الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم التعرف على الجين MGM101 قبل 20 عاما لدوره في الحفاظ على الحمض النووي. واشارت دراسات عدة مجموعات من أن البروتين Mgm101 وتشارك في إصلاح تهجيني من الحمض النووي. وأشارت التحقيقات الأخيرة التي Mgm101 تتعلق Rad52 من نوع إعادة التركيب عائلة البروتين. هذه البروتينات تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبير وتعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. ومع ذلك، فقد أعاقت توصيف Mgm101 من صعوبة في إنتاج البروتين المؤتلف. هنا، يوصف إجراء موثوق بها لإعداد المؤتلف Mgm101. المالتوز البروتين ملزمة (ب ب) الموسومة Mgm101 يتم التعبير الأول في الإشريكية القولونية. يتم تنقيته من البروتين الانصهار في البداية من قبل أميلوز تقارب اللوني. بعد إطلاق سراحه من قبل انشقاق بروتين، يتم فصل Mgm101 من MBP بواسطة الموجبة اللوني الصرف. يتم الحصول على Monodispersed Mgm101 ثمحسب حجم الاستبعاد اللوني. العائد من ~ 0.87 ملغ من Mgm101 للتر الواحد من ثقافة البكتيرية ويمكن الحصول بشكل روتيني. وMgm101 المؤتلف ديه الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي. يتم استخدام عينات معدة بنجاح لالبيوكيميائية والهيكلية واحد الجسيمات تحليلات صورة Mgm101. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات الحمض النووي ملزم بلازميدة قليلة القسيمات الكبيرة الأخرى التي يمكن أن تتجمع وسامة للخلايا البكتيرية.
المقدمة
إعادة التركيب مثلي المهم لإصلاح مزدوج الجديلة فواصل (DSBs) وinterstrand crosslinks، وباستعادة تكرار الحمض النووي من تكرار الشوك المنهارة 1. في إعادة التركيب مثلي التقليدية، يتم تحفيز رد الفعل المركزي من قبل recombinases التي تعتمد على ATP بما في ذلك RECA في بدائيات النوى، وRad51 وDmc1 في حقيقيات النوى 1-3. هذه recombinases تشكيل خيوط البروتين النووي على ssDNA، التي تعتبر ضرورية للبدء في البحث عن التماثل وغزو حبلا ضمن قوالب الحمض النووي المزدوجة (الشكل 1، لوحة اليسار) 4-7. بالإضافة إلى مخطط التقليدية، ويمكن إعادة التركيب مثلي أيضا أن تأخذ مكان بطريقة RecA/Rad51-independent
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أظهرت دراسات سابقة أن أول محطة الأمينية 22 مخلفات Mgm101 يتم المشقوق بعد الاستيراد في الميتوكوندريا 19. للتعبير في الإشريكية القولونية، يتم تضخيمه MGM101 إطار القراءة المفتوح تفتقر إلى الكودونات أول 22 بواسطة PCR وضعت المصب من تسلسل ذكر ترميز البروتين ملزمة المالتوز (ب ب) في نسخة معدلة من ناقلات التعبير pMAL-C2E. هذا يولد الانصهار MBP-Mgm101 مع رابط موقع يحتوي على الانقسام لالبروتيني PreScission (الشكل 3). البلازميد هي التي شيدت أول من خلال تحديد E. transformants القولونية دون IPTG وXgal اختيار أزرق / أبيض. ثم يتم إدخال البلازميد الناتج pMAL-C2E-MG....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Mgm101 هو بروتين إعادة التركيب ذات الصلة Rad52 في الميتوكوندريا. وقد درس على نطاق واسع Rad52 لدورها في إعادة التركيب الحمض النووي (الشكل 1). المؤتلف Mgm101 يمكن أن تعده إجراء ثلاث خطوات (الشكل 2). ومما يسهل ذلك عن طريق استخدام استراتيجية MBP الجغرافية التي تسمح Mgm101 أن أعرب في شكل قابل للذوبان وأفرج عنه في وقت لاحق من العلامة التي تشطر بروتين (الشكل 3).
في إعدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد كان التحدي لإنتاج مستقر، وأصلي المؤتلف Mgm101 البروتين من E. القولونية وربما يعود ذلك إلى الذوبان في الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير، وتبين لنا أن الاستراتيجية MBP الانصهار يسمح للبروتين أن أعرب على مستوى عال إلى حد معقول. باستخدام السلبية تلطيخ انتقال المجهر الإلكتروني وحجم الاستبعاد اللوني، لقد أظهرنا سابقا أن البروتين MBP الانصهار يشكل الأوليغومرات موحدة في المختبر 18. فمن الممكن أن للطي وoligomerization من Mgm101 قد يكون أبطأ في الخلايا البكت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
نشكر يلكنز ستيفان لمساعدة في انتقال المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AG023731.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ناقل التعبير pMAL-c2E | نيو إنجلاند بيومختبرس | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | # 27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus (DE3) -RIL cells | Strategene | # 230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | # 11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied | Science # 11359053001 | |
| فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) | روش العلوم التطبيقية | # 10837091001 | |
| DNAse I | سيجما | #DN25-1G | |
| الأيزوبروبيل &# 946 ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) روش | العلوم التطبيقية | # 11411446001 | |
| راتنج الأميليوز | نيو إنجلاند بيولوجيس | #E8021L | |
| عمود كروماتوغرافيا Econo-Column | BIO-RAD | # 7372512 | |
| خرطوشة Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 مل) | BIO-RAD | # 732-4130 | |
| VIVASPIN 15R عمود تدور الترشيح الفائق (10،000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 عمود الصف الإعدادي | Amersham Bioscirnces | # 17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 عمود تدور الترشيح الفائق (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
المراجع
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli r....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
