الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) إصابة حديثي الولادة يمثل أحد أهم أسباب التخلف العقلي، إلا أن الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى فيروس من صنع المرضية لا تزال غير مفهومة تماما. للتحقيق في ديناميات الإصابة في الدماغ، ونحن تكييفها كامل الحيوان في الجسم الحي التصوير لإجراء تحليل الوقت طبعا من حديثي الولادة المصابين بفيروس وسيفيراز-المؤتلف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV أو HHV-5) هو الممرض التي تهدد الحياة في الأفراد المناعة الشبهة. على العدوى الخلقية أو الأطفال حديثي الولادة، يمكن للفيروس أن يصيب وتكرار في الدماغ النامية، التي ربما تتسبب في أضرار عصبية شديدة، بما في ذلك الصمم والتخلف العقلي. وعلى الرغم من شدة المحتملة للأعراض، والخيارات العلاجية محدودة بسبب عدم توفر لقاح وغياب العلاج المضاد للفيروسات محددة. وعلاوة على ذلك، وصفا دقيقا من الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء إصابة الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تزال تفتقر منذ الملاحظات مستمدة في معظمها من تشريح الجثة من الأطفال المصابين. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية، مثل CMV المكاك ريسوس، وقدمت معلومات هامة عن CMV المرضية في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، على الرغم من التقارب التطوري مع البشر، وهذا النموذج كان محدودا قبل إجراء التلقيح داخل القحف استخدامها لتصيب الحيوانات وسلبياتلحث istently عدوى الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، عززت الاعتبارات الأخلاقية تطوير نماذج بديلة، من بين التي أدت عدوى حديثي الولادة من الفئران حديثي الولادة مع الفيروس المضخم للخلايا الفأر (MCMV) مؤخرا إلى التقدم الكبير. على سبيل المثال، أفيد أن الحقن داخل الصفاق من MCMV لحديثي الولادة BALB / ج يؤدي إلى إصابة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في مناطق معينة من الدماغ. اقترح هذه النتائج أن التلقيح التجريبية من الفئران قد ألخص العجز الناجم عن الإصابة HCMV في الأطفال. ومع ذلك، فإن التحليل الديناميكي للعدوى MCMV من حديثي الولادة من الصعب تنفيذ ذلك لأن المنهجية الكلاسيكية يتطلب التضحية من عدد كبير من الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة لتحليل عبء الفيروسية و / أو المعلمات المناعية ذات الصلة. للتحايل على هذه عنق الزجاجة وتمكين التحقيقات المستقبل من الحيوانات متحولة نادرة، طبقنا في الجسم الحي تكنولوجيا التصوير لإجراء تحليل الوقت طبعا من فيرانشر لتر في الدماغ عند حقن الطرفية من MCMV المؤتلف معربا عن luciferase المراسل إلى C57BL / 6 حديثي الولادة.
المقدمة
الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV/HHV-5) هو عضو في الأسرة β-هربس. HCMV هو واسع الانتشار، الممرض الانتهازية والتي عادة ما المكتسبة أثناء الحياة المبكرة باعتبارها عدوى عديمة الأعراض 1. مثل جميع فيروسات الهربس، HCMV استمرت طوال حياة كاملة من المضيف الذي تسيطر بإحكام تكاثر الفيروس الجهاز المناعي. حلقات تنشيط الفيروسية تحدث في الغالب في الأفراد المناعة مثل مرضى زرع يتلقون أدوية لمنع رفض الكسب غير المشروع 2. في البالغين، كما تم ربط HCMV إلى glioblastomas 3. وبالإضافة إلى ذلك، HCMV هو الممرض بارز لحديثي الولادة مع الحصانة غير ناضجة 4-6. العدوى الأولية في الجنين أو الوليد يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة. عدوى HCMV هو السبب المعدية الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية واضطرابات الطفولة في البلدان المتقدمة. وتشير التقديرات إلى أن حالات الإصابة HCMV حديثي الولادة يؤثر 0.5-1٪ Oو كل ولادة حية بين 5-10٪ والتي سوف يعانون من أعراض حادة مثل صغر الرأس أو نقص تنسج مخيخي. وبالإضافة إلى ذلك، سوف 10٪ من الرضع المصابين بفيروس التهاب فيروسي تحت الإكلينيكي يتطور لاحقا sequellae مما يؤدي إلى التخلف العقلي، وفقدان، والعيوب البصرية أو الاستيلاء والصرع 7،8 السمع.
وعلى عكس فيروس الهربس الإنسان الأخرى مثل الهربس البسيط 1 (HSV-1/HHV-1) والتي يمكن تلقيح الفئران إلى عبر طرق مختلفة من حقن 9، والنسخ الفيروس المضخم للخلايا هو أنواع محددة. هذه الميزة قد عرقل بشدة التحقيق في HCMV المرضية التي يتم تنفيذها في نماذج حيوانية مختلفة (الجرذان والفئران، خنزير غينيا، قرد هندي صغير) وCMVs المضيف محددة حقيقية لكل منها. جميع CMVs يحمل التشابه الكبير في حجم الجينوم والتنظيم، tropism الأنسجة وتنظيم التعبير الجيني. كما أنها تحفز أمراض مماثلة في المضيف كل منها. على الرغم من التنوع الجيني يكونتوين HCMV والفأر الفيروس المضخم للخلايا (MCMV) (50٪ من ORFS الموجودة في فيروس الإنسان والتي تم تحديدها في الفئران CMV)، وقد أثبت نموذج الفأر مؤخرا ليكون من المفيد، وذلك لأن معظمهم يمكن اختبار سلالات متحولة لقدرتها على السيطرة الفيروسية النسخ المتماثل في الجسم الحي. وقد أدى هذا إلى شاشة الوراثية التي مكنت تقدير لعدد من الجينات الماوس التي أعرب عنها في مرحلة الكبار الذي يؤلف "resistome" لهذا الفيروس 10. وإجمالا، يشير هذا إلى أن الفئران تمثل MCMV المصابة نموذجا جذابا لدراسة التفاعلات المضيف الفيروس لدى البالغين. استكشاف العدوى الخلقية CMV هو أكثر تعقيدا بسبب الاختلافات في منظمة طبقة المشيمة بين الإنسان والفئران تنال من انتقال العدوى من الأم إلى الطفل من عدوى فيروسية في الفئران. مؤخرا، الحقن المباشر للMCMV في المشيمة في يوم 12.5 من الحمل وقد مكن عدوى الدماغ من الفئران حديثي الولادة مما أدى إلى ضعف السمع 11. ومع ذلك، فإن معظم طnvestigations الآن استخدام حقن داخل الصفاق من 4-20 حديثي الولادة ساعة من العمر لتوفير نشر الفيروسية الجهازية مما قد يؤدي إلى عدوى الدماغ الدموي، وهذا نموذج والتي هي أكثر أهمية من أن وجود حقن داخل القحف. قدم هذا البروتوكول نظرة ثاقبة CMV المرضية وعلى الأخص، وقد تبين أن عدوى MCMV النتائج حديثي الولادة في تكاثر الفيروس في الخلايا العصبية والدبقية تقع في البؤر الالتهابية التي تسللت مع الخلايا وحيدات النوى مثل الضامة 12. وصف هذا التقرير أيضا التشكل غيرت من المخيخ ترافق مع تقلص انتشار الخلايا العصبية الحبيبية والهجرة وتحريض متعددة الجينات الإنترفيرون حفز. وأفيد أيضا بالدور الأساسي للCD8 + الخلايا التائية من أجل السيطرة على MCMV في الجهاز العصبي المركزي من قبل نفس المجموعة 13. أحد الجوانب الهامة التي يجب مراعاتها عند تحليل تأثير المرضية من جرثومة هو ديناميات تصيبأيون. في حالة MCMV، فمن الأهمية بمكان وخاصة لاستكشاف وتحديد تطور نشر الفيروسية في الدماغ النامية من أجل فهم وتوقع حجم الإصابات العصبية الحيوية في المستقبل. تقليديا، الكمي لتطور العدوى يتطلب التضحية العادية من الحيوانات المصابة إلى عيار الممرض في الأنسجة، مثل الدماغ، والتي لا يمكن الوصول إليها على خلاف ذلك. وتحدى هذا النوع من بروتوكول الآن من خلال التحسين اللازمة لرعاية الحيوان و3RS (الحد، حدد، استبدال) مبادئ 14. باستخدام تقنيات التصوير في الجسم الحي قد تسمح لانخفاض حاد في عدد الحيوانات التي هي ضرورية في التجارب العدوى في الجسم الحي. هنا، ونحن التقرير وصفا لتحليل الوقت طبعا من نشر الفيروسية في الدماغ على داخل الصفاق MCMV لوك الحقن لحديثي الولادة الماوس. باستخدام نفس الحيوانات، ونحن تعقب ورصد في الجسم الحي مواقع السادس مكثفةراؤول النسخ المتماثل خلال الفترة من 2 أسابيع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد تعليق الفيروسي
- الحصول على سلالة سميث من MCMV luciferase المراسل التعبير (MCMV لوك 15) من مختبر أولريش Koszninowski لل. في هذا المؤتلف، يتم إدراج الجين luciferase المراسل في موضع IE2 من الجينوم MCMV.
- لتضخيم MCMV لوك، تصيب نخاع العظم خط خلية انسجة الفئران (M2-10B4، آي تي سي سي # CRL-1972) مع MCMV في تعدد مختلفة من العدوى (وزارة الداخلية، ،001-1) 16. لهذا، إضافة الفيروس إلى الخلايا المستزرعة في المتوسط مجانا المصل عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، وإزالة طاف واستبدالها مع DMEM تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). بعد خمسة أيام، والحصاد ثقافة المتوسط ومأخوذة تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- المعايرة لتعليق الفيروسي بواسطة فحص اللوحة.
- تقسيم الخلايا 3T3 (آي تي سي سي # CRL-1658) في 24 لوحة جيدا في 40،000 خلية / جيدا في 1 مل من DMEM تستكمل مع FCS 10٪ تحتوي على البنسلين (200 وحدة دولية / مل)، وsteptomycin (200 ملغ / مل)، واحتضان 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تحضير التخفيفات المتسلسلة (10 -1 إلى 10 -8) من قسامة من MCMV التعليق في DMEM وتصيب الخلايا المستهدفة (3T3) مع 200 ميكرولتر من التخفيف بعد إزالة مستنبت الخلية. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. إضافة 1 مل من أعلى متوسط (DMEM 3٪ FCS، 2٪ (V / V) والجنتاميسين، و200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ملغ / مل الستربتوميسين، 8 ز / L كاربوكسيميثيل السليلوز)، واحتضان 5 أيام في 37 درجة مئوية.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر الفورمالديهايد بنسبة 10٪ (وينبغي أن يتم التخفيف من الفورمالديهايد مع الماء في غطاء الكيميائية لتجنب استنشاق السامة) إلى كل بئر، ويحتضنها 6 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة مستنبت + التبعي من قبل pipetting خارج وإضافة 200 ميكرولتر حل تلطيخ الخلية (1٪ الكريستال البنفسجي (W / V) في 20٪ من الإيثانول). قبل الاستخدام، تمييع 1 جزء مع 9 أجزاء من الماء ملي-Q. احتضان 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحة 3-4X عن طريق نقع في الماء، واسمحوا الجافة وحساب عدد لويحات مع مجهر.
<لى> تمييع MCMV لوك في DMEM للحصول على 50 PFUs في 50 ميكرولتر وترك على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى. باستخدام اللقاح الفيروسي أعلى يدفع الفتك قبل حديثي الولادة تصل إلى 2-3 أسابيع من العمر. في تجربتنا، 500 PFUs لحث على الفتك في كل الوليد 5-7 أيام بعد الحقن.
2. حقن من الولدان
- عندما تكون حديثي الولادة (4-20 الفئران ساعة من العمر) المتاحة، معالجة القمامة والبراز من القفص مع قفازات قبل التعامل مع الجراء بعناية لتجنب التلوث مع الروائح "الخارجية" التي من شأنها أن نؤكد على الأم وتحفز على رفض الجراء .
- إجراء حقن داخل الصفاق باستخدام حقنة الانسولين (29 G) كما هو مبين في الشكل 1A. عقد الوليد مع الجلد الظهرية. مع الجانب بطني حتى، وإدخال الإبرة تحت الرجل الاماميه ودفع برفق تحت الجلد لتحقيق التجويف البريتوني (قليلا تحت السرة). نحن حقن حاليا 1٪ الميثيلين الأزرق المخفف في DPBS ورصد البقاء على قيد الحياة إلى فractice هذه التقنية قبل تنفيذ الالتهابات الفيروسية. منذ أزرق الميثيلين مرئيا بوضوح خلال عملية الحقن، ونحن نعتقد بأن تنفيذ هذا "التدريب" الحقنة الأولى أن يضمن تسليم مناسب من التعليق الفيروسية في تجويف داخل الصفاق.
- القضاء على قطرات الدم الصغيرة التي قد تنشأ، ووضع الظهر الوليد في القفص.
3. في الجسم الحي التصوير
- في يوم 7، والتعامل مع حديثي الولادة مع نفس تحذر كما ذكر سابقا. حقن الغشاء البريتونى خليط من أدوية التخدير (4 ملغ / مل الكيتامين، 0.8 ملغ / مل زيلازين) ووسيفيرين (0.15 ملغ / غرام من وزن الجسم) في 50 ميكرولتر في كل حيوان. متوسط وزن الجسم من الحيوانات هو 1-2 ز وجرعة من أدوية التخدير للحيوان الواحد هو: الكيتامين 40 ميكروغرام، زيلازين 8 ميكروغرام انتظر 12-15 دقيقة حتى وسيفيرين تصل إلى الحد الأقصى من الانبعاثات. هذا يجب أن يتم تحديدها مسبقا ويعتمد على مزود وسيفيرين ونظام التصوير المستخدمة.
- بينما الجراء هي anesthetiزد، علامة عليها لتحديد المستقبل وحصاد قطعة صغيرة من الأنسجة التي يمكن استخدامها بعد ذلك لالتنميط الجيني في المستقبل إذا تم استخدام حيوانات متحولة.
- وضع الجراء في نظام التصوير وأداء الاستحواذ على الضوء المنبعث من الجسم كله. سبعة أيام بعد الإصابة، وتكرار الفيروس في العديد من النسخ في الأجهزة المستهدفة مثل الكبد والكلى والرئتين والغدد اللعابية، وبالتالي، يتعين على مدة التعرض تكون قصيرة. في حالتنا، ونحن أداء اقتناء لمدة 10 إلى 20 ثانية (الشكل 1B). منصة في قاعة اقتناء جهاز التصوير يحتاج إلى أن يكون ساخنا لتجنب التبريد المفرط للدرجة حرارة الجسم من تخدير الحيوانات. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للحصول على صور منخفضة الدقة من العديد من الحيوانات ضمن جولة واحدة من اقتناء وبعد ذلك، نقل ما يصل منصة أقرب إلى عدسة الكاميرا من أجل التركيز على جزء واحد من حيوان معين أو جهازا معزولة في اعقاب تشريح. البرنامج يجب تمكين التغيرات السريعةمن المعلمات (زمن التعرض، وبعد المسافة عينة / عدسة، والحساسية)، الكمي من مناطق محددة من الفائدة والصادرات في المستقبل من الصور لقطة.
- للحصول على إشارة ضوئية من الرأس فقط، وتغطي الجسم من الولدان الكذب أفقيا مع سميكة، ورقة المظلمة التي سوف تحجب الفوتونات المنبعثة على مستوى الأجهزة حيث يحدث تكاثر الفيروس عالية (الكبد، الرئتين، الغدد اللعابية) وأداء اقتناء لمدة 5 إلى 10 دقيقة (الشكل 1C). أداء اكتساب الجانب بدلا من الحيوان في نفس الظروف.
- إعادة تقديم الجراء في قفص ووضع مصباح التدفئة على رأس لتجنب التبريد المفرط للتخدير حديثي الولادة. رصد الانتعاش بعد مخدر بانتظام. مع جرعة المشار إليه، والتخدير يستمر 30 دقيقة حاليا.
- كرر نفس الإجراء في أيام 9 و 11 و 14. في أيام 11 و 14، وتغيير جرعة من التخدير (6 ملغ / مل الكيتامين و 1.2 ملغ / مل زيلازين).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويتضح تجربة ممثل في الشكل 1. عند حقن داخل الصفاق من 50 PFUs من MCMV لوك (لوحة ويظهر حقنة مماثلة أجريت مع الميثيلين الأزرق لتصور الطريق تحت الجلد من الإبرة)، كان الولدان تخدير وردت في وقت واحد 0.3 ملغ من الركيزة luciferase المراسل (وسيفيرين، الفرجار). وبعد خمس عشرة دقيقة، وضعت الحيوانات الجانب بطني حتى في غرفة اقتناء IVIS 50 (في نظام التصوير فيفو، الفرجار)، واستولت على ضوء المنبعث من الحيوان كله خلال ثانية تعرض 10. لوحة B يظهر الصور لقطة تؤخذ في أيام 7 و 9 و 11 و 1...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام تكنولوجيا التصوير في الجسم الحي لرصد نشر MCMV لوك في الفئران حديثي الولادة، وكنا قادرين على مراقبة انتشار الفيروس إلى الدماغ من الحيوانات متحولة، في مقابل من النوع البري. وأكد مزيد من الحيوان والتصوير فيفو السابقين من تشريح الدماغ وجود فيروس الانارة في الجهاز العصبي المركزي. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا إجراء المناعية (لا يظهر) على المقاطع رقيقة الدماغ مع الأجسام المضادة المحددة لMCMV E1 البروتين في وقت مبكر، ولاحظ أن في الواقع، MCMV موجودا في نفس المناط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
بيان الأخلاق
تمت المحافظة على الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض في منشأة رعاية الحيوان من معهد الدراسات Immunologie وآخرون D'Hématologie. أجريت التعامل مع الفئران والإجراءات التجريبية وفقا للقانون الفرنسي لحماية الحيوانات في المختبر. تمت الموافقة على الإجراء من قبل خدمة véterinaire دي لا ولاية دو باس رين (فرنسا) تحت ترخيص رقم A-67-345.
شكر وتقدير
نشكر لي Tuddenham (IBMC، ستراسبورغ) لتضخيم والمعايرة MCMV لوك وتوماس Baumert (INSERM U748، ستراسبورغ) للحصول على إذن لاستخدام مرفق الحيوان من معهد علم الفيروسات. ومن المسلم به الدعم المالي من INSERM، جامعة ستراسبورغ والوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-08-سحنة-005-01). ومن المسلم به أيضا بمشاركة الأولي من سونيا Beroud واتيتيا Lelieur خلال مشروع سيدهم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>كاشف / مادة< / قوي> | |||
| DMEM | فيشر Scientific | W3523A | |
| ميثيلين أزرق | سيجما ألدريتش | 319112 | |
| إبر الأنسولين | VWR | 613-4897 | |
| الكيتامين | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine / Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| لوسيفيرين | الفرجار | 760504 | |
| جنتاميسين | سيجما ألدريتش | G1272 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو | 15070 | |
| كربوكسي ميثيل السليلوز | سيجما ألدريتش | C4888 | |
| الفورمالديهايد | سيجما ألدريتش | F8775 | |
| البنفسجي الكريستالي | Sigma Aldrich | C3886 | |
| IVIS 50 | الفرجار / بيركين إلمر |
المراجع
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. Immunity in neonates. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. Immune responsiveness in the neonatal period. J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70(2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
