يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطبيق على

10.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50390

⸱

مايو 31, 2013

 ,  , 
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS) يلعب دورا حاسما في مكافحة الإجهاد الجرثومي. تتناول هذه المقالة تنقية E. القولونية DPS وبروتوكول ل في المختبر مقايسة يتظاهرون حماية DPS بوساطة من الحمض النووي من التدهور عن طريق أنواع الاكسجين التفاعلية.

الملخص

الاكسدة هو نتيجة ثانوية لا مفر منه للحياة الهوائية. الأكسجين الجزيئي أمر ضروري لعملية التمثيل الغذائي للأرض، لكنه يأخذ أيضا في العديد من التفاعلات الضارة داخل الكائنات الحية. مزيج من الأيض الهوائي والحديد، وهو مركب حيوي آخر للحياة، ويكفي لإنتاج الجذور من خلال فنتون الكيمياء والحط من المكونات الخلوية. تدهور الحمض النووي يمكن القول إن عملية الأكثر إضرارا التي تنطوي على المتطرفين داخل الخلايا، كما إصلاح الحمض النووي لا يزال بعيدا عن تافهة. الفحص الواردة في هذه المادة تتيح تقنية الكمية لقياس وتصور تأثير الجزيئات والإنزيمات على الحمض النووي من التلف الراديكالي بوساطة.

فحص الحمض النووي الحماية هو أداة بسيطة وسريعة وقوية لتوصيف المختبر في من خصائص وقائية من البروتينات أو المواد الكيميائية. أنه ينطوي على تعريض DNA إلى رد فعل الأكسدة الضارة وإضافة تركيزات مختلفة من مجمع الفائدة. ثم هو تصور خفض أو زيادة الحمض النووي من التلف بوصفها وظيفة من تركيز مركب باستخدام الكهربائي للهلام. في هذه المقالة ونحن لشرح تقنية للمقايسة حماية الحمض النووي عن طريق قياس خصائص وقائية من البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). DPS هو مصغرة الفيريتين التي يتم استخدامها من قبل أكثر من 300 الأنواع البكتيرية لمكافحة بقوة الضغوطات البيئية. هنا نقدم بروتوكول تنقية DPS وشروط الفحص الأمثل لتقييم حماية الحمض النووي من قبل DPS.

المقدمة

يجب الكائنات الهوائية يتعامل باستمرار مع أنواع الاكسجين التفاعلية التي يمكن أن تضر الحمض النووي الخاصة بهم فضلا عن غيرها من الجزيئات البيولوجية حاسمة. واحدة أداة فعالة لمواجهة الآثار السامة من الضرر التأكسدي هو البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). منذ اكتشافه في عام 1992 من E. المتعطشة القولونية الثقافة 1، وقد تم تحديد DPS في أكثر من 300 نوع من البكتيريا والعتائق 2. upregulation هائلة من DPS خلال مرحلة ثابتة يجعل من الاكثر أعرب عالية البروتين نوواني المصاحب من E. القولونية في ظل ظروف المجاعة 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين DPS للحفاظ على حد سواء الجدوى البكتيرية وسلامة الحمض النووي خلال العديد من الضغوط المختلفة، بما في ذلك الموت جوعا، وتركيز عالية من الحديد، التعرض للضوء الأشعة فوق البنفسجية، الصدمة الحرارية، والإجهاد التأكسدي 5، 6.

هيكليا، DPS-الزميلة النفس إلى مستقر معقد هومو بلازميدة قليلة القسيمات من 12 مونومرات، ثhich التجمع في قذيفة جوفاء كروية. التجويف الداخلي على نطاق نانومتر ~ 4.5 يمكن الوصول إلى الخارج المذيبات عبر المسام التي تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة 7، وأنه يمكن عزل المعادن المعدنية مثل الحديد 8. تأثير وقائي من DPS مستمد من عدة أنشطتها والكيمياء الحيوية، والتي تشمل الحمض النووي غير محددة ملزمة 1، النشاط ferroxidase، وتخزين الحديد 8.

دراسة مفصلة عن الأنشطة البيوكيميائية المفيدة للDPS يتطلب أولا تنقية لها. DPS تنقية هو إجراء تفصيلا، كما يجب فصل DPS ليس فقط من البروتينات الأخرى، ولكن أيضا من أي الحمض النووي ملزمة 7. يستخدم لدينا عملية تنقية الأمثل العديد من التقنيات الشائعة، التي تتألف من عمودين التبادل الأيوني وكبريتات الأمونيوم خطوة هطول الأمطار. وهناك حاجة إلى العديد من التبادلات العازلة، كما DPS تتركز بشكل كبير يمكن أن تترسب من المحلول في ظروف قليل الملح. مرة واحدة وقد تم تنقية البروتين DPS، قد يتم تطبيقه على المقايسات التي تقيس مباشرة نشاطها ferroxidase 8، رياضيات الكيمياء الحمض النووي ملزم 9، وآليات ملزمة الحديد 10. لديه DPS تنقيته أيضا التطبيقات المحتملة الأخرى. تم استخدام هيكل كروي مجوف مستقرة من DPS كما السقالات لتخزين جزيئات مسعور داخل تجويف بروتين 11 وحتى غرفة رد فعل لتجميع الجسيمات النانوية المغناطيسية رواية 12.

القدرة واقية من DPS للتوسط الأضرار الناجمة عن أنواع الاكسجين التفاعلية يمكن أن تكون بشكل واضح وأظهر مباشرة باستخدام مقايسة حماية الحمض النووي 13 و 14. في هذا الإجراء في المختبر، ويتم إنتاج الأنواع جذري عندما يحفز الحديد H 2 O 2 من التدهور عن طريق فنتون الكيمياء. هذه الجذور تلف الحمض النووي الحالي مباشرة في رد الفعل ويمكن أن تتحلل تماما في تركيزات عالية. نشاطين DPS مفتاح قد كلا مواجهة مباشرة آثار Fentإنتاج الجذور على بوساطة. DPS يقلل من تركيز الحديد حافز عن طريق تمعدن، وتستهلك وبيروكسيد الهيدروجين المتوفرة في هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، قد DPS ملزمة لالحمض النووي يحتمل أن تكون حمايته جسديا من ضرر الجذور ويتكثف قبل أن تتحول إلى حجم أصغر مع مساحة أقل على رد الفعل. الجمع بين هاتين الخاصيتين يجعل فحص DNA حماية مناسبة تماما لغرض قياس النشاط DPS واقية.

مقايسة حماية الحمض النووي هي متعددة جدا، ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات خارج DPS التوصيف. الضرر الراديكالية هو شكل شائع من التوتر في الخلايا، وتستخدم العديد من البروتينات والمواد الكيميائية المختلفة لمواجهة ذلك. المبدأ العام للمقايسة، وذلك باستخدام الحمض النووي سلامة كعلامة للضرر الجذور، ويمكن استخدامها في تركيبة مع أي تقريبا رد فعل المنتجة للراديكالية أو مواجهة وكيل. من بين أمور أخرى، وقد استخدمت بنجاح الفحص لتحديد خصائص مضادة للأكسدةمن K. استخراج بانيكولاتا للاستخدام في الصناعات الغذائية 15، لوصف آثار حمض اليوريك على الهيدروكسيل الضرر الوساطة 16، واكتساب رؤى جديدة في وظيفة الفراء النسخي البروتينات منظم 17.

وعلى الرغم من الاستخدامات العديدة للمقايسة في الأبحاث المنشورة، وجدنا أن هناك حاجة إلى الكثير من التحسين والخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، الأمر الذي يجعل إعداد مقايسة لأول مرة عملية شاقة بلا داع لكثير من الباحثين. بروتوكول نقدم في هذه المقالة تهدف إلى إزالة هذا الحاجز للدخول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. DPS التعبير وتنقية

الحصول على بروتين عالية النقاء هو خطوة أولى أساسية لفحص الحمض النووي الحماية. تنقية DPS البروتين يمكن أن يؤديها في 4-5 أيام.

  1. تحويل سلالة البروتيني التي تعاني من نقص من E. القولونية (مثل BL21 (DE3) pLysS) مع ناقلات الحيوانات الأليفة (مثل pET17) إلى التي تم استنساخ DPS تسلسل البروتين الترميز.
  2. الإنتصارات وتحولت الخلايا خارجا على مرق لوريا (LB) لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (مثل الأمبيسلين والكلورامفينيكول لالأمثلة المقدمة في 1.1). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة إلى 30 مل من المتوسط ​​LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200-250 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 2 × 1 L المتوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 10 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، في حين تهتز، إلى OD 600 ما يقرب من 0.6. (زراعة الخلايا لأعلى OD زيادة الغلة البروتين، دون المساس بشكل ملحوظ على نقاء المنتج النهائي.) لحث على التعبير من DPS بإضافة IPTG إلى تركيز من 0.3 ملم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة في حين تهتز.
  5. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة. Resuspend وكريات خلية في 7.5 مل من العازلة DEAE A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA) لكل لتر من زراعة الخلايا المستحثة. قد يتم تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. ويمكن عندئذ أن استمر الإجراء من قبل ذوبان العينات في حمام الماء عند 4 درجات مئوية.
  6. إضافة خليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (مثل Calbiochem مجموعة III مثبطات الأنزيم البروتيني، في 0.167 ميكرولتر لكل مل من تعليق خلية) إلى تعليق خلية لمنع تدهور DPS بإفراط (overexpressed).
  7. إعداد مستخلص خالية من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية. رئيس الصحافة الفرنسية مع 20 مل DEAE العازلة A (إذا باستخدام نموذج التدفق المستمر)، ثم disrupر العينة مرتين في 20 kpsi. أجهزة الطرد المركزي في المحللة في 30،000 x ج لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية لتوضيح جزيئات غير قابلة للذوبان، وحفظ طاف. قد ثم يتم تجميد طاف باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك.
  8. تتوازن 30 مل DEAE سيفاروز العمود CL-6B مع DEAE العازلة A، باستخدام FPLC. تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1-2 مل / دقيقة مع أقصى قدر من الضغط من 0.2 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل استخراج خالية من الخلايا على العمود، والبدء في جمع من خلال تدفق مرة واحدة تبدأ OD 280 إشارة إلى زيادة فوق خط الأساس. غسل العمود مع DEAE الاحتياطي A حتى يعود OD 280 القيمة إلى خط الأساس، في حين جمع مستمر التدفق من خلال. من خلال تدفق يجب أن يحتوي على غالبية البروتين DPS، وخالية من الحمض النووي ملزمة. غسل العمود مع 100٪ الواق B (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 1 M كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). هذا شطافة يحتوي المجمعات DPS-DNA وكذلك البروتينات الأخرى، ويمكن التخلص منها.
  9. إزالة الإعلاناتditional تلويث البروتينات من خلال الأمونيوم هطول كبريتات. تحديد حجم المجمعة خلال تدفق. ببطء (على مدى فترة من 10-20 دقيقة) إضافة الجافة سلفات الأمونيوم صغيرة من الحبوب إلى التشبع 62٪ (390 ملغ لكل مل من محلول) في 4 درجات مئوية مع التحريك جيدا. يقلب الخليط لمدة 20-30 دقيقة إضافية بعد إضافة الجزء الأخير من كبريتات الأمونيوم لضمان موازنة كاملة. ستبقى DPS القابلة للذوبان، بينما البروتينات تلويث سوف تترسب من المحلول.
  10. إزالة البروتينات المترسبة بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف.
  11. ببطء إضافة 227 ملغ كبريتات الأمونيوم إضافية لكل مل من طاف لتصل إلى 94٪ التشبع ويحرك المزيج لمدة 20-30 دقيقة لضمان موازنة كاملة. DPS يترسب في هذا تركيز الملح عالية، ويمكن جمعها بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف يكون في DPS بيليه، ويمكن أن يتم تجاهل طاف. يمكن تخزين بيليه في -80 ° C إذا قصرIRED.
  12. resuspend الكرية التي تحتوي على DPS في إعادة تعليق العازلة (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). ضبط حجم العينة إلى 2.5 مل.
  13. تبادل العازلة لإزالة كبريتات الأمونيوم باستخدام عمود الترشيح PD-10 هلام. تتوازن السرير هلام مع 25 مل العازلة إعادة تعليق. تطبيق مل 2.5 من عينة DPS إلى الجزء العلوي من العمود PD-10 والسماح لها نقع فيها تجاهل التدفق من خلال. جمع DPS بواسطة يبلغ حجمه مع 3.5 مل العازلة إعادة تعليق.
  14. أجهزة الطرد المركزي المخزن المؤقت تبادل عينة في 16،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مكونات غير قابلة للذوبان، وتمييع مع 6-10 مل العازلة تخفيف (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 0.1 ملي EDTA) لضمان أن تركيز الملح منخفضة بما فيه الكفاية لDPS لربط العمود سيفاروز SP. عينات مركزة خاصة من DPS قد تصبح أقل للذوبان على التخفيف في المخزن مؤقت أقل من الملح، كما يتضح من ملبد من السائل، ولكن يمكن resolubilized تماما قبل إضافة عمو الصغيرةNT من 5 M محلول كلوريد الصوديوم (وهي 10-20 ملم إضافية).
  15. تتوازن لمل SP سيفاروز عمود تدفق سريع 30 مع SP العازلة A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1.5-2 مل / دقيقة مع الحد من الضغط 0.3 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل العينة على العمود. يغسل مع SP الاحتياطي A حتى OD عائدات التتبع 280 إلى خط الأساس، وتجاهل التدفق من خلال. تشغيل الانحدار الخطي 150 مل 0-100٪ B الاحتياطي، في حين جمع الكسور 2 مل. سوف DPS أزل في ذروة حادة في حوالي 50٪ B، على الرغم من اختلاف بنسبة 10٪ هو ممكن.
  16. تشغيل الكسور شطف على 15٪ SDS-PAGE هلام، والتحقق من وجود تلوث الحمض النووي عن طريق قياس OD 260/280 OD نسبة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الجل ينبغي أن تظهر فقط فرقة واحدة حوالي 19 كيلو دالتون، وOD 260/280 OD هو عادة حوالي 0.7. تجمع أنقى DPS الكسور. استخدام وحدة تصفية الطرد المركزي (مثل وحدة الترشيح Amicon الترا) مع10K الوزن الجزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية لتركيز DPS ويتبادل عليها في المخزن مؤقت تخزين (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم). قسامة DPS تنقيته، والتجميد في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية.

2. DNA الفحص حماية

ينطوي على فحص متعددة الخطوات حساسة للوقت، وينبغي تزامنت مع ثاني للحصول على نتائج قابلة للتكرار. وتشارك العديد من المكونات والخطوات pipetting ل، لذلك جدول pipetting ل(انظر الجدول 1) من المستحسن أن تتبع الخطوات وحدات التخزين. إجمالي الوقت اللازم لفحص وجود أكثر من 3 ساعة.

  1. قياس 30 مل من الماء إلى قارورة محكمة الإغلاق؛ تدفق المياه مع N 2 لمدة 10 دقيقة (باستخدام اثنين من الإبر المحاقن، واحدة في السائل، واحدة فوقه) لإزالة الأكسجين من الحل. أضف 0.0168 ز FESO 4 • 7H 2 O إلى الماء للحصول على محلول المخزون 2 مم. اغلاق القارورة وتدفق مع النيتروجين لمدة 5 دقائق أكثر، ثم خلط. يجب أن يكون الحلواضحة، وإذا كان أي تلميح من الأصفر قابلا للاكتشاف، وإعداد حل الحديد الجديدة.
  2. جعل ملم 100 H 2 O 2 حل (10.87 ميكرولتر من 9.2MH 2 O 2 في 1 مل من الماء)؛ الحفاظ على الجليد ومحمية من الضوء بواسطة التفاف في رقائق الألومنيوم. استخدم فقط لحوالي 1-2 ساعة بعد التحضير بسبب تسوس عفوية. الأسهم بيروكسيد الهيدروجين هو وبالمثل تخضع لانهيار، والتي يمكن تحسينها جزئيا التخزين السليم (في الظلام، في 4 درجات مئوية). ويوصى الشيكات العادية للتركيز الأسهم عن طريق قياس OD 240.
  3. ذوبان الجليد قسامة من المنقى DPS بسرعة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على الجليد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 4،000 x ج في جدول أعلى picocentrifuge إلى المجاميع راسب. قياس تركيز بعد الطرد المركزي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (OD 280 = 1.547 يشير إلى وجود تركيز من 100 DPS مونومر ميكرومتر).
  4. تمييع DNA خطي من الأوراق المالية عالية التركيز باستخدام 12X العازلة رد فعل (1M-MOPS KOH درجة الحموضة 7.0، 1 M كلوريد الصوديوم) إلى تركيز من 100 نانوغرام / ميكرولتر. ويستخدم الحمض النووي خطي لجعل الكمي أسهل، ولكن يمكن استخدام DNA البلازميد كذلك.
  5. ماصة 1 ميكرولتر من خليط الحمض النووي العازلة في أنبوب PCR. إضافة ما يكفي من الماء في رد فعل بحيث حجم رد الفعل النهائي (ناقص SDS) سيكون 12 ميكرولتر. ينبغي أن يحسب هذا المبلغ مقدما باستخدام الجدول pipetting ل. إضافة DPS إلى تركيز النهائي من dodecamer 3 ميكرومتر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لDPS لربط الحمض النووي.
  6. إضافة ما يكفي من 2 ملي FESO 4 الحل للوصول إلى التركيز المطلوب. يستخدم تجربة نموذجية مجموعة من تركيزات 0-1 ملي FESO 4. سوف تركيزات أعلى يسبب تدهور الحمض النووي أكثر اتساعا ولكن قد يؤدي أيضا إلى تشكيل الحديد يترسب في خليط التفاعل. بسرعة إضافة 1 ميكرولتر من ملي H 2 O 2 حل 100 (إلى 10 ملي تركيز النهائي)، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للفنتونبوساطة رد فعل تدهور لتأخذ مكان.
  7. إضافة 0.8 ميكرولتر من 20٪ SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل). خلط واحتضان عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل المجمعات DPS-DNA. وSDS يزعزع استقرار معقدة DPS-DNA، ويمنع التحولات هلام غير المرغوب فيها لDNA، مما يحسن من سهولة القياس الكمي. خطوة اختيارية هو وقف رد فعل من جانب المهينة حفاز بيروكسيد الهيدروجين إلى منتجات غير سامة. لظروف وصفها في هذا البروتوكول، ليست هناك حاجة لهذه الخطوة الحصول على مجموعة واسعة من تدهور الحمض النووي.
  8. احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة، إضافة صبغة التحميل، وتحميل على هلام الاغاروز. تشغيل هلام، وصمة عار لالحمض النووي باستخدام بروميد إيثيديوم. وينبغي أن يكون الجل الملون بعد الكهربائي بدلا من قبل الكهربائي، لمنع SDS من التدخل في توزيع بروميد إيثيديوم في هلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عملية تنقية للDPS الموصوفة هنا هو تكرار للغاية. DPS تنقية وفقا للبروتوكول وصفها، وذلك باستخدام 2 لتر من E. ثقافة القولونية كنقطة انطلاق، وسوف تسفر عادة 2.5 مل من البروتين تحتوي على DPS 12 بتركيزات تتراوح بين 5 و 12 ميكرومتر. مرات الاستقراء أطول (4 ساعات) ويبدو للحد من هذه التقلبات. نقاء البروتين هو دائما فوق 99٪، كما يتضح من SDS-PAGE المواد الهلامية (الشكل 1). مستوى التلوث الحمض النووي لا يكاد يذكر على الدوام، كما يتضح من جانب كل من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عملية تنقية DPS كما هو موضح في هذه المقالة هي قوية للغاية. وكان نقاء باستمرار عالية (> 99٪)، وتظهر أي بروتينات أخرى على المواد الهلامية SDS-PAGE والعصابات مرئية. على الرغم من هذا، يبدو أن بعض دفعات من DPS تنقيته أن يكون النشاط نوكلياز، كما يتضح من تدهور الحمض النووي جزئية عندما حضنت مع تركيزات عالية جدا من المرحلين. قد يشير هذا إلى وجود DNases نشطة للغاية في تركيز منخفض لأننا لم نتمكن لإزالة من خلال تنقية. ومع ذلك، لوحظ هذا التدهور الحمض النووي فقط عند تركيزات التي لا يتم استخد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لميشيلا دي مارتينو، ويلفريد R. هاجن، وكوروش Honarmand ابراهيمي لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل بدء التمويل من جامعة دلفت للتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BL21 (DE3) pLysS الخلايا المختصةPromegaL1195
pET-17b DNAEMD-Millipore69663-3
LB مسحوق مرقSigma-AldrichL3022
ملح الصوديوم أمبيسلينسيجما ألدريتشA0166
كلورامفينيكولسيجما ألدريتشC0378
IPTGسيجما ألدريتشI6758
هيبسBDH441476L
هيدروكسيد البوتاسيومميرك105033
كلوريد الصوديومVWR443824T
EDTASigma-AldrichE9884
مجموعة كوكتيل مثبطات الإنزيم البروتيني IIIEMD-Millipore539134
DEAE-SepharoseSigma-AldrichDFF100
كبريتات الأمونيومسيجما ألدريتشA4418
PD-10 أعمدة تحليةالمياه GE Healthcare LS17-0851-01
SP-SepharoseSigma-AldrichS1799
Amicon Ultra Centr. فلتر (10K MWCO)ميليبورUFC901024
كبريتات الحديدوز سباعي هيبتاهيدراتسيجما ألدريتشF8048
محلول بيروكسيد الهيدروجينسيجما ألدريتش216763
MOPSمحلول كالبيوكيم475898
SDSBio-Rad161-0418
بروميد الإيثيديومسيجما ألدريتشE1510
حاضنة ثابتةHettichINE500
حاضنة اهتزاز نيو برونزويك Sc.Inova 44
جهاز طرد مركزي مبردBeckman CoulterAvanti J-E
جهاز طرد مركزي على الطاولةEppendorf5424
Cell DisrupterConstant Systems Ltd.TS2 / 40 / AA / AA
FPLC جهاز تنقيةجنرال إلكتريكAKTA
قوارير محكمة الإغلاقCole-ParmerEW-08918-85
إبر حقنةBD305128
ماصاتEppendorfZ683779-1EA ، Z683795-1EA

المراجع

  1. Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
  2. Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
  3. Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
  4. Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
  5. Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
  6. Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
  7. Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
  8. Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
  9. Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
  10. Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
  11. Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
  12. Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
  13. Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
  14. Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
  15. Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
  16. Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
  17. Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
  18. Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
  19. Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تطبيق على
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.