإبقاء على رطوبة التربة وزيادة درجات حرارة التربة ^7،8. وتغطي مئات الآلاف من الأفدنة في الولايات المتحدة وحدها مع الجراثيم البلاستيك ^9، بما في ذلك الجراثيم تتكون من البلاستيك القابلة للتحلل. بعد موسم نمو المحاصيل، وخيارات للتخلص من الجراثيم القابلة للتحلل (BDMs) تشمل التخلص منها في موقع لطمر النفايات، الحرق لاستعادة الطاقة ^10، والتدهور عن طريق التسميد، أو تدهور في التربة بعد الحراثة ^11. من هذه، أقل مصير كثيفة العمالة والحرث BDMs في التربة، ولكن دون تدهور كفاءة وتمعدن خلال أشهر غير المحاصيل (عموما في فصل الشتاء)، يمكن أن تبقى شظايا البلاستيك وتتداخل مع معدات الزراعية خلال فصل الربيع الحرث والزرع، و لا تزال قائمة في البيئة حيث أنها تؤثر بشكل كبير على الحياة البرية، والحياة النباتية، ومجهريات البقعة ^1،2،3،10.

SS = "jove_content"> على الرغم من أن العديد من المنتجات البلاستيكية، بما في ذلك الأفلام المهاد الزراعية، تحمل تسمية "تحلل" أو "سماد"، في الممارسة العملية، قد تدهور وتمعدن تكون فعالة جدا و / أو ناقصة جدا بالنسبة التحلل في التربة لتكون بديلا عمليا للتخلص من هذه المنتجات. على سبيل المثال، حققت بولي اثيلين أوكسو القابلة للتحلل فقط 12.4٪ تمعدن بعد سنة واحدة من التجوية وثلاثة أشهر لاحقة في 58 ° C قعت السماد، وأقل من نصف هذا المبلغ من تمعدن عندما كانت درجة الحرارة 25 ° C السماد ^12. في فصل الشتاء، ودرجات حرارة التربة في معظم المواقع تكون أقل من أي من هذه الحرارة، ويفترض أن يؤدي إلى أقل من ذلك النشاط الميكروبي وبالتالي، أقل تمعدن. بالإضافة إلى إبطاء معدلات التدهور، وقد أدى سوء استخدام مصطلح "قابلة للتحلل" إلى عدم الثقة في هذه المنتجات من قبل المستهلكين ^13،14، بما في ذلك تلك الموجودة في الصناعة الزراعية. التحلل البيولوجي هو التحويلمن البوليمرات لثاني أكسيد الكربون (و / أو الميثان) والماء ¹⁴ بواسطة طبيعيا الكائنات الحية الدقيقة ^4. ولذلك، يجب أن تقاس تحلل كيميائيا، وجمعية المادية من الكائنات الحية الدقيقة مع ركيزة لا يعني التحلل الميكروبي تلك المواد.

كجزء من جهد يرمي إلى دراسة الاستعمال المستدام للBDMs في الزراعة، ركزت هذه الدراسة على اكتشاف الكائنات الدقيقة الأصلي إلى التربة الزراعية التي تستعمر وتتحلل BDMs المتاحة تجاريا. وقد نشرت طرق الاختبار القياسية لقياس كيميائيا انهيار البلاستيك القابلة للتحلل عن طريق غير الحيوية والبيولوجية ^15،16،17. ومع ذلك، وهذه الأساليب لا تعالج تدهور البلاستيك حسب الأنواع الميكروبية الفردية، أو توفير وسائل لعزلتهم. منهجية يشبه هنا بصورة أوثق الطرق القياسية المصممة لتقييم البلاستيك لمقاومة انهيار الميكروبية بعد بتلقيح العينات مع الجراثيم الفطرية18،19.

عندما تعرف تركيبات من مواد بلاستيكية ومصدر المادة الخام متوفرا، البلاستيك مسحوق يمكن تعليقها في وسائل الاعلام القائمة على أجار وتدهور يحددها التصور مناطق المقاصة ^13. وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا لتحديد الكائنات الدقيقة التي تحط من البوليمرات مثل البولي يوريثان ^20، بولي (بوتيلين سوسينات-CO-أديبات) ^21، وبولي (حمض اللبنيك) ^22. ينطوي على طريقة مماثلة تعليق البلاستيك مسحوق نقي في وسط سائل حيث البلاستيك هو مصدر وحيد للكربون ^20،23. في حين أن هذه الأساليب لديها ميزة نظام محدد، فإنها تحاكي سيئة تدهور الوضع الطبيعي من BDMs في. أولا، يتم توزيع مساحة السطح بشكل مختلف لأن BDMs لا تفرق في الجسيمات الصغيرة في جميع أنحاء مصفوفة التربة، ولكن بدلا من ذلك، بيعها واستخدامها كأداة الأفلام. الثانية، والتركيب الكيميائي لBDMs يختلف عن البوليمرات نقية. BDMs تحتوي عموما المضافة مثلالحشو، والمواد البلاستيكية، وتلوينات، وهذه الإضافات قد تؤثر على نمو الميكروبات، وبالتالي، فإن معدل تمعدن. لهذا السبب، ولأن تكوين بعض الأفلام التجارية في هذه الدراسة كانت الملكية، فيلم من البلاستيك في شكله حقل جاهزة استخدمت لعزل الفطريات والبكتيريا. للبساطة، يتم وصف الأساليب أدناه فقط للفطريات، مع تعديلات لاحظت عند الاقتضاء عن العزلة البكتيرية.

في دراسة أجريت مؤخرا ^24، واستخدمت ثلاث BDMs المتاحة تجاريا وفيلم واحد التجريبية في المواقع الزراعية في ثلاث مناطق مختلفة من الولايات المتحدة لموسم زراعي واحد، وضعت في وقت لاحق في شبكة (250 ميكرون) أكياس ودفنها لفصل الشتاء واحد في التربة في نفس المواقع. 250 فتحات شبكة ميكرون تسمح خيوط فطرية لاختراق مع استبعاد الجذور ومعظم الحيوانات التربة، وتقليل زحف التربة ^25،26. مواد النايلون منع تدهور التربة في كيس. بعد الحفر، وتم انتشال العزلات ungal من قطعة BDM وتقييمها للنمو على الحد الأدنى من المتوسط ​​بدون مصدر الكربون عدا آغار و 5 سم × 5 سم مربع سطح تطهيرها من جديد، فيلم BDM غير المستخدمة التي كان قبل تطهيرها. لا يمكن تعقيمها معظم المواد البلاستيكية المستخدمة عن الأفلام دون فقدان النزاهة، كان يستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لذلك لقتل أي خلايا الجرثومية الموجودة على البلاستيك. ISO 846 ¹⁹ توصي سطح disinfesting في الايثانول 70٪ والتجفيف لاحقة، ولكن في حالة استخدام هذه الطريقة، يجب على المرء أن ضمان عدم وجود عنصر أو المضافة من الفيلم يتأثر سلبا من الإيثانول. منذ BDMs يتم تصنيع يفترض على تحمل أشعة الشمس، الأشعة فوق البنفسجية تم اختياره كوسيلة من وسائل التطهير.

وقد تم اختيار العزلات التي نمت على BDM قطعة أفضل من التركيز على الحد الأدنى من المتوسط ​​وحده لمزيد من الدراسة. يستخدم أجار، السكاريد التي تنتجها الطحالب البحرية، لترسيخ وسائل الإعلام الميكروبية لأنها لم تستخدم عادة من قبل أيضي زراعيا وليس طبياالكائنات الدقيقة قادرة، ولكن تم عزلها أجار تحليل الماء الأنزيمات من البكتيريا البحرية ²⁷ و أجار تحليل الماء البكتيريا أيضا تم عزلها من التربة ^28. البوليمرات BDM وأجار كلاهما يتوقع أن تكون ركائز نادرة للإنزيمات تفرزها فطريات التربة، والتي لم تتطور في البيئات التي تحتوي على هذه البوليمرات كمصادر المغذيات المحتملة، ولكن كلا ركائز موجودة في لوحة الأحيائي الموصوفة هنا (الخطوة 7). الفطريات التي تستخدم BDMs ولكن ليس أجار كمصدر الكربون يمكن أن تكون متباينة من الفطريات التي تستخدم أجار فقط، وذلك بمقارنة نمو على أجار طدت المتوسطة التي تحتوي على ط) مصدر الكربون إضافة أي باستثناء أجار (مراقبة سلبية)، والثاني) BDM أفلام (تجريبية) والثالث) الجلوكوز (مراقبة إيجابية). ومن المتوقع نمو جميع العزلات على الحد الأدنى من المتوسط ​​بالإضافة إلى الجلوكوز؛ الفطريات لا الناتجة عن الجلوكوز التي تحتوي على لوحات قد لا تكون قادرة على النمو على الحد الأدنى من المتوسط ​​خاصة استخدمت في التجربة. Potentiشركة بي دي إم degraders يجب أن ينمو على أجار طدت الحد الأدنى من المتوسط ​​+ فيلم BDM أفضل مما كانت تنمو على أجار طدت الحد الأدنى من المتوسط ​​وحدها. الفطريات التي تنمو على لوحات متوسطة الحد الأدنى هي أجار degraders أو oligotrophs، ومن المتوقع أيضا أن ينمو على أجار المرتبطة الأفلام BDM في لوحات الأحيائي، ولكن ليس على الأفلام أنفسهم (ما لم تكن مصادفة أيضا تتحلل البوليمرات BDM).

للقضاء على إمكانية رؤية نمو الجراثيم بسبب استخدام أجار وليس من BDMs، تابعنا الفحص الأولي من أجل الاستعمار BDM على لوحات أجار مع الأحيائي في تعريف المتوسطة مرق (الخطوة 9). قطعة BDM يمثل مصدر الكربون الوحيد المعروف في أنابيب الاختبار الأحيائي.

بعد الفحص الأولي، وعلى إحياء مخزونات الجلسرين من العزلات، شكلت بعض فطر شحيحة ولكن مرئية في المتوسط ​​تعريف السائل التي لا تحتوي على مصدر الكربون المعروفة. واقترحت هذه النتائج أن بعض العزلات المكتسبة كانت oligotrophs - الكائنات الحية التي تنمو عن طريق الكسح كميات صغيرة جدا من الكربون، والنيتروجين، والمواد المغذية الأخرى الذائبة سواء في البيئة المائية أو القائمة كما المتطايرة في الهواء ^29،30،31. تحديد الأنواع عن طريق تحليل الحمض النووي 18S الريباسي يؤيد هذا الرأي، حيث أن العديد من العزلات يقابل أجناس الفطرية ذكرت سابقا أن تظهر قلة التغذية ^32. Oligotrophs، والتي هي عادة الفطور الرمامة، تتطلب مجموعة واسعة من القدرات الأيضية لاستخدام الركيزة في طائفة من البيئات ^30. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن نفس الفطريات المعزولة من نحن BDMs (ويفترض تتطلب قدرات غير عادية الأنزيمية) أظهرت قدرات قليل التغذية، وكانت قادرة على النمو على ملوثات نزرة مثل زيوت الجلد من بصمات الأصابع والغبار والمواد المتطايرة أو التتبع في الهواء. ونظرا لعزلة oligotrophs، خلصنا إلى أن النمو على سطح BDM وحدها لا يمكن أن تستخدم للاستدلال BDM انهيار. وصف أساليب تعكس هذه الوثيقة جهودنا لالشوريreen المستعمرين BDM الأم من التربة الزراعية لانهيار النية الحسنة BDM.

البروتوكول

يتطلب هذا الإجراء على الأقل عدة أشهر للحضانة من الأفلام BDM في التربة، وعدة أشهر أخرى لاختبارات بيولوجية متتابعة على حد سواء على لوحات أجار وخالية من أجار، مرق محددة الصفات كيميائيا لتقييم الاستعمار وتدهورها. وترد وسائل الفردية في الترتيب الذي سوف يتم تنفيذها.

1. حضانة أفلام BDM في التربة

دمج الأفلام BDM في التربة تحت ظروف تحاكي تلك التي بموجبها سوف يكون من المتوقع أن تتحلل. الحصول على 400 غرام (أي ما يعادل وزن جاف) من التربة المقيمين وشطيرة 10 سم × 10 سم BDM مع التربة داخل 13 × 13 سم شبكة من النايلون (250 ميكرون) كيس. وثيق مع خيط النايلون. مرات الحضانة هي وفقا لتقدير المجرب. رصد و / أو تعديل المعلمات ذات الصلة إلى النشاط الميكروبي (مثل التربة درجة الحرارة، والمواد الغذائية والرطوبة) على فترات منتظمة طوال فترة الحضانة حسب الاقتضاء.

2. إعداد وسائل الإعلاموالكواشف

لتجنب إدخال مصادر المغذيات عن غير قصد في وسائل الإعلام وأنابيب والثقافة، واستخدام المواد الكيميائية المتفاعلة الصف، وأنابيب ثقافة المشتراة حديثا، النوع الأول عالى النقاء (مثل NanoPure) المياه، والأواني الزجاجية صارم يتم غسلها للوسائل الإعلام الاختلاط. تجنب انتقال التلوث من الكواشف - فمن الأفضل لاستخدام مجموعة مخصصة من الكواشف والزجاجية لهذا الغرض. لاحظ أنه من الممكن أن الفطريات قد تكون معزولة الذين تحول دون عنصر في الكواشف المذكورة أدناه النمو. في حالة حدوث ذلك، قد تكون هناك حاجة بعض التحسين.

1. قبل اتخاذ وسائل الإعلام، وغسل جميع الأواني الزجاجية اللازمة مع المنظفات المختبر ومن ثم حمض غسل (على سبيل المثال نقع بين عشية وضحاها في 10٪ HCL). شطف لا يقل عن اثني عشر مرات في الماء المقطر، ومرتين في الماء عالى النقاء. تغطية جميع الأواني الزجاجية مع رقائق الألومنيوم نظيفة لاستبعاد الغبار. ارتداء قفازات وتجنب لمس داخل وحواف السفن لاستبعاد زيوت الجلد من بصمات الأصابع. لتجنب أي الصابون ريسيمستحقات والخدوش في الزجاج والتي تسهل الاستعمار والفطريات الثقافة في شراؤها حديثا (غير مستخدمة)، تشطف وتعقيمها زجاج أنابيب ثقافة وقبعات.
2. البطاطا الدكستروز أجار يستخدم (PDA) لعزل الأولي من الفطريات من التربة، وإنشاء مستعمرات معزولة واحد وجيل من اللقاح للتخزين على المدى الطويل. إعداد وسائل الإعلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وبعد التعقيم (عندما تبرد إلى 50 درجة مئوية)، إضافة الكلورامفينيكول (من 10 ملغ / مل محلول المخزون في ETOH) إلى التركيز النهائي من 30 ميكروغرام / مل، لاستبعاد البكتيريا. ويشار إلى هذه الوسيلة الآن باسم PDA داا ^30.
3. ويستخدم الحد الأدنى من المتوسط ​​الفطرية (FMM) كقاعدة صلبة لBDMs تلقيح مع degraders البلاستيك الفطرية المحتملة. وبصرف النظر عن أجار (عندما تستخدم ليصلب متوسطة)، فمن خالية من الكربون. إلى ما يقرب من 800 مل من منزوع الأيونات H ₂ O، إضافة 6.0 ز نانو _3، 0.52 ز بوكل، 0.52 G MgSO ₄ · 7H2 O، 1.52 غ KH ₂ PO _4، و 1 العناصر النزرة محلول المخزون مل Hutner لل(2.2 غرام ZnSO ₄ · 7H ₂ O، 1.1 G H ₃ BO _3، 0.5 غرام MnCl ₂ · 4H ₂ O، 0.5 غرام FESO ₄ · 7H ₂ O، 0.16 G كوكلي ₂ · 5H ₂ O، 0.16 غ كبريتات النحاس ₄ · 5H ₂ O، 0.11 G (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O، و 5.0 ز نا ₄ EDTA في 100 مل المقطر H ₂ O ^{33 ، 34.} ​​ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، ويصل حجم إلى 1 L. بالنسبة للالأحيائي السائل، فلتر تعقيم FMM لتجنب ترسيب الأملاح. إذا كان المطلوب متوسطة الصلبة، إضافة 16 غرام آغار والأوتوكلاف. عندما أجار شبه الصلبة هي مطلوب، والحد من آغار إلى 8 ز / L. عندما يبرد إلى 50 ° C، إضافة الكلورامفينيكول إلى تركيز النهائي من 30 ميكروغرام / مل. ويشار إلى هذا المتوسط ​​الآن وكما FMM داا ^30. كعنصر تحكم لضمان أن العزلات الفطرية تنمو في هذه الوسيلة، وينبغي أن يكون FMM أماهدي أعلاه، ولكنها تحتوي على 10 غرام من السكر لكل لتر. وهذا ما يسمى الجلوكوز الحد الأدنى من المتوسط ^​​35 (GMM).
4. الفوسفات مخزنة المالحة ³⁶ (PBS) ويستخدم لتعليق جزيئات التربة والخلايا الميكروبية في التخفيف المتسلسل الأولي من BDMs المعرضة للتربة. لجعل برنامج تلفزيوني، إضافة 8 غرام كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا ₂ هبو _4، و 0.24 غرام KH ₂ PO _4-800 مل من الماء المقطر. تذوب الأملاح وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. جلب إجمالي حجم إلى 1 L مع الماء عالى النقاء. ملء أنابيب ثقافة نظيفة مع 9.5 مل و 4.5 مل PBS في أنبوب. الأوتوكلاف.
5. ويستخدم 30٪ (V / V) الجلسرين إلى تعليق الخلايا البكتيرية والخميرة cryopreserved، جراثيم، وأفطورة الفطرية أثناء التخزين في -80 درجة مئوية. جعل هذا الحل في الماء عالى النقاء. الأوتوكلاف.
6. 0.01٪ (V / V) يستخدم تريتون X-100 على تعليق الجراثيم الفطرية، والمنظفات يعمل كعامل ترطيب غير سامة للجراثيم مسعور. حل 100 ميكرولتر تريتون X-100 في 1 لتر من الماء عالى النقاء. الأوتوكلاف.
7. يستخدم 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) كمذيب لغلوتارالدهيد خلال SEM التثبيت. خلط 68.4 مل من 1 M نا ₂ هبو ₄ و 31.6 مل من 1 M ناه ₂ ص ₄ وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 L مع الماء عالى النقاء ^36.

3. إعداد المواد الأحيائي: إزالة التلوث السطحي من BDM أفلام

1. لأن بقايا الملوثات مثل الورق والشريط على أواني القطع هي مصادر الكربون المحتملة، استخدم مقص حديثا شراؤها أو شفرات الحلاقة الطازجة، وسطح غير العضوية لقطع. ارتداء القفازات لتجنب التلوث من الأفلام BDM مع زيوت الجلد. خفض الأفلام BDM إلى مربعات صغيرة (4.25 X 4.25 سم). هذه الساحة حجم يلائم مستوى 100 × 15 ملم بيتري لوحة.
2. استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم (الانبعاثات الطول الموجي = 253.7 نانومتر) لتطهير الأفلام BDM. كثيرا ما وجدت مثل هذه مصباح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية القياسية. ضمان أنه عندماضوء الأشعة فوق البنفسجية يعمل، وليس هناك تدفق الهواء الخارجي إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية التي قد تلوث الأفلام BDM.
3. الأسطح الرطبة داخل غطاء محرك السيارة مع 70٪ ETOH وتسمح لك بتشغيل منفاخ لمدة 15 دقيقة لطرد الهواء. ثم، إغلاق وشاح وتطهير السطح غطاء محرك السيارة مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
4. وضع الأفلام BDM في غطاء محرك السيارة تطهير، في الصفوف. تسمح للضوء الأشعة فوق البنفسجية للتألق على الأفلام لمدة 2 ساعة.
5. استخدام نظيفة، ملقط معقم لقلب الأفلام BDM. تبدأ في الصف الأمامي والعمل على الصف الخلفي لتقليل الوقت الذي اليدين والذراعين هي مباشرة فوق السطوح BDM حديثا تطهير. عندما التقليب BDMs، وضع الجانب حديثا تطهيرها الهبوطي على منطقة نظيفة تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية ولكن ليس سابقا على اتصال مع الجانب غير تطهيرها من الفيلم.
6. بعد 2 ساعة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية على كل جانب، وإزالة الأفلام BDM من مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع ملقط معقم، والعمل مرة أخرى من الأمام إلى الخلف لتجنب وضع اليدين والذراعين فوق بالفعل decontamiالأفلام nated. وضع الأفلام BDM في العقيمة، والحاويات، الجافة المغطاة مثل الأكواب احباط المغطاة. تخزين في RT في الظلام.

4. الإعداد الأحيائي لوحة

تنفيذ كافة الخطوات في غطاء نقل معقمة باستخدام تقنية العقيم.

1. وضع قطعة BDM UV-تطهيرها على سطح لوحات أجار. المنصوص عليها زاوية واحدة أولا، واسمحوا بلطف ما تبقى من لفة مربع في اتصال مع أجار. تجنب التجاعيد. وبعض الأفلام تشكيل التجاعيد وأثناء التخزين، وهذا أمر لا مفر منه. قد تتطلب الأغشية الرقيقة وخاصة استخدام ملقط اثنين من أجل وضع قطعة مسطحة.
2. مكان حبات من نصف صلبة FMM داا ³⁰ أجار فوق فيلم من البلاستيك لتوفير المياه والمغذيات مصدر للاستعمار الأولي من البلاستيك مسعور. حبات ليست ضرورية للأفلام نفاذية المياه. إعادة إذابة أجار في الميكروويف، واستخدام micropipettor لنقل أربعة 10 قطرات ميكرولتر من أجار المنصهر على المهاد (واحد في كل كورنير). لا تلمس غيض من ماصة مباشرة إلى المهاد لأنه قد ثقب. لا يتجاوز 10 ميكرولتر من كل قطرة ماء، وذلك لأن الوزن الزائد على نشارة يمكن سحب البلاستيك قبالة سطح أجار عندما مقلوب لوحات.
3. السماح لوحات الجلوس الجانب الأيمن حتى مع الأغطية على ليلة وضحاها لترسيخ تماما، ومن ثم تخزين الأكمام مختومة من جانب أجار وصلت إلى 4 درجات مئوية في الظلام. عندما تصبح مستعدة لأداء الاختبار الأحيائي (الخطوة 7)، استخدم ط) لوحة واحدة من FMM داا ³⁰ (المراقبة السلبية)، والثاني) واحدة تحتوي على أربعة لوحة الأحيائي 10 قطرات ميكرولتر من شبه الصلبة FMM داا ³⁰ على فيلم من البلاستيك، والثالث) لوحة واحدة من GMM (مراقبة إيجابية). في هذه الطريقة، أربعة مكررات من كل عزل ويمكن اختبار لكل لوحة من المتوسط.

5. الإعداد الأحيائي السائل

1. اتبع الإرشادات لقطع BDM في الخطوة 3.1. قبل تقطيع الأفلام البلاستيكية للالأحيائي السائل، واختيار الحجم الذي يناسب في أنبوب الثقافة.سوف تملك المساحات اللازمة لتحقيق كتلة موحدة بين عدة أنواع من البلاستيك تعتمد على سمك الفيلم. وجدنا أن قطعة ما يعادل 0.0175 ز تناسب بشكل جيد في 15 × 150 ملم أنابيب الثقافة.
2. سطح تطهير الأفلام مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في الخطوة 3 أعلاه.
3. لكل تكرار لعزل الميكروبات، وإعداد ثلاثة أنابيب للتلقيح: ط) 5 مل FMM تحتوي على جزء BDM من حجم محدد سلفا (التجريبية)، والثاني) 5 FMM مل مع عدم وجود مصدر الكربون (المراقبة السلبية)، والثالث) 5 مل GMM (مراقبة إيجابية). بالإضافة إلى ذلك، يعد تكرار أنابيب من FMM تحتوي كل BDM لفحصها، ولكن لا تطعيم لهم. وهذه الأنابيب مراقبة تكشف أي نمو الميكروبات الناتجة عن التلوث.

6. عزل الفطريات

حضانة التربة وإزالة عينة التالية، يتم عزل الفطريات من التربة التي تتمسك الأفلام BDM. إذا رغبت في ذلك، يمكن للبكتيريا simultaneouخبيث تكون معزولة مع نفس طريقة استخدام وسائل الإعلام المناسبة لعزل بكتريا التربة، مثل 1/10X تمييع زيتية الصويا أجار الخميرة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد لردع نمو الفطريات ^37. عندما يكون مطلوبا المتوسطة المعرفة من أجل العزلة البكتيرية في الخطوتين 5 و 7، M9 ³⁸ (زائد سيكلوهيكسيميد) هو خيار جيد.

1. قبل لتجهيز العينات، وإعداد برنامج تلفزيوني وPDA داا ^30. تسمح PDA ³⁰ لوحات داا لتجف (unbagged) في درجة حرارة الغرفة لحوالي 24 ساعة للقضاء على التكثيف على الأغطية وسطح أجار. قبل التسمية PDA داا ³⁰ لوحات.
2. حفر أكياس شبكية تحتوي على قطع BDM من مواقع الدفن المختارة في الخطوة 1. السفينة وتخزينها في 4 درجة مئوية لا تزيد عن 48 ساعة بعد استخراج من التربة.
3. باستخدام ملعقة العقيمة وملقط، وإزالة بلطف التربة حتى يتعرض البلاستيك ولكن لا تنظف قبالة التربة التي يتشبث BDM سطح الفيلم. خفض فيلم BDM إلى 1 سميتم استرداد 2 قطعة حتى 0.5 غرام من المواد لكل من أربعة مجموع مكررات. نقل 0.5 غرام BDM فيلم والتربة المرفقة إلى 25 مل تحتوي على أنابيب ثقافة 9.5 مل من برنامج تلفزيوني. إذا المهاد هو المتدهورة تماما أو يتم معالجة عنصر تحكم التربة فقط، إضافة 0.5 غرام من التربة إلى برنامج تلفزيوني، وإذا كان ممكنا، واختيار القطع التي لا تزال تغير لونها من نشارة المتبقية.
4. دوامة الأنابيب الثقافة التي تحتوي على 9.5 مل PBS و 0.5 غرام المهاد لمدة 30 ثانية على سرعة عالية، يصوتن في بالحمام المائي sonicating لمدة 10 دقيقة، ودوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. يقصد التحريض لتحطيم الأغشية الحيوية، وإزالة الخلايا جسديا أو جزءا لا يتجزأ من التمسك قطعة المهاد، وإنشاء نظام التعليق متجانسة.
5. الاستعداد لتمييع متسلسل الحل PBS / التربة للحصول على وحدات تشكيل مستعمرة فرد من التصفيح. لكل عينة، ومكان في غطاء تدفق الصفحي واحد أنبوب ثقافة مليئة 4.5 مل العقيمة PBS. لكل عينة، وملء ثلاثة آبار من لوحة 96 جيدا في آبار عميقة مليئة 450 ميكرولتر PBS.
6. البلاستيك / التربة التعليق الأصلي (0.5 غرام نشارة زائد 9.5 مل من برنامج تلفزيوني الحل) يمثل 5.0 × 10 ^-2 التخفيف من المواد الجرثومية والتمسك البلاستيك. إضافة 0.5 مل من تعليق من هذا الأنبوب الأصلي إلى 4.5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب الثقافة للحصول على تخفيف × 10 ^-3 5.0. دوامة لمدة 30 ثانية على سرعة عالية. إضافة 50 ميكرولتر إلى 450 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في لوحة 96 جيدا. كرر لجميع العينات / مكررات. استخدام pipettor الأقنية لتمييع عينات بشكل جماعي. خلط كل تخفيف الجديدة من قبل pipetting صعودا وهبوطا عشر مرات. تغيير نصائح بين التخفيفات. جعل التخفيفات يصل إلى 5.0 × 10 ^-6.
7. (اختياري) العزلات البكتيرية كانت أكثر وفرة من العزلات الفطرية في عينات الموصوفة هنا، وبالتالي إذا في وقت واحد عزل البكتيريا، ثم إجراء التخفيفات المتسلسلة يصل إلى 5 × 10 ^-8 في الخطوة 6.6 أعلاه.
8. موزعة بالتساوي 100 ميكرولتر من كل من 5.0 × 10 ^-3 من خلال 5.0 × 10 ^-6التخفيفات عبر السطح من أجار PDA داا ³⁰ لوحات مع لهب تعقيمها قضبان الزجاج عازمة. لوحات مخزن تستقيم لمدة 30 دقيقة للسماح السائل نقع في، ثم ختم لوحات مع parafilm لتجنب الهروب من جراثيم من العزلات مجهولة الهوية. احتضان لوحات مقلوب عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 5 أيام للسماح لكلا الفطريات سريعة وبطيئة النمو لتشكيل المستعمرات.

7. الاختيار المبدئي للفطريات البلاستيك المهينة

هام: يجب فتح جميع الثقافات من هذه النقطة إلى الأمام فقط في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (وليس تدفق الصفحي هود) لتجنب تلوث البيئة مع جراثيم من مجهولي الهوية. بعض الفطريات والبكتيريا في التربة هي مسببات الأمراض البشرية المحتملة.

1. فحص لوحات تخفيف تحتوي على مستعمرات معزولة بشكل جيد. اختر مستعمرة التي لم يتم لمس مستعمرة أخرى.
2. باستخدام مسواك العقيمة واحد، المس بلطف مستعمرة ومن ثم لمس آغار من FMM (صنع في الخطوة 2.3 )، FMM + البلاستيك (صنع في الخطوة 4)، وخرائط Google للجوال (صنع في الخطوة 2.3) لوحات، في هذا النظام. لتطعيم الخرز أغار على قمة الأفلام البلاستيكية، وفرك بلطف مسواك على السطح من نقطة أجار ثم مرر عبر فيلم من البلاستيك. تكرار التلقيح من نفس المصدر حتى مستعمرة هناك أربعة الشرائط تكرار في كل لوحة.
3. كرر الخطوات من خلال 7.1 7.2 حتى عدة نسخ متماثلة من كل نوع مستعمرة بصريا فريدة من نوعها ويتم اختيار عينة من كل BDM.
4. لوحات الختم مع parafilm، عكس، واحتضان عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 5 أيام.
5. تحديد العزلات التي تنمو على BDMs أفضل مما كانت تنمو على FMM. إذا كان النمو ليست واضحة، عرض عينة تحت مجهر تشريح للتحقق من الاستعمار أو عدم وجودها (الشكل 1). الحفاظ على الغطاء على، وإذا كان لديه غطاء التكثيف، مع استبدال غطاء جديد ولكن القيام بذلك في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
6. مرة واحدة ويتم اختيار degraders BDM المحتملة، كما استخدمterile مسواك لتتخلص من اللقاح من الفطريات استعمار البلاستيك نفسها، ومسحة لعزل واحد مستعمرة تشكيل وحدات على PDA ³⁰ لوحات شيلي.
7. لوحات الختم مع parafilm واحتضان PDA داا ³⁰ لوحات تلقيح مع العزلات البلاستيك المهينة عند 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام في الظلام.
8. والآن بعد أن المستعمرات المعزولة واحدة يتم تنقيته، وضمان أنها قادرة حقا لاستعمار الأفلام البلاستيكية التي يجري اختبارها. جمع اللقاح (الأبواغ، خلايا الخميرة، أو خيوط) من وحدة مستعمرة تشكيل واحد مع المسواك العقيمة. كرر الخطوات من 7.2 خلال 7.5. بعد 5 أيام من الحضانة عند 20 درجة مئوية، وفحص لوحات الأحيائي لنمو الفطريات. إذا كان عزل ينمو على فيلم BDM أفضل من أنها تنمو على FMM في كل من الأول (7.5) والثاني (7.8) المحاكمات، ثم تخزين عزل كما هو موضح أدناه في الخطوة 8.

8. التخزين على المدى الطويل Degraders بلاستيك

وعموما، سوف يتم اختبار العزلات البلاستيك المهينة في الأحيائي لوحة (7.5)، وإعادة تنقيته إلى وحدات مستعمرة تشكيل المعزولة واحد (7.6)، واختبارها في لوحة الأحيائي مرة أخرى (7.8)، وأخيرا، واختبارها في الأحيائي السائل ( 9،1-9،5). أثناء الاختبار، ينبغي نقل العزلات إلى وسائل الإعلام الجديدة كل شهر وألواح الأسهم العاملة تخزينها في 4 درجة مئوية في أقرب وقت نمو كاف مرئيا. أيضا يجب أن يتم تخزين العزلات كما أسهم الجلسرين في -80 ° C، و / أو الأبواغ المجففة على الأقراص تصفية العقيمة في 4 درجات مئوية. يتم وصف كل طرق تخزين أدناه.

1. لكل عزل التي نمت على فيلم BDM أفضل من نما على FMM في كل من الأول (7.5) والثاني (7.8) لوحة اختبارات بيولوجية، وإعداد اثنين PDA ³⁰ لوحات شيلي مع اثنين أو ثلاثة أقراص تعقيم رقة الترشيح، وحوالي 1 سم في القطر ، على السطح. تطعيم هذه اللوحات اثنين مننفس مستعمرة واحدة في اختيار الخطوة 7.8 أعلاه. جعل الحديقة عن طريق نشر اللقاح بشكل موحد على أجار لتحقيق أقصى قدر من النمو. ختم لوحات مع parafilm واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام. ويمكن البدء في هذه الخطوة بالتزامن مع الخطوة 7.8 من الكفاءة.
2. يجب تغطية القرص مرشح على سطح أجار مع أفطورة / جراثيم. إزالة الأقراص مرشح من سطح آغار مع ملقط معقم، ومكان في أنبوب إيبندورف العقيمة. الهواء الجاف الأقراص مرشح بين عشية وضحاها داخل إيبندورف أنابيب (مع قبالة كاب) في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية أو غيره الجافة، بيئة معقمة مع حركة الهواء الحد الأدنى لتجنب التلوث المتبادل. ثم ختم مع parafilm، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. استخدام مسحة القطن المعقم أو مسواك لحصاد الجراثيم وفطر من لوحات الحديقة. تعليق جراثيم وخيوط في الجلسرين 30٪ في cryovials، فلاش تجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

9. التعاون صرامةnfirmation من استخدام البلاستيك عبر الأحيائي السائل

1. تولد الجراثيم الطازجة و / أو الخلايا التي لتطعيم الثقافات السائل: تطعيم PDA ³⁰ لوحات شيلي مع جراثيم من المحتمل العزلات المهينة البلاستيك. ختم لوحات مع parafilm، واحتضان عند 20 درجة مئوية حتى الجراثيم الفطرية مرئية.
2. في خزانة السلامة الأحيائية، جراثيم الحصاد عن طريق غسل لوحة مع 0.01٪ تريتون X-100 (5 مل لكل 15 × 100 ملم بيتري لوحة يعمل بشكل جيد)، وتنقية الجراثيم (أو خلايا الخميرة) من على سطح الأرض مع العقيمة قضيب عازمة الزجاج . نضح بوغ (أو خلايا) التعليق ونقل في وعاء معقم.
3. عد الجراثيم أو الخلايا مع عدادة الكريات وتحديد حجم مناسب لإضافة إلى 5 مل من مرق FMM لما مجموعه 1 × 10 ⁶ جراثيم / أنبوب. يجب أن يكون حجم أقل من 10 ميكرولتر. التخفيف من تعليق بوغ المركزة في 0.01٪ تريتون قد يكون من الضروري X-100.
4. في غطاء نقل معقمة، تطعيم أنابيب ثقافة أعدت في الخطوة 5 مع 1 × 10 ⁶ جراثيم (أو خلايا الخميرة). ختم قبعات مع parafilm لتجنب أي محاولة للهرب من جراثيم، لا سيما بالنسبة العزلات مجهولة الهوية. احتضان في الظلام في 20 ° C ومراقبة عينات أسبوعية للنمو.
5. نمو فطر من الفطريات على الأفلام البلاستيكية قد تكون مرئية خلال الأسبوع الأول بعد التلقيح، وخاصة على حواف الأفلام البلاستيكية. للخميرة العوالق (كما يتضح من غائم وسائل الإعلام)، والنمو يمكن رصدها من قبل قراءات الكثافة البصرية في 600 نانومتر. لأن الفطريات من المرجح أن نعلق مباشرة إلى فيلم من البلاستيك، والنمو قد يتم تقييمها من قبل العين، ويمكن التأكد من المجهر الضوئي و / أو المجهر الإلكتروني (SEM).
6. في الضوابط FMM فقط، والبحث عن البقع البيضاء ضئيلة التي هي صغيرة جدا لتسجيل التغيير في الكثافة البصرية باستخدام أساليب الطيفي. يمكن أن يستنشق هذه البقع مع ماصة باستور، ولاحظ استخدام التدخل التفاضلية (DIC) المجهري. البقع غالبا ما تكون preci هويتهpitate، ولكن في بعض الحالات قد تكون كتل من قيحة الأصلي الذي قد نبتت ولكن لم نمت بشكل كبير.
7. استخدام الملاحظات البصرية والمجهرية للمقارنة بين الاستعمار من العينات التجريبية والضوابط، وتعيين الدرجات لنمو على كل عينة من الفيلم BDM. لأن العديد من BDMs مظلمة في اللون وتسمح الحد الأدنى من المراقبة عن طريق الفحص المجهري إلا عند الحواف، ويحظر سماكة الفيلم المراقبة تحت عدسة النفط الغمر، ووزارة شؤون المرأة مفيد لتقدير ط) وجود نمو الجراثيم، على سبيل المثال عن طريق نظام التصويت وصفها في الجدول 1، والثاني) على مدى تدهور BDM.

10. SEM تحضير العينة

1. استخدام نظيفة، مقص العقيمة لقطع قطعة صغيرة من BDM من عينات تكرار. إصلاح BDMs بغمر في 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 24-48 ساعة.
2. في حين التثبيت يحدث، يذوى نقية 100٪ من الإيثانول بإضافة 5-10٪ VOلوم 3 Å المنخل الجزيئي (تفعيلها في فرن تجفيف في 175-260 درجة مئوية وتبريده في مجفف)، والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لضمان مجموع الجفاف.
3. BDMs تزج في 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة أربعة يغسل من 15 دقيقة لكل منهما.
4. BDMs يغمر في الماء عالى النقاء لمدة ثلاث غسلات من 5 دقائق لكل منهما.
5. يذوى العينات BDM في سلسلة الإيثانول، تخبط لمدة 20 دقيقة في كل تركيز: 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، و 100٪. شطف BDMs مرتين أكثر في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة لكل شطف.
6. العينات تخضع لتجفيف نقطة حرجة وتفل الطلاء.

النتائج

في دراسة أجريت مؤخرا ^24، أربعة مكررات كل من ثلاثة BDMs المتاحة تجاريا المسمى "تحلل"، بالإضافة إلى الفيلم التجريبي والتحكم البلاستيك التقليدية، وضعت على التربة كما المهاد لإنتاج الطماطم في ربيع عام 2010 في ماونت فيرنون، WA، نوكسفيل، TN، ووبوك، تكساس. في خريف عام 2010، وقطعت الساحات فيلم BDM من نجا من نشارة في أربع قطع كل تكرار، وتمت إزالة التربة الأصلية من مباشرة تحت منطقة حيث تم رفعه العينة المهاد. كل نجا وتقع مربع BDM في التربة داخل كيس نايلون شبكة كما هو موضح في

المناقشة

وصف الإجراء يمثل هنا تقنية تمرير أول لعزل degraders BDM المحتملة من التربة، وكان يستخدم بنجاح لعزل الفطريات من BDMs مدفونة في التربة لمدة سبعة أشهر. نمت الفطريات عندما reinoculated على المواد BDM جديدة من نفس النوع، مشيرا إلى أن الفطريات المعزولة كانت في الواقع المستعمرين، وأن هذه الأفلام لم تكن المثبطة لنمو الفطريات. عزل الفطريات من البلاستيك المهينة والبكتيريا المحتمل أن تؤدي إلى استعمالها، بشكل فردي أو في مجموعات، لإدخال تعديلات على التربة أو السماد حيث يحتاج البلاستيك لتكون ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
سكر العنب البطاطا أجار	بيكتون ديكنسون	8X05491
أجار	فيشر	BP 1423-2
كلورامفينيكول	أكروس أورجانكس	200-287-4
علوم الفحص المجهري الجلوتارالديهايد	إلكتون	16216-10
المنخل الجزيئي	فيشر	M-8892
الإيثانول	فارمكو آبر	E200
Contrex	Decon Labs، Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
أملاح معدنية للمخازن المؤقتة والوسائط	فيشر	العديد	البائعين يبيعون هذه الكواشف