مقالة منهجية

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد في الرحم Electroporation

DOI:

10.3791/50412

⸱

يوليو 24, 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg , 2Institut de recherches cliniques de Montreal

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت المهاد، في الرحم التلاعب الجيني من تطورها. نعرض إجراء مفصل ل في الرحم electroporation في منطقة ما تحت المهاد الماوس وتظهر نتائج ممثلة من الكل والجزئي ترنسفكأيشن طائي (الإقليمية).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديل الوراثي للمناطق معينة من أدمغة الثدييات النامية هو المنهج التجريبي قوية جدا. ومع ذلك، وتوليد المسوخ الماوس الرواية غالبا ما تكون بطيئة بشكل محبط. ولقد ثبت أن الوصول إلى مخ الفأر النامية في الرحم مع بقاء ما بعد الجراحة معقول هو ممكن. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج مع هذا الإجراء على وجه الحصر تقريبا في معظمها سطحية ويمكن الوصول إليها بسهولة من الدماغ النامية، أي القشرة. وقد ثبت المهاد، وهي منطقة أضيق وأكثر وسطي، أكثر صعوبة لهدف. ترنسفكأيشن لتكوين نواة أكثر عمقا، خصوصا تلك من منطقة ما تحت المهاد، وربما تم الإبلاغ عن النتائج الأكثر تحديا، وبالتالي عدد قليل جدا. هنا علينا أن نبرهن إجراء لاستهداف الظهارة العصبية طائي بأكمله أو جزء منه (المناطق طائي) لترنسفكأيشن من خلال electroporation. مفاتيح لنهجنا الأوقات الخدر لفترة أطول، حقن في تيهيرد البطين، ونوع وتحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا نتائج الاستهداف والتحليل النسيجي لاحقة من نواة تحت المهاد البصري الأكثر راحة، والجسم الحلمي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التلاعب الجيني للدماغ الفأر الجنينية هو النهج المفضل لمعرفة المزيد عن تنظيم التنموية. الجيل من خطوط الماوس متحولة ولكن هو بطيئة ومكلفة. واحد طريقة قوية لإدخال تغييرات جينية محددة في تطوير الخلايا العصبية للدماغ الثدييات هو electroporation في الرحم. أساسا، تتكون هذه التقنية من transfecting الحمض النووي في الظهارة العصبية الجنينية الدماغ عن طريق نبضات كهربائية، ثم السماح الجنين إلى البقاء على قيد الحياة لفترة معينة من الزمن، وجمع الدماغ ودراستها لرواية ممكن، الظواهر غنية بالمعلومات. في هذه الطريقة، يمكن للمجرب اختبار الفرضيات على الفور تقريبا دون فترات انتظار طويلة اللازمة لإنتاج المسوخ الماوس.

التي ترنسفكأيشن من الحمض النووي في الأجنة النامية مع electroporation في البيضة على افراخ الدجاج 1. تم إجراء إثبات صحة مفهوم أساسي للماوس في الثقافة 2. وسرعان ما أعقب ذلك الأوصاف الأولى من هذه التقنية علي الفار في الرحم 3،4.

والمشكلة الرئيسية هي لبالنقل دماغ الأجنة النامية في الرحم دون قتلهم أو الأم. تعلم لإجراء الجراحة اللازمة (البطن، والحقن، electroporation) يتطلب فترة تدريب طويلة. بمجرد يتقن عملية جراحية لنقطة حيث نسبة البقاء على قيد الحياة الجنين غير مقبول، فإن السؤال الرئيسي التالي هو: ما هي هياكل الدماغ يمكن الوصول إليها؟ ليس من المستغرب، أول الأبحاث المنشورة تظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع electroporation في الرحم تركز على التنمية القشرية 5-9. هذا لا يزال صحيحا بالنسبة لمعظم المنشورات باستخدام هذه التقنية، منذ المنطقة من الدماغ الماوس النامية الأكثر متناول العمليات الجراحية هي القشرة (الشكل 1). وقد وصفت الإجراء لelectroporation في الرحم في اللحاءفي الطباعة 10 و 11-14 في الفيديو. وهناك تعديل لهذه التقنية يمكن استخدامها لاستهداف جزء البطنية من الدماغ الانتهائي، والعقد القاعدية 15.

ما وراء الدماغ الانتهائي، والدماغ البيني (مقسمة تقليديا إلى المهاد المهاد و) هي منطقة من الدماغ الأمامي من الصعب الوصول إليها. وهناك عدد قليل من التقارير أوراق استهداف جانبها الظهرية والتي يمكن الوصول إليها، المهاد 16-19.

ما تحت المهاد هو الجزء الأكثر البطنية من الدماغ الأمامي، وبالتالي فإن واحدة المترجمة معظم عميق من السطح الظهري (اللحاء) (الشكل 1). لا تزال هذه المنطقة تحديا صعبا للباحثين ملتزمة التلاعب وراثيا مخ الفأر في الرحم. على حد علمنا، يقدم سوى عدد قليل جدا مقالات عن نتائج في ترنسفكأيشن الرحم في منطقة ما تحت المهاد الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن أهمية وظيفية من منطقة ما تحت المهاد المدفعر يكون مبالغا فيه، لأنه ينظم السلوكيات مثل الأكل والشرب، والتزاوج والتربية والأبوة والأمومة 22. وعلاوة على ذلك، وتعديلات في التنمية طائي تسهم أن تنشأ لاحقا في ظروف الحياة مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم والسكري والبلوغ المبكر 23. سوف تكون قادرة على تغيير وراثيا تحت المهاد خلال تنمية تقدم أداة قوية جدا لفهم ذلك.

بروتوكول الجراحية الأساسية لفتح البطن من الفئران الحوامل التي نستخدمها هنا هي مماثلة لتلك المستخدمة في البروتوكولات الأخرى 11،13،14،24. سنقوم بشرح منهم هنا لفترة وجيزة للتأكد من اكتمالها. مفتاح الإجراء لدينا، من ناحية أخرى، هي نوع من التخدير، ومكان الحقن، نوع من الأقطاب الكهربائية والإدراج والموقف من القطب الموجب فيما يتعلق رأس الجنين. ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال استنشاق الغاز على تخدير داخل الصفاق بسيطة، منذ السابق يسمح للفترات أطول نوعا من الخدر اللازمة لعملية جراحية صعبة. النتائج استنشاق isoflurane والانتعاش في أسرع من التخدير، منذ يوضح عادة الأم السلوك العادي بالفعل دقائق بعد الجراحة. أسهل نقطة الحقن من الحل DNA مع الزجاج micropipette هو البطين الجانبي، والتي مع ذلك غير مناسب تماما ل electroporation تحت المهاد. حقن مباشرة في البطين الثالث هو في الواقع حاسمة لاستهداف هياكل الدماغ البيني عميق. فمن الممكن لبالنقل منطقة ما تحت المهاد من E12.0 أو E12.5 مع معيار، أقطاب قبالة الجاهزة للاستخدام. لقد تم العثور على بعض من الأقطاب الكهربائية المصنعة من قبل نيبا جين (تشيبا، اليابان) مناسبة خاصة لهذا الغرض.

مع إجراءاتنا نحصل على ترنسفكأيشن من الظهارة العصبية طائي كامل أو جزئي ترنسفكأيشن الإقليمية، اعتمادا على اتجاه القطب. نحن هنا لشرح هذه التقنية عليها بنقل الجسم الحلمي، يمكن القولأعمق وأكثر راحة من كل نواة تحت المهاد البصري. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا التحليل النسيجي مفصل لالخلايا transfected وصولا الى المستوى الخلوي من القرار.

مقارنة بين electroporation في الرحم مع المناهج الأخرى لtransfecting البلدان النامية مخ الفأر في الرحم يمكن العثور عليها في الجزء المتعلق بالمناقشة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحمض النووي وزجاج بال micropipettes للحقن

  1. نوعية جيدة بال micropipettes الزجاج ضرورية للحد من ارتفاع نسبة الإجهاض الأولي بسبب فقدان السائل الذي يحيط بالجنين. الإجراء لسحب بال micropipettes الزجاج تم توثيقه جيدا 13،18،25. استخدام 1.2 مم قطر الشعيرات الدموية سحبت في سوتر التقليدية P-97 جهاز مع الإعدادات P = 500؛ الحرارة = 300؛ سحب = 40؛ السرعة = 50؛ الوقت = 50. تناسب ساحبة مع 3 ملم خيوط "الحوض الصغير" (سوتر الصك FT330B). وقد أسفرت خيوط حجم 2 مم بالنسبة لنا نتائج مرضية أقل. من ناحية أخرى، الميلا من micropipette نصائح لا يبدو لتحسين النتائج بالنسبة لنا.
  2. حل تنقيته، DNA البلازميد خالية من الذيفان الداخلي في برنامج تلفزيوني (الصف خلية الثقافة) تحتوي على 0.1٪ سريع الأخضر إلى تركيز النهائي من 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر. سوف الأخضر سريعة تجعل من حل حقن مرئية في البطين الدماغ الجنينية.
  3. تحميل 10 ميكرولتر من الحل الحمض النووي في micropipette الزجاج.
  4. ربط micropipette الزجاج لنظام حقن (مضخة بيكو) أو ماصة الفم.

2. خدر

إعداد جداول التشغيل مع وسادة التدفئة والأدوات الجراحية. بدوره على مصادر الباردة ضوء لتسهيل التصور من الأجنة. تطهير الأدوات الجراحية باستخدام على سبيل المثال حبة تعقيم الزجاج.

ثلاثة إجراءات التخدير مختلفة ممكنة لهذا البروتوكول (انظر المناقشة). هنا سوف نقوم بوصف واحد ونحن نعتبر أفضل، وذلك باستخدام استنشاق isoflurane ولتحريض التخدير (معدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة)، وكذلك صيانة (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة).

  1. أعرض الماوس الحوامل في وعاء صغير شفاف (بحيث يبقى الماوس مرئية) متصلا Komesaroff مارك 5 جهاز التخدير من قبل طول قصيرة من الأنابيب.
  2. ملء مع المرذاذ isoflurane و، ثم فتح زجاجة الأكسجين تعلق على الجهاز. ضربة واحدة أو اثنين من البقول isoflurane / الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) في وعاء الضغط على الماوس ووتش للتخدير لتعيين فيها
  3. خذ الماوس خارج، وتغطية عينيه مع مرهم لمنعهم من التجفيف وتناسب قناع التخدير تدفق رأسا على عقب على الفور.

3. البطن

  1. ضع الماوس البطن حتى على وسادة التدفئة (وإلا درجة حرارة جسمها سوف تنخفض سريع جدا مما يقلل فرص الشفاء) وتأمين جسمها في مكانها عن طريق تحديد أربع أرجل لها على الجانبين مع الشريط. تقييم عمق التخدير عن طريق التحقق من فقدان استجابة لتحفيز رد الفعل (على سبيل المثال اصبع القدم أو قرصة الذيل مع الضغط الثابت).
  2. حلق سطح البطن وتعقيمها مع iodophorpovidone-اليود (Braunoderm).
  3. إجراء شق طولي (1-1،5 سنتيمترا) على الجلد في منطقة البطن. ثم قطع الصفاق. وضع الشاش والقطن حول شق. جعل قرن الرحم واحدة مرئية وتخلعها بعناية مع ملقط حادة على PBS-تشطف gauzه. شطف الرحم مع برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان للحفاظ على ترطيبها دائما (أرقام 2A و 2B). أثناء الإجراء بأكمله تجنب سحب مسراق الرحم أو الرحم ضيق، منذ ارتفاع الضغط داخل الرحم وسوف تحيل إلى الجنين يزيد من فرص فقدان السوائل على حقن مما أدى إلى الإجهاض.

4. حقن الحمض النووي في البطين الدماغ

  1. عقد الرحم في مثل هذه الطريقة التي البطينين الدماغ يمكن تصور. لا إعادة على نطاق واسع الجنين الذي يكمن في وضع غير موات - وهذا يزيد من فرص الإجهاض.
  2. أبحث في رأس الجنين من أعلى، توطين بصريا الفجوة أو الشق بين نصفي الكرة الأرضية القشرية اليسار واليمين. نصفي الكرة الأرضية سهلة للتمييز وعادة ما يمكن أن ينظر إليها البطينين الوحشي داخلها (وينبغي عدم استهداف) كأشكال أكثر قتامة نوعا ما. إذا تم العثور على الجنين لتكون موجهة تماما لحقن الحمض النووي (الارقام ..ES 2C و 2D)، فمن الممكن أن تخترق جدار الرحم وأدخل البطين الثالث في آن واحد. عقد micropipette الزجاج في 45 ° إلى جدار الرحم وثقب في نهاية منقاري من الفجوة بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، اختراق لحوالي 1 مم. وبهذه الطريقة غيض من الزجاج micropipette ستدخل البطين الثالث من الدماغ (وليس البطين الجانبي) (أرقام 2C و 2D). في الأجنة أقل المنحى بشكل إيجابي ومن المفيد لأول اختراق جدار الرحم (دائما عند 45 درجة) على مقربة من الرأس جنينية، ضع رأس micropipette في المكان المناسب بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، وعندها فقط خرم الدماغ. حقن حوالي 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في البطين الثالث (حقنة جيدة يملأ البطين بسائل أخضر). كرر نفس الإجراء مع كل الأجنة من الرحم واحد القرن. هذا يسمح لبعض الوقت من أجل حل الحمض النووي لخلط بالتساوي مع السائل البطين والوصول إلى entirه الظهارة العصبية.

5. استهداف المهاد ل electroporation

  1. تبديل electroporator على وضبط إعدادات وفقا لعمر الجنينية (لE12.5 نستخدمها 5 البقول مربع موجة، 50 V، 50 ميللي ثانية ON/950 ميللي ثانية OFF). كما استخدم القطب الموجب الفولاذ المقاوم للصدأ القطب إبرة (CUY550-10)، وكما القطب السالب القطب شقة جولة (CUY700P4L). (ومن المهم أن الأقطاب الكهربائية هي أصغر من الجنين، منذ وإلا فإن التدفقات الحالية قاب الجنين ولكن ليس من خلال ذلك.)
  2. حدد ل electroporation تلك الأجنة التي ظهري الجانب متروك (أي تحول نحو مجرب) (حيث أن معظم منهم)، وتجاهل أولئك الذين توجه ليست مواتية. هي عليه الآن آمنة للمس أصابع الرحم مع الايثانول تطهيرها أو مع قفازات. عقد الرحم بالملقط، ومع ذلك، من شأنها أن تتداخل مع تدفق التيار خلال electroporation.
  3. تخترق جدار الرحم بواسطة رأس الجنين بين الامنSAC iotic والمشيمة من خلال دفع إلى أسفل من خلال ذلك مع غيض من القطب إبرة. استخدام السبابة من اليد الأخرى وكتلة التوجه. حوالي 5 ملم من طرف القطب يجب أن يكون الآن بين الكيس الذي يحيط بالجنين وجدار الرحم، عند حوالي مستوى الدماغ المتوسط ​​(أرقام 2E و2F). تذكر أن هذا هو "استهداف القطب"، لذلك سوف تحدد موقفها الذي هو الأكثر احتمالا للحصول على transfected جزء من الظهارة العصبية طائي. الجنين يجب أن يكون بلطف جدا "تقلص" بين الأقطاب.
  4. مع من ناحية أخرى، موقف القطب شقة جولة خارج جدار الرحم على الجانب الآخر من رأس الجنين (أرقام 2E و 2G).
  5. استخدام دواسة التبديل إلى تطبيق الجهد (V 50، 50 ميللي ثانية ON، 950 ميللي ثانية OFF، 5 البقول مربع موجة).
  6. سحب ببطء القطب إبرة للخروج من الرحم في حين تحجم الرحم مع السبابة من اليد الأخرى - إذا السلىيتم فقدان عرة السائل من خلال ثقب الجدار، وعادة ما تجري عملية إجهاض الجنين. كرر الإجراء مع كل الأجنة.
  7. العودة قرن الرحم في البطن وتكرار الحقن و electroporation في القرن بقية.

6. الانتهاء من الجراحة

  1. بعد الحقن و electroporation من جميع الأجنة، وضع الرحم مرة أخرى في البطن بعناية فائقة، وضعه تماما كما كانت عليه من قبل ورطبة التجويف البريتوني مع المياه المالحة قبل إغلاقه.
  2. خياطة البريتوني مع الخيوط الجراحية (VICRYL Polyglactin 910، 5-0، [إثيكن V4914). لإغلاق استخدام الجلد "توقف غرزة" methodwith خياطة أكثر مقاومة (Supramid نايلون، 6-0، سراج يسنر TO 07171L).
  3. تطهير سطح البطن مع بوفيدون اليود (Braunoderm) وحقن غير الستيرويدية المضادة للالتهابات تحت الجلد (على سبيل المثال 100 ميكرولتر من محلول 01:10 من Rimadyl في 0.9٪ كلوريد الصوديوم)، أو حتى أفضل، وهو الأفيونية مثل بوprenorphine (Temgesic، 0.05 و 0.1 مغم / كغم من وزن الجسم في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) لتخفيف الألم.
  4. إزالة الأم من الجهاز مخدر ووضعه في قفص الذي يتم تسخينه بواسطة وسادة التدفئة. رصد الماوس باستمرار حتى يتم استرداد تماما من التخدير. في وقت لاحق، والتحقق من الحيوانات يوميا لضمان أنهم يتماثلون للشفاء من الإجراء دون أي علامة على الإصابة أو الألم.

7. تحليل النتائج

  1. حصاد الأجنة (أو postnatals) وفقا إلى اليوم المطلوب من التحليل. وقتل الفئران بعد الولادة (1-2 يوم من العمر) بواسطة قطع الرأس.
  2. فصل كل الجنين وفقا لهذا الشرح electroporation السابقة. تشريح الدماغ تحت stereomicroscope والاختيار تحت المجهر للإشارة الفلورية الخضراء (GFP من مراسل) في المنطقة المناسبة.
  3. الدماغ اختيارها يمكن تحليلها "جديدة": إصلاح الأنسجة لفترة قصيرة في بارافورمالدهيد 4٪ وتغرس في الاغاروز 4٪ أو الجيلاتين في واحدlbumin، ثم قسم على جهاز vibratome من نوع (الشكل 3). لمزيد من التحليل المناعى مفصلة (الشكل 4)، البرد حماية المخ في 30٪ من محلول السكروز، تغرس في أكتوبر تصاعد المتوسطة (الأنسجة تيك) ثم قص المقاطع 20 ميكرون في ناظم البرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يولد معظم الخلايا العصبية تحت المهاد بين E11.5 إلى E15.2، وفقا لتحليل الميلاد التي يرجع تاريخها في الفئران 26 ترجمتها إلى تطوير الماوس أقصر إلى حد ما 27،28. يتم الوصول إلى الذروة من تكوين الخلايا العصبية طائي في E12.5 29-31. وفقا لذلك، في سن ترنسفكأيشن الذي تم اختياره لهذه الدراسة (E12.5)، يمكن أن توصف نسبة كبيرة من الخلايا العصبية طائي على أي مستوى rostro-الذيلية معين.

تحليل في E...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حول التخدير: منذ electroporation في الرحم في منطقة ما تحت المهاد يمكن أن تكون شاقة تقنيا وتتطلب مرات الخدر لفترة أطول، ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال الإدارة من خليط من الأكسجين وisoflurane و. في تجربتنا، ويمكن أن تبقى الحيوانات مخدرة بشكل مناسب في هذه الطريقة لفترات تصل إلى ساعة واحدة على الأقل، واستعادة الأم هو سريع جدا، وتحسين بقاء الجنين. مناهج أخرى للتخدير وتتوفر أيضا. يتكون الإجراء الأكثر بسيطة على إحداث وصيانة الخدر عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2.5 مل /...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
 <قوي > الكواشف < / قوي >
أسيبرومازينسانوفي GmbHمخدر
إيزوفلورانباكسترHDG9623مخدر
كيتامينفارما GmbHمخدر
سريع أخضرفلوكا44715  ؛
ريماديلفايزربراونوديرم براون
يود
فوسفات عازلة PBSGibco14190& nbsp ؛
Temgesic (بوبرينورفين)Essex Pharmaمسكن أفيوني
مرهم العينPan-Ophtal7136926 
زيلازينباير 
 <قوي>المعدات
جهاز التخدير Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
مجتذب الشعيرات الدموية P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.جهاز VF-300نوع الاهتزاز
مجهر متحد البؤرZeissLSM700  ؛
CryostatLeicaCM3050S 
المثقور الكهربائيNepa Gene Co. Ltd.CUY21EDIT 
القطب الكهربائي 1شركة نيبا الجينات المحدودةCUY550-10إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، طرف 10 مم ، قطر 0. 5 مم.
القطب الكهربائي 2شركة نيبا الجينات المحدودةCUY700P4Lغطاء لوحة بلاتينية مستديرة قطر 4 مم
مصدر الضوء البارد من الألياف البصريةLeicaKL2500 LCD& nbsp ؛
الشعيرات الدموية الزجاجيةهارفارد جهازGC120T-151. 2 مم OD × 0. 94 مم معرف
معقم حبةزجاجية أدوات العلوم الدقيقةFST250  ؛
وسادة التدفئةHarvard Apparatuspy872-5272 
جهاز الحقنأدوات الدقةمضخة بيكو الهوائية PV820  ؛
خيوط خياطة مطلية بفيكريلإيثيكونV4914خياطة خياطة بريتونية
Thr. خياطة الجلد TO07171L SupramidSerag Wiessner
3887138 بوفيدون من قطب العالمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236(2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27(2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4(2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

In Utero ElectroporationHypothalamic DevelopmentMouse EmbryoDNA InjectionThird VentricleElectrode PositioningFluorescence MicroscopyMammillary BodyCell MigrationGenetic Specification

مقالات ذات صلة