Method Article

تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات

DOI:

10.3791/50385

⸱

September 22nd, 2013

 ,  , 
1Department of Leukemia, MD Anderson Cancer Center, 2Wake Forest Baptist Medical Center, Institute for Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجماهير الأنسجة المعقدة، من الأجهزة للأورام، وتتكون من العناصر الخلوية المختلفة. نحن توضيح مساهمة الظواهر الخلوية داخل الأنسجة باستخدام المسمى متعدد الفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت في تركيبة مع multiparameter تلوين مناعي تليها unmixing الطيفية فك الأصل المحمولة، فضلا عن خصائص الخلايا استنادا البروتين التعبير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع الرغبة في فهم إسهامات العناصر الخلوية متعددة لتطوير الأنسجة المعقدة؛ مثل العديد من أنواع الخلايا التي تشارك في تجديد الأنسجة، وتشكيل الورم، أو تكون الأوعية، ونحن وضعت نموذجا زرع الخلوية متعددة الألوان التنمية الورم في والتي تنشأ من السكان الخلية المختلفة الملونة مراسل الفئران الجينات fluorescently ويتم زرع، أو حقن المغروسة في وحول وجود ورم النامية. ثم يتم تجنيد هذه الخلايا الملونة ودمجها في سدى الورم. من أجل إجراء تقييم كمي لنخاع العظام المستمدة خلايا انسجة الورم، ونحن زرع GFP معربا المعدلة وراثيا نخاع العظم كله في طلب تقديم العروض المشع قاتل معربا عن الفئران التي وافقت عليها IACUC. تم رفعه الأورام 0ovarian التي تم حقنها في الفئران orthotopically زرعها آخر 6-8 أسابيع engraftment وتحليلها لنخاع العظم علامة من أصل (GFP)، وكذلك الأجسام المضادة للكشف عن علامات الورم المرتبطةسدى باستخدام تقنيات التصوير متعدد الأطياف. نحن بعد ذلك تكييفها منهجية نسميه MIMicc-المتعددة الأطياف الاستجواب من تعدد التراكيب الخلوية، وذلك باستخدام unmixing متعددة الأطياف من fluoroprobes إجراء تقييم كمي والتي وصفت جاء خلية من السكان والتي تبدأ (على أساس تسميات الجين مراسل الأصلي)، وكما قدرتنا على unmix 4، 5 ، 6 أو أكثر لكل أطياف زيادات الشرائح، واضاف لدينا المناعية الإضافية المرتبطة الأنساب الخلية أو التمايز لزيادة الدقة. استخدام برامج للكشف عن إشارات المضاعفة الفلورسنت المترجمة المشترك، ويمكن إرجاع السكان انسجة الورم، وتتميز المذكورة على أساس علامة تلطيخ. 1

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم التنمية الأنسجة وإصلاح مهم لتوضيح المكونات الخلوية المشاركة في التئام الجروح، 2،3 الطب التجديدي، والبيولوجيا التطورية والبيولوجيا الورم. في ظل ظروف من إصلاح، والعديد من أنواع الخلايا التسلل المكروية المحيطة للمساعدة في الأوعية الدموية، ترسب ECM، وانتشار وإعادة هيكلة الأنسجة. ويمكن تحديد العوامل الخلوية والظواهر على أساس multiparameter، علامات المضاعفة التي يمكن أن تحدد توطين، وحالة التمايز والتفاعل بين المكونات الخلوية داخل المكروية التحقيق. هنا، نحن تصف تطور الورم كمثال تنميط لهذا النموذج زرع متعدد الألوان المتعددة الخلايا تليها التصوير متعدد الأطياف ومنهجية unmixing الطيفية.

ورم تطور هو عملية متعددة الخطوات التي تم وضع علامة من قبل العديد من القدرات المكتسبة التي تشمل تعزيز الانتشار، وntiapoptotic، الغازية وعائية الخصائص. مما يسهل 4 التنمية الورم عن طريق الخلايا غير الورمية التي يتم تجنيدهم في بيئة المحيطة بها لتوفير عوامل النمو، المصفوفات الهيكلية، وشبكات الأوعية الدموية والتعديل المناعي. يتكون 1،5،6 هذا موئل دقيق من الخلايا المشتقة من والأنسجة المحلية المجاورة مثل الدهنية، والأوعية الدموية ومصادر بعيدة مثل نخاع العظم الخلايا المشتقة 1. مدى دمج الخلايا غير الورمية يعتمد على الطلب من الورم، والتي تتطابق في كثير من الأحيان مع المرحلة / الصف من الورم. لفهم دور الورم المكروية داعمة، لا بد من فهم منشأ وإمكانية التفريق بين السكان الخلية غير الورمية.

وقد تم تصميم هذا البروتوكول للمساعدة في تفسير تطور الورم من خلال التصور كل من نخاع العظام المكونات الخلوية المشتقة، والاوعية الأنسجة المحليةإد الخلايا. استخدام الفلورسنت، معربا عن الجين مراسل الفئران المعدلة وراثيا، ونحن زرع نخاع GFP (الخضراء بروتين فلوري) العظام في طلب تقديم العروض المشع القاتلة (بروتين أحمر فلوري) الماوس. بعد نجاح نخاع العظم engraftment، يتم حقن الورم خط الخلية مسانج orthotopically وسمح لتدبر لمدة 4-8 أسابيع. يتم رفعه الورم الناتج عن الماوس ومعالجتها لمناعي (IF) تلطيخ لتصور مكونات اللحمية. مضاعفة IF علامات هي تقنية شائعة الاستخدام التي ينطوي كبيرة الأمثل 7-9، ومع ذلك باستخدام منصة التصوير / unmixing متعددة الأطياف يحسن القدرة على تركيبات علامة فلوري التي تمتلك التداخل الطيفي. هنا نقدم تقنية نسميه الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد في وصمة عار وتحليل ما يصل إلى ثمانية علامات داخل قسم الورم على شريحة واحدة من أجل تحليل أصول الخلوية، وتمايز الخلايا الحادي وآتوس والتفاعلات خلية خلية من المكونات داخل المكروية الورم. هذا مثال مبسط لديه القدرة على أن توسع عليها في أجل تحليل خمسة، ستة، أو أكثر علامات استخدام الأجسام المضادة أو الخلايا يحركها المروج التعبير الفلورسنت. الجدول 1 قوائم الفلورسنت تركيبات تلوين الأجسام المضادة المحتملة مع الأنواع المناسبة تؤخذ بعين الاعتبار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسانج الفئران زرع النخاع (BMT) كما أقرتها المؤسسية بروتوكولات IACUC (ملاحظة: النجاح من هذا البروتوكول يتطلب استخدام أي نوع من الخلايا المسمى (ق) كهدف للتحليل المتعدد الأطياف، وتسهيل تحليل المصب، يمكن للمرء أن يستغل أي الوراثية أو وضع العلامات الخلوية مستقرة. ونقترح أن أي خلية، الأنسجة، أو يمكن تطبيق الجهاز ليكون نموذجا لزرع ويمكن أن تحتوي على زرع العديد من السكان وصفت بأنها فريدة من نوعها يراها البحوث المفيدة. بالإضافة إلى ذلك، متعددة المسمى الأنظمة الخلوية ، مثل تلك التي وجدت في الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على نسب متعددة مقيد fluorescently المسمى يمكن أن تكون مصممة السكان للقضاء على مضاعفات زرع لدراسة بعض الحالات المرضية.

  1. قاتل أشرق الفئران المتلقية BMT مع جرعة واحدة من 9.5 غراي أربع ساعات قبل إعادة نخاع العظام مع الجهات المانحة. (يجب أن يكون متلقي BMT GFP 6-10 أسابيع من العمر).
  2. تبلل قذف الفأر مع الايثانول 70٪ قبل لقطة وتقشير مرة أخرى لفضح الأطراف الخلفية مع مقص جراحي معقم. إزالة الساق بأكملها بما في ذلك قمة الحرقفي في المفصل العجزي الحرقفي. تجاهل القدم عن طريق قطع فقط فوق الكاحل ومن ثم إزالة شاملة في جميع العضلات والأربطة والأنسجة الزائدة من العظام. نخاع دافق من الساق، fibia وعرف الحرقفة مع إبرة 23 G باستخدام العقيمة FBS 2٪ في برنامج تلفزيوني (PBS-2). (يجب التضحية المانحين RFP BMT وفقا للمعايير المؤسسية.)
  3. شريحة وبلطف سحق العظام المتبقية إلى أجزاء باستخدام مشرط وملقط ثم وضع في أنبوب 50 مل المخروطية مع 3 ميكروغرام / مل كولاجيناز أنا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 300 دورة في الدقيقة.
  4. أعلى قبالة الأنبوب مع برنامج تلفزيوني-2 وجمع طاف في أنبوب جديد وتتحد مع خلايا مسح. تدور باستمرار في 250rpm لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني-2 وتصفية من خلال 40 نانومتر تصفية الخلية. عند هذه النقطة، فإن الخلايا يمكن أن توصف لfluorescenر تنشيط الخلايا الفرز (FACS) إذا كان أحد يريد التعامل مع فئات معينة من السكان لBMT.
  6. في resuspend 2 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر PBS، في الماوس. استخدام 29 G إبرة لحقن النظامية في الفئران GFP المتلقي المشع من قبل الذيل أو الرجعية المدارية الوريد-شطبة جانب المتابعة. حقن فأرة واحدة مع 100 ميكرولتر PBS فقط عن التحكم engraftment. استخدام مصباح الحرارة إلى تمدد الأوعية قبل الحقن واستخدام حقن الوريد الذيل ضبط النفس عند الحقن. لديك شاش معقم المتاحة لتطبيق الضغط الخفيف إلى حقن آخر الذيل.
  7. ثلاثة أسابيع بعد BMT، وجمع الدم الرجعية orbitally وتحليل التدفق الخلوي لتأكيد وجود خلايا GFP تعميم وعدم وجود خلايا RFP المنتشرة. سيكون قد مات الماوس التحكم عند هذه النقطة.

2. الورم Engraftment وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المؤسسية

  1. تنمو الخلايا السرطانية ID8 الفئران المبيض في المختبر قبل حقن في الجسم الحي (1 × 10 6 جأذرع في الماوس). يوم من الحقن، ويعرض للتريبسين الخلايا، ويغسل مع برنامج تلفزيوني و resuspend في برنامج تلفزيوني في 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر.
  2. حقن الخلايا السرطانية في تجويف intaperitoneal من الفأرة، وينبغي أن تكون إبرة الجانب شطبة المتابعة. تعقيم الحقن الأفق مع الايثانول 70٪. تحقن أسفل اليسار أو الربع السفلي الأيمن من البطن (الجمجمة وسطي قليلا إلى مجموعة أقل شأنا من الحلمات البطن من الماوس الإناث)، وتجنب ضرب الأجهزة. كبح الماوس عن طريق الاستيلاء من القفا وعقد الذيل مع الخنصر أو البنصر. يمكن تخدير الفئران مع isoflurane وعن هذا الإجراء.
  3. التضحية الفئران عندما علامات الورم engraftment، مثل الانتفاخ في البطن طفيف، واضحة. وهذا يحدث أكثر من 4-12 أسابيع.
  4. الأورام المكوس من تجويف IP. سوف الأورام داخل تجويف تبدو وكأنها عقيدات بيضاء على السطح وحول الأجهزة. مع مشرط، وإزالة الأورام ووضع في أنبوب / جرة من 10٪ من الفورمالين لمدة 24 ساعة التثبيت. ع النسيجيةالتعويض يمكن أن يكون مصدرها التدريجي لعلم الأمراض / علم الأنسجة الأساسية إذا الكواشف والمواد ليست متاحة بسهولة لتضمين البارافين وإعداد الشرائح. قسم الأنسجة إلى 5-8 ميكرون شرائح على الشرائح الزجاجية لتلطيخ الاجراءات اللاحقة.

3. متعدد المعلمة مناعي تلطيخ

  1. إعداد الشرائح تحكم لون واحد لكل التحقيق الفلورسنت المستخدمة في التجربة. في هذا السيناريو، يتم استخدام أربعة ألوان. وبالتالي، أربعة شرائح لكل لون الفردية وكذلك شريحة واحدة للسيطرة على الضوضاء في الخلفية، وأخيرا شريحة واحدة لمزيج تلطيخ الكامل. (عدد الشرائح = 6) وسيتم تجهيز جميع الشرائح جنبا إلى جنب بطريقة مماثلة للحد من التباين التجريبية.
  2. خبز أقسام البارافين عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تغسل شرائح 3x أخرى 10 دقيقة في الزيلين.
  4. غسل 2X 5 دقائق الإيثانول بنسبة 100٪.
  5. يغسل 1X 3 دقيقة 95٪ من الإيثانول
  6. يغسل 1X 2 min90٪ من الإيثانول.
  7. يغسل 1X 2 min70٪ من الإيثانول.
    8. غسل 1X 2 دقيقة في الماء. تزج ببطء رف تلطيخ ويخرجون من 10X المياه.
  8. خلال سلسلة غسل الماضي، قبل الغليان العازلة سيترات الصوديوم لمدة 2 دقيقة (الميكروويف على ارتفاع). (يمكن استبدال مع العازلة تريس، EDTA اعتمادا على الأجسام المضادة في الاستخدام)
  9. تغلي الشرائح لمدة 20 دقيقة في سترات الصوديوم العازلة (الميكروويف على السلطة 10٪ أو في طنجرة الضغط). إذا الدمامل العازلة، إيقاف الميكروويف وترك الجلوس.
  10. إزالة من مصدر الحرارة، والسماح للبقية الشرائح لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت سترات الصوديوم حتى يبرد.
  11. شطف الشرائح في الماء لمدة 5 دقائق.
  12. علامة حول أقسام الورم مع الرحم القلم ووضع 2٪ BSA / 1٪ FBS حمض الماليك عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة. إعداد الشرائح بشكل فردي حتى لا نسمح لهم تجف خلال هذه الخطوة.
  13. إعداد الأجسام المضادة الأولية في التخفيف الأمثل في عرقلة العازلة. (إذا كانت الأجسام المضادة في استخدام كل من الأنواع المختلفة (أو مفتش سلسلة الاختلاف السابقين: IgG1 IgG2a مقابل من نفس النوع) أنها يمكن أن تستخدم في تركيبة أثناء كمافترة الحضانة إنجل. إذا أنواع الأجسام المضادة تتداخل، ثم يجب أن يتم حضانات بها بالتتابع للحد من الأجسام المضادة عبر التفاعل.)
  14. عند هذه النقطة، وترك شريحتين مع عازلة تمنع فقط. وهذه الشرائح اثنين بمثابة السيطرة غير ملوثين والسيطرة وصمة عار النووية. سيتم المحتضنة الضوابط لون واحد مع غيرها من الأجسام المضادة الأولية الفردية. وليس هذا فقط الشريحة تحليل لديها مزيج من الأجسام المضادة الأولية.
  15. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية في مربع غرفة الرطوبة على شاكر الدورية بطيئة في 4 درجة بين عشية وضحاها (~ 16-20 ساعة) (ملاحظة: عند العمل مع 4 + fluorophores، وتلطيخ متتابعة أو الاقتران المباشر قد يكون ضروريا للحد من الأجسام المضادة عبر التفاعل . وفي ظل هذه الظروف كرر الخطوات 1،16-1،21 حتى يتم تطبيق كافة الأجسام المضادة على الشرائح.)
  16. تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في PBST (2X) بلطف على شاكر
  17. في حين يجري غسل، وإعداد Alexafluor 488، 594 647 والأجسام المضادة الثانوية لتخفيف النهائيمن 1:1،000 في عرقلة العازلة. (تأكد من يتم الاحتفاظ هذه الأجسام المضادة والتخفيفات في 4 درجات مئوية في الظلام وفي جميع الأوقات للحفاظ على مضان عبر دفعات، وعلى مر الزمن.)
  18. على الشرائح سيطرة لون واحد، ومكان واحد التخفيفات Alexafluor مطابقة الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. سيتم وضع جميع الأجسام المضادة الثانوية على الشريحة التحليل. ستبقى الشرائح السيطرة غير ملوثين والنووية ملطخة عرقلة العازلة طوال هذه الخطوة.
  19. احتضان في مربع غرفة الرطوبة (مغطاة بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء) على بطء شاكر الدورية على RT لمدة 2 ساعة.
  20. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في PBST (2X) بلطف على شاكر. تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
  21. إضافة دابي (1:10،000) لمدة 1 دقيقة إلى الشريحة-دابي فقط والشريحة التحليل. تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. قد يكون غادر الشرائح الأخرى المشمولة في حاويات غسيل.
  22. غسل اثنين دابي المحتضنة-الشرائح في وعاء منفصل لأول 5 دقائق يغسل حتى لا تلوث الشرائح الأخرى مع دابي وصمة عار. للمرة الثانية 5 دقائق يغسل، ويمكن الجمع بين الشرائح في PBST (ينبغي إجراء جميع يغسل على شاكر). تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
  23. الشرائح لفترة وجيزة وتراجع في الماء قبل (1.5 سمك مع وسائل الاعلام تصاعد المائية للحفاظ على مضان) للانزلاق الغطاء
  24. اسمحوا الجافة ساعة 3 في الظلام في RT.
  25. ختم حواف الغطاء زلة مع مقوي للاظافر. (لا تستخدم طلاء الأظافر مثل الأسيتون يشفي إشارة الفلورسنت).
  26. تحليل الشرائح مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية لتحليل المستقبل.

4. التصوير المتعدد الأطياف

  1. جمع صور متعددة الأطياف باستخدام كاميرا فارق بسيط EX (التي تحتوي على الكريستال السائل تصفية الانضباطي) على أوليمبوس X-63 المجهر تستقيم مع فارق بسيط برنامج لجمع البيانات.
  2. جمع الصور باستخدام هدفا النفط لزيادة دقة.
  3. أن مبادرةوتشمل مجموعة المتابعة ل تعيين النطاق الطيفي لكل fluorophore في الاستخدام.
    1. لمدة 4 اللون:
      1. دابي: 420-480nm
      2. AF488: 490-580m الطوق
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
  4. تأخذ صورة من الشريحة الأولي تحليل للحصول على أضعاف التعرض المناسب لكل من نطاقات طيفية.
  5. إنشاء "مكتبة الطيفية" أن البرنامج سوف تستخدم لتحديد وفصل نسبة الإشارة إلى الضوضاء من fluorophores من بعضها البعض، وإشارة الخلفية. (ملاحظة: يجب أن يكون لكل واحد تألقي الخاصة الشريحة تحكم لونه من أجل تجميع مكتبة الطيفية مع منحنيات الطول الموجي المناسب لضمان تحليل سليم من مجموعة البيانات على سبيل المثال: 3 fluorophores = 4 شرائح السيطرة؛ fluorophores 5 = 6 شرائح مراقبة).
    1. صورة الشريحة الأولى غير ملوثين. وسيتم تعيين هذه الشريحة داخل المكتبه الطيفيةذ كخلفية.>
    2. صورة الشريحة دابي فقط الثاني. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين نوى دابي الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما دابي>.
    3. صورة AF488 فقط الشريحة الثالثة. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF488 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF488>.
    4. صورة الشريحة AF594 فقط الرابع. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF594 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF594>.
    5. صورة الشريحة AF647 فقط الخامسة. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF647 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF647>.
    6. بعد جمع كل مكون الطيفي الفردية،حفظ المكتبة الطيفية والبروتوكول.>
  6. مرة واحدة في المكتبة الطيفية كاملة، تجد مناطق الفائدة على الشريحة على المجهر تحليل وجمع / حفظ الصور>

5. التحليل الكمي للصور المتعددة الأطياف

  1. استيراد تشكيلة ممثل الصور نيوانس الحصول عليها باستخدام برمجيات إعلام.
  2. فتح مكتبة الطيفية حفظها وفقا لتوجيهات من قبل البرنامج
  3. تحديد مناطق الأنسجة من الاهتمام ليتم تحليلها. (مثل ورم الأنسجة مقابل الأنسجة الدهنية).
  4. تحديد الخلايا الفردية على أساس دابي وصمة عار. وسيتم تحديد السيتوبلازم تلقائيا استنادا إلى شكل النواة.
  5. اختيار كثافة الفلورية للقراءة من خيار لكل معلمة الفلورسنت (على سبيل المثال يعني، الانحراف المعياري)
  6. دفعة من الحصول على الصور، والسماح للعملية البرمجيات باستخدام خوارزمية المقترحة.
  7. عند الانتهاء من معالجة الصور، دمجالملفات نتيجة.
  8. فتح النتائج في Excel (أو أي مجموعة من البرامج التحليلية الأخرى) ورسم اثنين من شدة الفلورسنت ضد بعضها البعض على محور XY. يتم إعطاء كل شدة الفلورسنت لكل خلية. سوف تظهر الخلايا إيجابية مزدوجة في الربع العلوي الأيمن. يجب تعريف المستخدم شدة الفلورسنت خط الأساس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام تقنية التصوير متعدد الأطياف لتحليل الأورام المغروسة في نموذج الفأر وراثيا لدينا BMT، ونحن قادرون على تمييز مكونات الورم اللحمية التي هي من نخاع العظام المنشأ. تم تأكيد BMT الأولية ثلاثة أسابيع بعد الزرع بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 1). حقن Orthotopically أورام المبيض غير المسماة التالية تم رفعه BMT تأكيد engraftment والفورمالين الثابتة 6 أسابيع بعد الحقن الورم الأولي. تم مقطوع البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الورم في <8 ميكرون شرائح والملون. وأدلى واحد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا وصفنا تطبيق التصوير متعدد الأطياف وصفنا كما الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد، لتحليل نخاع العظام المستمدة من مكونات انسجة المكروية الورم، ولكن هذه المنهجية ومفهوم يمكن تطبيقها على فك رموز العناصر الخلوية الأخرى التي يتكون مجمع الأنسجة مثل تلك التي ظهرت أثناء التئام الجروح ردود الفعل أو أثناء الأنسجة التجدد. في هذه التجارب نستخدم الفئران المعدلة وراثيا للتمييز fluorescently نخاع العظم الخلايا المشتقة من الخلايا المشتقة المضيف ضمن المكروية الورم المغروسة،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FCM، CMB، وليس لديهم ELS الصراعات ولا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون للمناقشات والتوجيه والدعم من الدكاترة. مايكل Andreeff دكتوراه في الطب، دكتوراه، وجاريد بوركس الدكتوراه. من MD اندرسون التدفق الخلوي والخلوية التصوير مرفق الأساسية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (RC1-CA146381، CA-083639، R01NS06994، وCA116199 CA109451 لFCM. معتمد ELS أيضا من قبل وزارة الدفاع الجيش (BC083397).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials


: < / strong>

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
.2 & م فلترفيشر09-740-35 أمبير
10 مل قفل إغراء BD309604
25 جرام إبرةكاردينالBF305122
40 نانومترفلتر BD352340
50 مل أنبوب مخروطيفيشر1495949A
Alexafluor 488-ms1invitrogenA21121
Alexafluor 594-RbinvitrogenA21207
Alexafluor 647-chInvitrogenA21449
BSASigmaA7906-500G
زلات غطاءCorning2940-243
CRI-NuanceCaliper Life Sciences
DapiInvitrogenD1306
DMEMCellGro10-017-CV
الإيثانولدارماكون4004-DV
FBSinvitrogen16000-044
GFP-ms1Abcamab38689
إبرة الأنسولينBD329424
حمض الماليكAcros100-16-7
صندوق غرفة الرطوبةدائم الخضرة240-9020-Z10
وسائل الإعلام المتصاعدةداكوS3023
مقوي الأظافرسالي هانسن2103
قلم عنقAbcamAb2601
القلم / البكتيريا L Glutinvitrogen10378016
Steril PBSinvitrogen14040-182
Trypsininvitrogen252000-56
<قوي> حجب العازلة <جدول fo:keep-together.within-page="دائما" الحدود ="1">
maleic acid14.51 g < / td> < / tr>
NaCl10.95 g< / td> < tr>
(إلى 7.5pH) < / td > < td > 9 + g < / td > < tr >
الرحم < td > الماء المقطر < / td > < td > 250 مل < / td > < / tr > < / tbody > < / table > * أضف 0.2٪ Tween-20 إلى 1x محلول لمنع المخزن المؤقت مع 2٪ BSA / 2٪ FBS. حرك وتصفية المخازن المؤقتة لاسترجاع المستضدات < td > Tris Base < / td > < td > 1.21 جم < / td > < / tr > < td > EDTA < / td > < td >0.37 جم < / td > < / tr > < td > الماء المقطر < td > < td > 1000 مل (100 مل لصنع 10x ، 50 مل لعمل 20x) < / TD > < / tr > < td > Tween 20 < / td > < td > 0.5 مل < / td > < / tr > < / tbody > < / طاولة > * تخزينها في RT لمدة 3 أشهر أو في 4 درجات ؛ C لأطول <جدول fo: keep-together.within-page = "دائما" border = "1" > < td > ثلاثي سترات الصوديوم (ثنائي هيدرات) < / td > < td > 2.94 جم < / td > < / tr >
Tris-EDTA Buffer
(10 ملي متر قاعدة تريس ، محلول EDTA 1 ملي مولار ، 0.05٪ توين 20 ، الرقم الهيدروجيني 9.0) < / td > < / tr >
Sodium Citrate Buffer
(10 ملي متر سترات الصوديوم ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 6.0) < / td > < / tr >
الماء المقطر< / td > 1000 مل < / td > < / tr >
HCl (اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.0) < / td > < td > 1N < / td > < / tr >
Tween 20 < / td > < td > 0.5 مل < / td > < / tr > < / tbody > < / table>

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563(2012).
  2. Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
  3. Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
  4. Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992(2009).
  5. Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
  6. Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
  7. Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
  8. van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
  9. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13(2008).
  10. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  11. Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral ImagingFluorescent Tissue TransplantBone Marrow TransplantTumor Stroma AnalysisSpectral Library CreationImmunofluorescent Antibody StainingFlow Cytometry AnalysisTissue Section PreparationMultiplex Fluorescent DetectionCellular Composition Analysis

Related Articles