يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحكمة البروتين: A منضدة لل

16.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50476

⸱

يوليو 25, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

في هذه المقالة

ملخص

لقد طورنا طرقا حسابية لتصميم البروتين من جديد قادرة على معالجة العديد من المجالات المهمة لتصميم البروتين. لنشر هذه الأساليب ، نقدم Protein WISDOM ، وهي أداة عبر الإنترنت لتصميم البروتين (http://www.proteinwisdom.org). بدءا من قالب هيكلي ، يمكن إجراء تصميم البروتينات الأحادية لزيادة الاستقرار والمجمعات لزيادة تقارب الربط.

الملخص

والهدف من تصميم دي نوفو البروتين هو العثور على سلاسل الأحماض الأمينية التي سوف أضعاف في هيكل 3 الابعاد المطلوب مع تحسينات في خصائص معينة، مثل تقارب ملزمة، ناهض أو السلوك خصم، أو الاستقرار، نسبة إلى التسلسل الأصلي. تصميم البروتين تقع في مركز التقدم الحالي تصميم المخدرات والاكتشاف. ليس فقط تصميم البروتين توفير تنبؤات للأهداف المخدرات يمكن أن تكون مفيدة، ولكن أيضا لأنه يعزز فهمنا للعملية طي البروتين والبروتين البروتين التفاعلات. وقد أظهرت الطرق التجريبية مثل التطور الموجه النجاح في تصميم البروتين. ومع ذلك، وتقتصر هذه الأساليب من خلال مساحة محدودة تسلسل التي يمكن البحث فيها tractably. في المقابل، يسمح تصميم الاستراتيجيات الحسابية لفحص مجموعة أكبر بكثير من تسلسل تغطي مجموعة واسعة من الخصائص والوظائف. وقد وضعنا مجموعة من الحسابية دي نوفو البروتين تصميم methoDS قادرة على معالجة العديد من المجالات الهامة من تصميم البروتين. وتشمل هذه التصميم من البروتينات أحادى لزيادة الاستقرار والمجمعات لزيادة تقارب ملزمة.

لنشر هذه الأساليب لتوسيع نطاق استخدام نقدم الحكمة البروتين ( http://www.proteinwisdom.org )، وهي الأداة التي توفر أساليب الآلي لمجموعة متنوعة من مشاكل التصميم البروتين. اتخاذ القوالب الهيكلي لتهيئة عملية التصميم. المرحلة الأولى من التصميم هو تسلسل مرحلة الاختيار الأمثل الذي يهدف إلى تحسين الاستقرار من خلال التقليل من الطاقة الكامنة في الفضاء تسلسل. ثم يتم تشغيل تسلسل المحدد من خلال مرحلة خصوصية أضعاف، ومرحلة تقارب ملزمة. قائمة متفاوت المراتب للتسلسل لكل خطوة من العملية، جنبا إلى جنب مع الهياكل المصممة ذات الصلة، ويوفر للمستخدم مع تقييم كمي شامل للتصميم. نحن هنا تقديم التفاصيل Oو كل أسلوب التصميم، فضلا عن العديد من النجاحات البارزة التجريبية يتحقق من خلال استخدام الأساليب.

المقدمة

< p class = "jove_content" > تصميم البروتين الجديد هو تحديد تسلسل البروتين الذي سينتج عنه بنية ثلاثية مرغوبة مع خصائص أو وظيفة محسنة. نظرا لأن الطية الأصلية للبروتين هي التشكل الذي يقع عند الحد الأدنى من الطاقة الحرة ، فإن تصميم بروتين de novo يبحث عن تسلسلات سيكون لها حد أدنى من الطاقة الحرة في الطية المستهدفة. تم وصف هذه المشكلة لأول مرة بواسطة Drexler1 و Pabo2 وكان يشار إليها باسم "مشكلة الطي العكسي". ومع ذلك ، على عكس مشكلة طي البروتين ، حيث يمكن أن ينتج عن التسلسل حل هيكل مطوي واحد فقط ، فإن مشكلة تصميم البروتين دي نوفو تظهر انحطاطا. يمكن أن ينتج عن العديد من تسلسلات الأحماض الأمينية المختلفة نفس الهيكل والوظيفة الثلاثية.

بينما تم إجراء تصميم البروتين تقليديا تجريبيا من خلال التصميم العقلاني والتطور الموجه ، فقد تم استخدام الأساليب الحسابية مؤخرا للتغلب على مساحة البحث المحدودة المتأصلة في الطرق التجريبية. تم استخدام مجموعة متنوعة من الطرق الحسابية ، بما في ذلك الطرق الحتمية والطرق العشوائية والطرق الاحتمالية. 3،4 استخدمت الطرق الحسابية المبكرة قوالب العمود الفقري الثابت لتسهيل حل المشكلة. 5-7 مع ظهور معالجات أسرع وحوسبة عالية الأداء وخوارزميات أكثر كفاءة ، تم دمج مرونة العمود الفقري باستخدام مجموعة من قوالب العمود الفقري الثابت8-14 أو من خلال دمج مرونة العمود الفقري الحقيقية من خلال التعبير عن القالب من حيث نطاقات المسافات من ذرة إلى ذرة وزوايا ثنائية السطوح. 15,16

تصف هذه الورقة بالتفصيل Protein WISDOM ، وهي أداة عبر الإنترنت تم إتاحتها للمجتمع الأكاديمي للاستفادة من إطار تصميم البروتين الحسابي من جديد. تم تطبيق هذا الإطار على تصميم العديد من البروتينات ، للاستخدام العلاجي الذي يستهدف أمراضا مثل فيروس نقص المناعة البشرية والسرطان والأمراض التكميلية واضطرابات المناعة الذاتية الأخرى. تم التحقق من صحة العديد من الببتيدات المتوقعة تجريبيا ، مما يدل على قوة الطريقة. يقدم الجدول 1 ملخصا للبروتينات المختلفة التي تم تصميمها بما في ذلك حجم البروتين أو الببتيد وعدد التنبؤات والتحقق التجريبي.

تصميم البروتين طول البروتين # من التنبؤات الحسابية # من التحقق من الصحة التجريبية مرجع تصميم التسلسل الكامل لبيتا ديفينسين -2 البشري 41 340 ريال   (17) مثبطات كومبستاتين من C3 البشري 13 28 3/3 (18 ، 19) نظائر كومبستاتين التي ترتبط بالفئران C3c 13 5   (20) نظائر كومبستاتين مع امتداد ثنائي سيرين 15 8     هيكل تثبيت التناظرية للكومبستاتين W4A9 13 18     منبهات ومضادات مستقبلات C3a 77 20 4/7 (21) ناهضات ومضادات مستقبلات C5a 74 61 2/61   مثبطات فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp14 12 6 4/5 (22) مثبطات فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120 9 14     مثبطات Bak ل Bcl-x L و Bcl-2 16-18 10 5/5 (23) مثبطات ERK2 11 25     مثبطات EZH2 21 17 10/10 (24) مثبطات LSD1 و LSD2 16 41 17/20   مثبطات HLA-DR1 13 6   (25) مثبطات PNP 5 13     < p class = "jove_content" > الجدول 1. ملخص البروتينات والببتيدات المصممة باستخدام إطار تصميم بروتين دي نوفو. يتم تقديم # التنبؤات الحسابية على أنها عدد التنبؤات المواتية (أي خصائص الطي فوق قطع معين أو تقاربات ربط تقريبية أكبر من التسلسل الأصلي). يعطي # من عمليات التحقق التجريبية رقمين: الأول هو عدد التنبؤات التي تم التحقق من صحتها تجريبيا بينما الثاني هو العدد الإجمالي للتنبؤات التي تم اختبارها تجريبيا.

< p class = "jove_content" >تم تنفيذ تصميم إنسان بيتا ديفينسين -2 (hβD-2) لتعزيز خاصية الببتيد المضادة للميكروبات. 17 بالنسبة لهذا التصميم ، نظرنا في حالتين: 1) ما يصل إلى 10 طفرات على طول hβD-2 و 2) تصميم التسلسل الكامل لجميع مواضع بقايا hβD-2 باستثناء السيستين (8 و 15 و 20 و 30 و 37 و 38). تم استخدام ثلاثة قوالب تصميم مختلفة وثلاثة نماذج مختلفة لاختيار التسلسل في التصميم. لوحظت مستويات عالية من التشابه في الطفرات بين المتوسط المرجح ونماذج صندوق المسافة لكل من تصميم الطفرات ال 10 وتصميم التسلسل الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على عدد كبير من التسلسلات لها قيم خصوصية أضعاف محسوبة أكثر ملاءمة من التسلسل الأصلي.

< p class = "jove_content" >تم تصميم مثبطات النظام التكميلي (من C3 و C3a و C5a) لمكافحة عدد من الأمراض المناعية مثل السكتة الدماغية والنوبات القلبية ومرض الزهايمر والربو والتهاب المفاصل الروماتويدي ورفض زرع الأعضاء وأمراض الجهاز التنفسي للبالغين والصدفية ومرض كرون. تم التحقق من صحة ثلاثة مثبطات كومبستاتين ل C3c التي تنبأ بها إطار تصميم البروتين بالإضافة إلى ثلاثة تسلسلات مصممة بشكل عقلاني تجريبيا لتكون مواد رابطة أفضل من الكوبستاتين الأصلي. 18,19

< p class = "jove_content"> فحصت دراسات أخرى فقدان نشاط الكوبستاتين ضد C3c غير الرئيسيات وصممت عددا من مثبطات C3c المرشحة للفئران والفئران. تبين أن خمسة تسلسلات لها طاقات حرة أكثر ملاءمة مع الفئران C3c من طفرة كومبستاتين W4A9 المعروفة بتثبيط C3c. ويرجع ذلك إلى تشكيل جسر ملحي جديد بواسطة Arg1. 20 تم توقع أن تكون ثمانية تسلسلات ذات امتداد طرفي N مجلدات أفضل من W4A9 مع امتداد ثنائي سيرين. أخيرا ، تم توقع 18 تسلسلا من كومبستاتين لتثبيت التشكل المرتبط ل W4A9 ، مما يوفر مرشحين أقوياء لمثبطات C3c للرئيسيات وغير الرئيسيات.

< p class = "jove_content">بالإضافة إلى مثبطات C3c ، تم تصميم ناهضات ومضادات مستقبلات C3a و C5a بناء على هياكل C3a و C5a. تم اختبار سبعة تسلسلات C3a تنبأ بها النموذج تجريبيا. كان اثنان من التسلسلات ناهضين قويين بينما كان اثنان آخران ناهضين جزئيين. 21 أظهر الناهضان القويان تحسنا بمقدار 58 ضعفا مقارنة ب "ناهض فائق" تم اكتشافه سابقا. قدم تصميم ناهضات ومضادات مستقبلات C5a مجموعة من 61 تسلسلا. تم تصنيع جميع التسلسلات ووجد أن اثنين منبهات C5a الجديدة.

< p class = "jove_content" > تم تصميم مثبطات الاندماج لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، الفيروس المسبب لمرض الإيدز ، لمنع فيروس نقص المناعة البشرية -1 من إصابة الخلايا. استهدف التصميم الأول gp41 ، وهو مغلف بروتين سكري لفيروس نقص المناعة البشرية -1. تنبأ إطار تصميم البروتين بستة تسلسلات كانت روابط أفضل من التسلسل الأصلي. تم التحقق من صحة أربعة من هذه التسلسلات المتوقعة تجريبيا لتثبيط فيروس نقص المناعة البشرية -1 مع أفضل تسلسل يحتوي على IC50 منخفضا يصل إلى 29 ميكرومتر. أظهر هذا التسلسل تحسنا بمقدار 3-15 ضعفا على التسلسل الأصلي ولم يكن لديه أي فقدان للنشاط ضد سلالة الفيروس المقاومة للإنفوفيرتيد. 22 استهدف التصميم الثاني gp120 ، وهو مغلف آخر للبروتين السكري لفيروس نقص المناعة البشرية -1. تم التنبؤ بأربعة عشر تسلسلا لتكون روابط gp120 وتوفر مثبطات اندماج محتملة إضافية لفيروس نقص المناعة البشرية -1.

قدمت العديد من البروتينات المرتبطة بالسرطان أهدافا واعدة لعلاجات السرطان. Bcl-2 و Bcl-xL هي بروتينات مضادة لموت الخلايا المبرمج تمنع موت الخلايا. تم تصميم مثبطات هذين البروتينين للحث على موت الخلايا في الخلايا السرطانية. تم التنبؤ بأن تكون عشرة تسلسلات أفضل من الروابط الأصلية ، والتقطت هذه النتائج النتائج التجريبية السابقة والطفرات. 23 بروتين مستهدف آخر ، ERK2 ، يشارك في شلالات نقل الإشارات التي تجعله هدفا واعدا لعلاجات السرطان المضادة للتكاثر. تم التنبؤ بأن يكون خمسة وعشرون تسلسلا مثبطات ل ERK2.

هيستون ميثيل ترانسفيراز وديميثيلاز تتحكم ديناميكيا في مثيلة هيستون ، والتي تم ربطها بالعديد من أنواع السرطان بما في ذلك البروستاتا والثدي وسرطان الغدد الليمفاوية والورم النخاعي والمثانة والقولون والجلد والكبد وبطانة الرحم والرئة والمعدة. حدد إطار تصميم البروتين de novo 17 مثبطا ل EZH2 (Lysine methyltransferase) ومن بين العشرة التي تم اختبارها تجريبيا ، وجد أن جميعها تثبط EZH2. 24 كان الببتيد الأكثر فعالية يحتوي على IC50 يبلغ حوالي 13 ميكرومتر ، وكان فعالا بنفس القدر مع تركيزات الإنزيم المرتفعة ، ولم يتنافس مع العامل المساعد. كانت هذه الببتيدات هي المجموعة الأولى من مثبطات EZH2. تم التنبؤ ب 53 مثبطا ل LSD1 (demethylase) بواسطة الإطار ومن بين 20 تم اختبارها تجريبيا ، كان 17 مثبطا ل LSD1 و 18 كانوا مثبطات ل LSD2. كانت أفضل المثبطات تحتوي على قيم IC50 أقل من 1 ميكرومتر ، مما يجعلها أقوى مثبطات الببتيد المكتشفة حتى الآن.

قدم نظاما البروتين الأخيران أهدافا لعلاج أمراض المناعة الذاتية المختلفة مثل مرض الاضطرابات الهضمية ، وداء السكري من النوع 1 ، والذئبة الحمامية الجهازية ، ومتلازمة شوغرن ، ومتلازمة شيرج ستروس ، والتهاب الغدة الدرقية هاشيموتو ، ومرض جريفز ، وفرفرية نقص الصفيحات مجهولة السبب ، والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والحساسية. لم يتم التحقق من صحة أي من هذه المثبطات المحتملة تجريبيا ، ومع ذلك تنبأ إطار العمل بستة تسلسلات ترتبط ب HLA-DR1 و 13 تسلسلا ترتبط ب PNP.

يلخص الجدول 2 المثبطات والناهضات التي تم التحقق من صحتها تجريبيا والتي تم التنبؤ بها باستخدام إطار تصميم بروتين دي نوفو. تم استخدام مقياس تقارب الارتباط التقريبي للتنبؤ بتسعة من التسلسلات (مثبطات C3c البشري ، HIV-1 gp41 ، EZH2 ، LSD1 ، و LSD2) ، بينما تم استخدام مقياس خصوصية الطية لتحديد أربعة من التسلسلات (ناهضات / مضادات C3aR). تسلط هذه الببتيدات الضوء على نجاح إطار تصميم البروتين دي نوفو ، ولا سيما مقياس تقارب الربط التقريبي المضاف. الإطار متعدد الاستخدامات للغاية في قابليته للتطبيق. تم تصميم ستة بروتينات مختلفة مرتبطة بخمسة وعشرين مرضا مختلفا بنجاح والتحقق من صحتها تجريبيا.

<حدود الجدول = "1" cellpadding = "1" cellspacing = "1" الارتفاع = "147" العرض = "856"> اسم آي سي 50 إي سي 50 هدف البروتين الأمراض القابلة للتطبيق س 027 0.94 ميكرومتر   الإنسان C3c السكتة الدماغية ، النوبة القلبية ، مرض الزهايمر ، الربو ، التهاب المفاصل الروماتويدي ، الذئبة الحمامية الجهازية ، التصلب المتعدد ، الصدفية ، مرض السكري من النوع الأول ، مرض كرون ، التهاب البنكرياس ، والتليف الكيسي sq086 1.98 ميكرومتر   الإنسان C3c sq059 4.73 ميكرومتر   الإنسان C3c SQ110-4   15.2 نانومتر C3aR SQ060-4   36.4 نانومتر C3aR SQ007-5 15.4 نانومتر   C3aR SQ002-5 26.1 نانومتر   C3aR sq435 29 - 253 ميكرومتر   فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp41 الإيدز sq037 13.57 ميكرومتر   EZH2 البروستاتا والثدي وسرطان الغدد الليمفاوية والورم النخاعي والمثانة والقولون والجلد والكبد وبطانة الرحم والرئة وسرطان المعدة sq011-1 0.521 ميكرومتر   LSD1 SQ016-1 0.249 ميكرومتر   LSD1 س 026-1 2.51 ميكرومتر   إل إس دي 2 س 015-1 1.332 ميكرومتر   إل إس دي 2 < p class = "jove_content" > الجدول 2. الببتيدات المتوقعة حسابيا والتحقق من صحتها تجريبيا والتي تستهدف أمراضا مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

نظرة عامة على الطريقة

يتكون إطار تصميم de novo المستخدم في Protein WISDOM من مرحلتين. تنتج المرحلة الأولى قائمة مرتبة تنازلياً من تسلسلات الأحماض الأمينية التي ستنطوي لتشكل بنية قالب محددة. وتتحقق المرحلة الثانية من هذه التسلسلات عن طريق حساب خصوصية الانطواء أو تقريب ألفة الارتباط، أو كليهما. يُستخدم الإجراء الأول بشكل أساسي عندما يكون التصميم لبروتين واحد، بينما يُستخدم الثاني عندما يكون التصميم لمعقد (ببتيد يرتبط ببروتين مستهدف). يوضح الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا الإطار.

مدخلات التصميم: يجب تحديد عدد من المدخلات لإطار عمل تصميم البروتين de novo. أولها هو قالب التصميم، وهو عبارة عن بنية بروتينية ثلاثية الأبعاد (3D) تحتوي على إحداثيات لجميع الذرات في البروتين. يمكن أن تكون البنية صلبة أو مرنة؛ حيث تُمثل القوالب الصلبة مجموعة من إحداثيات الذرات الثابتة ويتم الحصول عليها من بنيات علم البلورات بالأشعة السينية. أما القوالب المرنة، فيمكن أن تكون مجموعة من إحداثيات الذرات الثابتة أو حدوداً عليا ودنيا لإحداثيات الذرات. ويمكن الحصول على هذه القوالب من بنيات المحلول بالرنين المغناطيسي النووي NMR، أو الديناميكا الجزيئية، أو محاكاة الالتحام الجزيئي.

يُستخدم قالب التصميم لإنشاء مجموعة الطفرات المسموح بها للبروتين المصمم. وتحدد هذه المجموعة المواقع في التسلسل التي يمكن أن تطرأ عليها طفرات وإلى أي أحماض أمينية. يتم إنشاء مجموعة الطفرات عن طريق حساب مساحة السطح المعرضة للمذيب (SASA) لكل ثمالة في قالب التصميم. إذا كانت الثمالة معرضة للمذيب بنسبة تزيد عن 50%، يُسمح بمجموعة من الأحماض الأمينية المحبة للماء (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T). وإذا كانت الثمالة معرضة للمذيب بنسبة أقل من 20%، يُسمح بمجموعة من الأحماض الأمينية الكارهة للماء (A, F, I, L, M, V, W, Y). أما إذا كانت نسبة تعرض الثمالة تقع بين 20% و50%، فتُسمح جميع الأحماض الأمينية. وعادةً ما يُستثنى السيستين من مجموعة الطفرات ما لم تعتبر البيانات التجريبية أو الدراسات المرجعية وجوده مناسباً. أما الأحماض الأمينية الصغيرة (A, G, T) فغالباً ما يتم إدراجها في جميع مجموعات الطفرات. وعند توفرها، يمكن استخدام الرؤى التجريبية أو المرجعية لتعديل مجموعات الطفرات لمواقع أحماض أمينية محددة يدوياً.

يتم اختيار حقل قوة لحساب طاقة التفاعل الزوجية للتسلسلات في قالب التصميم. وبينما يمكن تكييف أي حقل قوة ليتم استخدامه ضمن هذا الإطار، فقد تم تطوير حقلي قوة يعتمدان على المسافة ويُستخدمان على نطاق واسع في إطار التصميم de novo. الأول هو حقل قوة عالي الدقة من نوع Cα-Cα،26 حيث تكون المسافات بين ذرات الكربون Cα في الثمالات. والثاني هو حقل قوة عالي الدقة من نوع centroid-centroid27 حيث تكون المسافات بين المراكز الثقلية للثمالات. وقد استُمدت معاملات الطاقة في حقول القوة عن طريق حل مشكلة تقدير معاملات البرمجة الخطية، والتي تطلبت أن تكون نماذج الخداع (decoys) عالية الدقة ذات الطاقة المنخفضة لمجموعة تدريب كبيرة من البروتينات أقل تفضيلًا من الناحية الطاقية من تشكلاتها الأصلية. وقد تم اختبار والتحقق من صحة كل من حقل قوة centroid-centroid عالي الدقة وحقل قوة Cα-Cα في دراسات سابقة على beta-defensin-2 البشري.17 ويتم دمج المرونة الحقيقية للعمود الفقري في النموذج عن طريق تقسيم حقول القوة إلى فئات مسافات (distance bins). حيث ستتوافق المسافة بين زوج من الأحماض الأمينية مع فئة مسافة تعطي نفس قيمة الطاقة لمجموعة من المسافات، مما يتيح لنموذج تحسين اختيار التسلسل مراعاة حركة العمود الفقري.

يمكن للمستخدم إدراج القيود البيولوجية، سواء كانت قيوداً على الشحنة أو قيوداً على المحتوى، يدوياً كمدخلات تصميم إضافية. تحدد قيود الشحنة شحنة معينة أو نطاقاً من الشحنات التي يجب استيفاؤها في التسلسل المصمم أو في جزء منه. وتُحسب الشحنة على أنها مجموع البقايا موجبة الشحنة (K و R) مطروحاً منها مجموع البقايا سالبة الشحنة (D و E). أما قيود المحتوى فتحدد الحدود العليا والدنيا لتكرار حمض أميني معين في التسلسل. وعادةً ما يتم تعريف القيود البيولوجية من خلال محاذاة تسلسل مكثفة مع التسلسل الأصلي، وذلك لرصد الحدود البيولوجية المعروفة للشحنة ومحتوى الأحماض الأمينية المتمثلة في الطبيعة لعائلة من البروتينات. كما يتم تعريف قيود إضافية يدوياً من خلال تحليل البيانات التجريبية المعروفة.

المرحلة الأولى: اختيار التسلسل: طوّر Klepeis et al.15,16 في البداية طريقة اختيار التسلسل الأصلية، حيث تقوم هذه الطريقة باختيار وترتيب تسلسلات الأحماض الأمينية وفقاً لطاقاتها في قالب التصميم باستخدام نموذج التحسين الخطي الصحيح (ILP). تم تحسين هذه الطريقة لاحقاً باستخدام نموذج اختيار تسلسلات أكثر كفاءة من الناحية الحسابية للقوالب الصلبة (المنفردة)، وجرى توسيعها من خلال تطوير نماذج للقوالب المرنة. لا تعتمد طريقة التحسين الشامل هذه على الطفرات العشوائية، وهي مضمونة نظرياً من حيث البحث في كامل حيز التسلسلات وتحديد الحل الشامل، وهذا يعد ميزة رئيسية لمنهجنا مقارنة بجميع المناهج الأخرى الموجودة.

نموذج البنية الواحدة: لقد تم تحسين الصيغة الأصلية لنموذج اختيار التسلسل الذي اقترحه Klepeis et al.15,16 بشكل أكبر بواسطة Fung et al.28 وصيغته النهائية موضحة في المعادلة 1.

مسألة تحسين تتضمن معادلات وقيود؛ تحسين رياضي، رموز رمزية.
تحدد المجموعة i=1,...,n مواقع البقايا في قالب التصميم. وفي كل موقع i، تُمثل الطفرات بـ j{i}=1,...,mi، حيث mi=20 إذا كان الموقع i مسموحاً له بالطفرة إلى أي من الأحماض الأمينية الطبيعية العشرين. تُستخدم مجموعات الأسماء المستعارة k≡i و l≡j، مع k>i، لتمثيل جميع التفاعلات الزوجية الفريدة. تم إدخال المتغيرات الثنائية yj السفلية i العلوية j، تدوين رياضي، متغيرات في المعادلات. و تدوين المشتقة الأولى y'_k، معادلة، مفهوم في التفاضل والتكامل، صيغة تعليمية. لنمذجة طفرات الأحماض الأمينية. وسيتخذ المتغير yj السفلية i العلوية j، تدوين رياضي، متغيرات في المعادلات. القيمة واحد إذا قام النموذج بتعيين الحمض الأميني j للموقع i، والقيمة صفر خلاف ذلك (وبالمثل بالنسبة لـ تدوين المشتقة الأولى y'_k، معادلة، مفهوم في التفاضل والتكامل، صيغة تعليمية. ). تُمثل دالة الهدف مجموع كافة تفاعلات الطاقة الزوجية في قالب التصميم. أما المعامل مثال على تدوين الموتّر في الجبر التجريدي؛ تعبير رياضي يوضح تدوين المؤشر.، وهو يمثل تفاعل الطاقة بين الموقع i الذي يشغله الحمض الأميني j والموقع i الذي يشغله الحمض الأميني l، فيعتمد على المسافة بين كربونات α أو مراكز السلاسل الجانبية في الموقعين (xi,xj,) بالإضافة إلى نوع الأحماض الأمينية j و l. ولا يساهم هذا المعامل في دالة الهدف إلا إذا كان كل من yj السفلية i العلوية j، تدوين رياضي، متغيرات في المعادلات. و تدوين المشتقة الأولى y'_k، معادلة، مفهوم في التفاضل والتكامل، صيغة تعليمية. مساوياً للواحد.

وجد Fung et al.28 أن الصيغة (1) أكثر كفاءة حسابياً بشكل ملحوظ من اثني عشر نموذجاً مكافئاً آخر مشابهاً لنماذج التعيين التربيعي لاختيار التسلسل.28,29 وعلى وجه الخصوص، تفوقت هذه الصيغة على النموذج الأصلي الذي اقترحه Klepeis et al.15,16 في مشكلتين لاختيار تسلسل beta-defensin-2 البشري: إحداهما بمستوى تعقيد 3.4x1045 والأخرى بمستوى 6.4x1037 مع 49 قيداً بيولوجياً خطياً إضافياً. وقد وُجد أن النموذج الأصلي الذي اقترحه Klepeis et al.15,16 استغرق 53,263 ثانية من وحدة المعالجة المركزية (CPU) و 4,578 ثانية من وحدة المعالجة المركزية (CPU) على التوالي لحل المشكلتين وصولاً إلى الأمثلية العالمية باستخدام CPLEX 9.030 على معالج Pentium IV 3.2 GHz. بينما استغرقت الصيغة (1) فقط 649 ثانية من وحدة المعالجة المركزية (CPU) و 14 ثانية من وحدة المعالجة المركزية (CPU) لأداء المهام نفسها، وهو ما يقابل تحسناً في الكفاءة الحسابية بمقدار 82 ضعفاً و 327 ضعفاً.

نموذج المتوسط المرجح: قام Fung et al.28 بتطوير نموذجين للتعامل مع الحالة النموذجية لتصميم البروتين de novo، حيث يكون قالب التصميم مرناً ويحتوي على مجموعة من البنى. يستخدم نموذج المتوسط المرجح طاقة متوسطة مرجحة، صيغة التوازن الساكن ΣE_ik^jl(x_i,x_k)wt(x_i,x_k,d) معادلة، مفهوم رياضي. ، بدلاً من معلمة الطاقة مثال على تدوين الموتر في الجبر التجريدي؛ تعبير رياضي يوضح تدوين المؤشر.(xi,xk) في نموذج البنية الواحدة (المعادلة 1). يتم تحديد الأوزان wt(xi,xk,d) من خلال تكرارات المسافة بين xi و xk التي تقع ضمن نطاق المسافة d في بنى القالب. الصيغة النهائية لنموذج المتوسط المرجح موضحة في المعادلة 2.

معادلات مشكلة التحسين؛ نموذج البرمجة الخطية؛ القيود والمتغيرات الثنائية؛ الصياغة الرياضية.
نموذج فئات المسافات (Distance Bin Model): يدمج نموذج اختيار التسلسل الثاني لهياكل القوالب المرنة معلومات المسافة من الهياكل المتعددة من خلال إدخال متغير ثنائي bikd. وتكون قيمة هذا المتغير واحد إذا كانت المسافة بين xi و xk تقع ضمن فئة المسافة d، وتكون صفراً في خلاف ذلك. كما تم إدخال معلمة أخرى، disbin(xi, xk, d)، والتي تساوي واحداً إذا كانت المسافة بين xi و xk في أي من هياكل القوالب تقع ضمن فئة المسافة d وتكون صفراً في خلاف ذلك. وبما أن فئة مسافة واحدة فقط لكل زوج من الأحماض الأمينية ستساهم في الطاقة الكلية، فإن مثال على تدوين الموتر في الجبر التجريدي؛ تعبير رياضي يوضح تدوين المؤشر. في دالة الهدف تُستبدل بـ مخطط المعادلة الرياضية Σ E(x)؛ التوازن الاستاتيكي، صيغة الجمع للتحليل البحثي.. ومع ذلك، فإن هذا يؤدي إلى إدخال اللاخطية في دالة الهدف. ويمكن العثور على تفاصيل إضافية حول جعل النموذج خطياً والقيود الإضافية التي يجب إضافتها لتحقيق الجدوى في دراسة Fung et al.28 ويرد نموذج فئات المسافات في المعادلة 3.

معادلات مشكلة الأمثلة؛ نموذج البرمجة الخطية؛ القيود والمتغيرات الثنائية؛ الصيغة الرياضية.
يمكن حل أي من مشكلات البرمجة الخطية الصحيحة (ILP)15-17 المذكورة أعلاه بدقة باستخدام تقنيات الفرع والحد (branch-and-bound).28-30 وتضمن هذه التقنيات تقارباً متسقاً وموثوقاً للوصول إلى تسلسل الطاقة الأدنى العالمي.

المرحلة الثانية: التحقق من الصلاحية: الشكل 2 يقدم نظرة عامة مفصلة عن نهجي المرحلة الثانية. يوضح الشكل الخطوات المطلوبة لحساب مقياس التصنيف النهائي وعدد الهياكل التي تم إنتاجها في كل خطوة.

خصوصية الطي: خصوصية الطي هي مقياس يُستخدم لتصنيف التصاميم الأولية المستمدة من المرحلة الأولى. والهدف من هذا الحساب هو معرفة مدى كفاءة طي كل تتابع في بنية القالب مقارنة بالتتابع الأصلي للقالب، وذلك بناءً على حسابات الطاقة. وهناك نهجان للقيام بذلك، ولكل منهما متطلبات حسابية مختلفة.

نُفِّذ النهج الأول بواسطة Klepeis وآخرون.15,16 يستخدم هذا النهج إطار عمل ASTRO-FOLD للتنبؤ ببنية البروتين، 26,27,31-47 والذي يعتمد على الأمثلة العالمية الحتمية. لا يُستخدم هذا النهج حالياً في تنفيذ Protein WISDOM نظراً لمتطلباته الحسابية العالية جداً. وإدراكاً لمحدودية الموارد الحسابية والحاجة إلى إجراء هذه العملية الحسابية على مئات أو آلاف التسلسلات المحتملة في التصميم، قام Fung وآخرون.17 اقترح نهجاً أكثر كفاءة باستخدام TINKER/CYANA.48-50 يتضمن هذا النهج تحديد قالب مرن للبنية. ويمكن تحديد القالب المرن باستخدام حدود عليا ودنيا للمسافات بين ذرات الكربون (C)ألفا الذرات، بالإضافة إلى زاويتي ϕ و ψ للبقايا. بالنسبة لبنية واحدة، تُستخدم المسافات والزوايا ثنائية السطح الأولية، وتُحدد الحدود إما كمسافة ثابتة أو كنسبة مئوية. الحدود الافتراضية هي ±10% لـ Cα مسافات أو ±10° لحدود الزاوية ثنائية السطح. وبالنسبة للقالب المرن، يمكن الحصول على الحدود من القيم القصوى والدنيا المرصودة عبر جميع هياكل القوالب المقدمة كمدخلات للتصميم. وبمجرد تحديد الحدود الأولية لكل تسلسل، يتم توليد مجموعات تحتوي على مئات التشكلات باستخدام برنامج CYANA 2.1.48,49يتم توليد المتشكلات باستخدام بروتوكول التلدين المحاكى لديناميكا زاوية الالتواء في برنامج CYANA، والذي يعمل على تسخين البروتين بسرعة ثم تبريده ببطء، مع تتبع التشكيلات التي تم أخذ عينات منها. وبعد التلدين المحاكى، يتم إجراء تقليل موضعي للطاقة يقلل من التصادمات الناتجة عن تداخل أنصاف أقطار فان دير فالس، بالإضافة إلى انتهاكات قيود المسافة والزاوية. ويتم توليد 500 بنية نهائية بشكل افتراضي، حيث تخضع كل بنية في المجموعة لكل تسلسل لعملية تقليل موضعي في برنامج TINKER 3.6.50 باستخدام حقل القوة AMBER.51 تُدرج طاقة الوضع النهائية لكل بنية مُقلصة في جدول. يُنفذ هذا النهج الشامل للتسلسل البادئ وكذلك لكل تسلسل طافر مرشح. بعد ذلك، يمكن حساب خصوصية الطي لكل تسلسل طافر تجاه الطي المستهدف بالنسبة للتسلسل الأصلي باستخدام توزيع بولتزمان التالي (المعادلة 4).

معادلة التوازن الساكن Σ(e^(-βEi)) للحالات الأصلية والمستحدثة؛ صيغة رياضية.
ألفة الارتباط التقريبية: تُستخدم طريقة حساب ألفة الارتباط التقريبية لترتيب التسلسلات المصممة التي تكون في معقد مع البروتين المستهدف. يمكن إجراء هذه الحسابات على التسلسلات الناتجة مباشرة من المرحلة الأولى أو يمكن إجراؤها على التسلسلات ذات النوعية العالية للطي التي تم الحصول عليها من خطوة نوعية الطي.

اقترح Lilien et al.52 منهجية لحساب تقريبيات ألفة الارتباط لمعقدات البروتين والرابطة (protein-ligand complexes). وتعتمد هذه المنهجية على إنشاء مجموعات قائمة على المدوّرات (rotamerically-based ensembles) للبروتين، والرابطة، ومعقد البروتين والرابطة، واستخدام تلك المجموعات لحساب دالات التجزئة (partition functions). ويُرمز لألفة الارتباط التقريبية هذه بالرمز K* وتُعرّف وفقاً للمعادلة 5.

هنا سفوسفوليبيد هي دالة التقسيم لمعقد البروتين والرابط، سb هي دالة التجزئة للبروتين الحر، و سلـ هي دالة التجزئة للرابطة الحرة. وتُعرَّف دوال التجزئة في المعادلة 6، حيث تكون المجموعات ب، ف و لـ تتضمن التشكلات القائمة على الروتامر لمعقد البروتين والرابِط المرتبط، والبروتين الحر، والرابِط الحر، على التوالي. هـن طاقة التشكل ن، ر هو ثابت الغاز، و تـ هي درجة الحرارة.

Thermodynamic equilibrium equations; Σe^(-Eb/RT); scientific formula for internal energy.
تنبؤ بالبنية: لبدء الحساب K* ، ويجب توفير بنية ثلاثية الأبعاد لكل تسلسل. ويتم ذلك باستخدام وظيفة Rosetta AbRelax،53-55 جزء من حزمة برمجيات Rosetta 3.4. تعتمد الاستراتيجية الكامنة وراء خوارزمية AbRelax على الملاحظة التجريبية بأن البنية المحلية للبروتين تتأثر بالتتابع المحلي للبروتين ولكنها لا تتحدد به بشكل حصري. تُستخدم خوارزمية مونت كارلو لاستبدال البنيات البروتينية المحلية بقطع بنيوية مشتقة من التتابع. وتنتج هذه الطريقة البنيات البروتينية النهائية المدمجة التي تراعي التفاعلات غير المحلية، مثل الثمالات الكارهة للماء المدفونة، وخيوط بيتا المزدوجة، وتفاعلات السلاسل الجانبية المحددة.

التجميع: يتم بعد ذلك تجميع البنى المستمدة من AbRelax بناءً على زوايا φ وψ باستخدام OREO.56,57 وتوضح طريقة التجميع هذه بنى هيكلية ممثلة للمجموعة البنيوية بأكملها. يتم اختيار البنى المتوسطة من أكبر عشر مجموعات وبنية الطاقة الأدنى الإجمالية لعملية الإرساء على البروتين المستهدف. يوفر هذا 11 بنية هيكلية فريدة لكل تسلسل ببتيدي، مما يدمج مرونة الهيكل في عملية توليد المجموعة.

تنبؤ الالتحام: يتم إجراء التنبؤ بالالتحام باستخدام RosettaDock.58-60 لكل تسلسل، يتم إجراء التحام لكل بنية من بنيات الهيكل الببتيدي الـ 11 مقابل البروتين المستهدف. في هذه الحالة، وبما أن موقع الارتباط معروف، يتم وضع الببتيدات بالقرب من موقع الارتباط والسماح لها بالإزاحة بمقدار 3 Å عموديًا على موقع الارتباط، و8 Å موازيًا لموقع الارتباط، والدوران بزاوية 8°. يستخدم RosettaDock خوارزمية مونت كارلو لحركات الالتحام ذات الدقة المنخفضة والعالية. تنتج كل عملية التحام مجموعة كبيرة من بنيات المعقدات. تُستخدم المعقدات العشرة ذات الطاقة الأدنى في كل واحدة من عمليات التشغيل الـ 11 كبنيات بدائية في التوليد النهائي لمجموعة التشكيلات القائمة على الروتامير (110 بنية بدائية لكل تسلسل).

توليد المجموعة النهائية: يُستخدم RosettaDesign61 لتوليد المجموعة النهائية من التشكيلات القائمة على الروتاميرات، وذلك لإمكانية استخدامه في توليد عدد من البنى من خلال تعديل الروتاميرات في السلاسل الجانبية فقط عبر وظيفة fixbb. يتم تزويد RosettaDesign بعدد من البنى البادئة، وبالنسبة لكل بنية، يتم اختيار ثمالة عشوائياً وتغيير الروتامير الخاص بها من خلال خوارزمية مونت كارلو. وتتكرر هذه العملية حتى يتم محاولة آلاف الاستبدالات للروتاميرات، مما يؤدي إلى الحصول على تشكيل نهائي منخفض الطاقة يساهم بشكل كبير في دالة التقسيم.

لإنشاء مجموعة الببتيدات، تُستخدم البنى الببتيدية العشر ذات الطاقة الأدنى من كل مجموعة من أكبر عشر مجموعات، بالإضافة إلى البنى الببتيدية العشر ذات الطاقة الأدنى بشكل عام، كبنى بدائية لبرنامج RosettaDesign (إجمالي 110 بنية بدائية). ولكل بنية بدائية، يتم إنشاء 200 هيئة روتامرية، مما يعطي مجموعة نهائية مكونة من 22,000 بنية (المجموعة L في المعادلة 6). وتدمج هذه المجموعة كلاً من مرونة الهيكل الأساسي ومرونة الروتامر.

يتم توليد المجموعة المعقدة بطريقة مماثلة عن طريق أخذ الـ 110 هياكل بدائية من خطوة تنبؤ الالتحام (docking prediction) وتوليد 200 هيئة روتامر (rotamer conformers) لكل هيكل بدائي. يبلغ الحجم النهائي للمجموعة 22,000 هيكل (المجموعة B في المعادلة 6). وقد أُخذت المرونة في الاعتبار من خلال هياكل العمود الفقري الببتيدي المتنوعة المستخدمة، وتشكيلات الالتحام المختلفة، وهيئات الروتامر لكل هيكل بدائي.

يتم إنشاء مجموعة البروتينات عن طريق تشغيل برنامج RosettaDesign على بنية البروتين المستهدف فقط. في هذه الحالة، يتم إنشاء 2,000 تشكيل روتامير (rotamer conformations) للبنية البادئة الواحدة، وبالتالي يكون الحجم النهائي للمجموعة 2,000 بنية (قيمة F في المعادلة 6).

بروتين WISDOM

يُعد برنامج Protein WISDOM، وهو اختصار لـ Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules، أداة عبر الإنترنت تتيح للمجتمع الأكاديمي الوصول إلى إطار عملنا الخاص بتصميم البروتينات de novo بطريقة سهلة الاستخدام. ويمكن لهذا البرنامج التعامل مع العديد من أهداف التصميم الشائعة، بدءاً من تصميم سلاسل بروتينية مفردة لتبني طية قالب محددة، وصولاً إلى تصميم ببتيدات جديدة ترتبط ببروتين مستهدف. يصف القسمان التاليان قدرات Protein WISDOM فيما يتعلق بنوعين رئيسيين من مشكلات تصميم البروتينات. يطبق النوع الأول اختيار التسلسل لاختيار تسلسلات جديدة تكون مفضلة في قالب التصميم المعطى، ثم يستخدم خصوصية الطية للتحقق من صحة التسلسلات الجديدة. أما النوع الثاني فيستخدم اختيار التسلسل لاختيار تسلسلات جديدة لببتيد مرتبط في معقد، ثم يستخدم كلاً من خصوصية الطية وحسابات تقريبية لتقارب الارتباط للتحقق من صحة التسلسلات الجديدة.

تسجيل المستخدم

قم بزيارة صفحة الويب الخاصة بـ Protein WISDOM عبر الرابط http://www.proteinwisdom.org.

انقر فوق زر تسجيل دخول المستخدم في أعلى يمين الصفحة. انقر فوق "انقر هنا" للتسجيل.

قم بتعبئة المعلومات المتعلقة بعنوان البريد الإلكتروني واسم المستخدم المطلوب، ثم انقر فوق متابعة.

املأ المعلومات الإضافية المتعلقة بالاسم، والمؤسسة، والمجموعة، والعنوان. انقر على مربع الاختيار للموافقة على شروط الاستخدام. انقر على زر "إرسال التسجيل".

المرحلة الأولى: اختيار التسلسل

تقديم تسلسل البروتين وبنية (بنيات) القالب

انقر فوق زر تسجيل دخول المستخدم لبدء تجربة تصميم البروتين. تظهر للمستخدم "الصفحة الرئيسية للمستخدم" (الشكل 3) والتي تعرض عدد المهام التي قدمها، وعدد البنى (القوالب) التي قام بتحميلها، وقائمة بالبنى التي قام بتحميلها حتى الآن.

ابدأ مهمة تصميم جديدة بالنقر على "Create New Job". سيتم توجيه المستخدم إلى صفحة "Job Submission" (الشكل 4). قم بتسمية المهمة، وحدد ما إذا كانت تعتمد على مهمة سابقة (أي أنه يمكن استيراد قالب التصميم نفسه، ومجموعات الطفرات، والقيود البيولوجية إلى مهمة جديدة، ومع ذلك سيكون لدى المستخدم القدرة على تعديل مجموعات الطفرات والقيود البيولوجية). انقر على "continue".

قم برفع هيكل (أو هياكل) البروتين الخاصة بقالب التصميم (الشكل 5). يجب أن يكون هذا القالب بتنسيق بنك بيانات البروتين (PDB) القياسي. يمكن أن يكون القالب صلباً (مجموعة واحدة من الإحداثيات لكل ذرة) أو قالباً مرناً (نماذج متعددة، مثل تلك التي يتم الحصول عليها من هياكل الرنين المغناطيسي النووي NMR المحلولة). في حالة تصميم بروتين واحد، يجب أن يحتوي القالب على سلسلة واحدة فقط. يمكن للمستخدم رفع قالب جديد أو الاختيار من القوالب الموجودة التي سبق رفعها. يمكن اختيارياً تحديد معرف pdb الخاص بالقالب، في حال توفره. إذا تم رفع قوالب متعددة، تأكد من أن كل نموذج يبدأ بعبارة "MODEL #" وينتهي بعبارة "ENDMDL". تأكد من تعيين كل ثمالة بواسطة حمض أميني طبيعي. انقر فوق "Continue".

بعد رفع القالب بنجاح، سيعرض Protein WISDOM عدد البقايا والسلاسل والنماذج التي وجدها في القالب، وسيسرد التسلسل، ويطلب من المستخدم التحقق من القالب. قم بتأكيد بنية القالب إذا تم إدخالها بشكل صحيح، ثم انقر على "متابعة".

بمجرد تحميل القالب بنجاح وتأكيده، يتم توجيه المستخدم إلى "صفحة التحكم الرئيسية" (الشكل 6). في هذه الصفحة، يمكن للمستخدم عرض حالة المهمة، وتعديل مجموعات الطفرات والقيود البيولوجية، وإرسال المهمة للمرحلة الأولى: اختيار التسلسل. في هذه المرحلة، وبما أن المرحلة الأولى لم تكتمل بعد، لا توجد خيارات للمرحلة الثانية، حيث تظهر هذه الخيارات بمجرد توفر نتائج المرحلة الأولى.

اختيار مجموعات الطفرات

انقر على رابط "Mutation Sets" في "Main Control Page" لتحديد مجموعات الطفرات.

حدد البقايا التي سيُسمح بحدوث طفرة فيها، وحدد الأحماض الأمينية التي يُسمح لها بالتحول إليها (الشكل 7). بشكل افتراضي، يتم اختيار الأحماض الأمينية المسموح بها في أي موضع معين بناءً على مساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA). مجموعات الطفرات مطلوبة.

انقر على "حفظ التغييرات" بعد اختيار مجموعات الطفرات. يمكن للمستخدم اختيار الاستمرار في تحرير مجموعة الطفرات. عند الانتهاء من تحرير مجموعة الطفرات، انقر للعودة إلى "صفحة التحكم الرئيسية".

اختيار القيود البيولوجية

انقر فوق رابط "القيود البيولوجية" (Biological Constraints) في "صفحة التحكم الرئيسية" لتحديد القيود البيولوجية.

حدد قيود الشحنة أو محتوى الأحماض الأمينية عبر البروتين بأكمله أو جزء منه (الشكل 8).

حدد العدد الإجمالي للطفرات المسموح بحدوثها، إذا لزم الأمر. القيود البيولوجية اختيارية. انقر للعودة إلى "صفحة التحكم الرئيسية" عند الانتهاء.

تسليم المرحلة الأولى: اختيار التسلسل

انقر فوق رابط "Begin Stage 1" للانتقال إلى صفحة "Submit Stage 1".

حدد السلسلة المراد تصميمها (الشكل 9)، وعدد التسلسلات المراد إنشاؤها، ومجال القوة المعتمد على المسافة، والنموذج. في حال تصميم معقد والرغبة في إجراء حساب نوعية الطي (Fold Specificity)، يجب اختيار سلسلة واحدة فقط لتصميمها. إذا كان القالب المرفوع عبارة عن بنية واحدة، أو "قالب صلب"، فيُسمح فقط باستخدام نموذج البنية الواحدة (Single Structure). أما إذا كان القالب المرفوع مرناً، فيمكن للمستخدم الاختيار من بين النماذج الثلاثة: البنية الواحدة (Single Structure)، والمتوسط المرجح (Weighted Average)، وسلة المسافات (Distance Bin). يُرجى مراعاة التعقيد الحسابي لعملية التحسين التي سيتم حلها، حيث يوجد حد أقصى للتعقيد الحسابي المسموح به وهو 2025.

إرسال المهمة. يتم توجيه المستخدم مرة أخرى إلى "صفحة التحكم الرئيسية" (الشكل 10سيتم تحديث "حالة المهمة" للإشارة إلى التقدم الحالي للمهمة. وستصبح المهمة مقفلة أمام التعديل بعد الإرسال.

عند اكتمال المهمة، يتلقى المستخدم رسالة بريد إلكتروني تحتوي على النتائج، والتي تتكون من قائمة بالتسلسلات المصممة. كما يمكن عرض النتائج على "صفحة التحكم الرئيسية". ويظهر على الصفحة مربع خاص بالمرحلة الثانية: خصوصية الطي (Stage 2: Fold Specificity) لتمكين المستخدم من إجراء هذا التحقق.

المرحلة الثانية: حسابات خصوصية الطي

تقديم خصوصية الطي

انقر على "بدء المرحلة 2: خصوصية الطي" (Begin Stage 2: Fold Specificity) للدخول إلى صفحة "بناء المرحلة 2" (Build Stage 2). حدد الحدود العليا والدنيا لمسافة Cα-Cα من خلال تحديد عامل مرونة القالب (Template flexibility factor) إما كنسبة مئوية من المسافة أو كمسافة ثابتة. حدد الحدود العليا والدنيا للزوايا في زوايا العزم الثنائي φ وψ من خلال تحديد عامل مرونة القالب كنسبة مئوية. يرجى ملاحظة أنه عند استخدام قالب مرن، يتم اعتبار الحدود العليا والدنيا للمسافة كأقل وأعلى قيم للمسافة عبر جميع نماذج القوالب. وبالمثل، يتم أخذ الحدود العليا والدنيا للزوايا من أعلى وأقل قيم للزوايا عبر جميع النماذج.

انقر فوق زر "إرسال".

حدد عدد البنى لكل تسلسل يراد توليدها ثم انقر على "Continue". لاحظ أن هناك حداً أقصى يبلغ 500 بنية لكل تسلسل يمكن توليدها.

انقر على "متابعة" لتأكيد الرغبة في التقديم للتحقق من الطي. تظل المرحلة الأولى والمرحلة الثانية مغلقين أمام التعديل حتى يتم إكمال المرحلة الثانية.

عند اكتمال المهمة، يتم إرسال بريد إلكتروني إلى المستخدم يتضمن النتائج. يمكن عرض النتائج على Protein WISDOM في "صفحة التحكم الرئيسية" (الشكل 11). وهنا يمكن عرض وتنزيل الملفات النصية التي تحتوي على التسلسلات المصممة، وقيم الطاقة المقابلة من المرحلة الأولى، وقيم خصوصية الطي من المرحلة الثانية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمستخدم النقر على رابط "عرض النتائج" الذي يعرض جدولاً في المتصفح يحتوي على تصنيفات المرحلة الأولى وقيم الطاقة، وكذلك تصنيفات المرحلة الثانية وقيم خصوصية الطي.

المرحلة الثالثة: حسابات تقريبية لزيادة ألفة الارتباط لمعقدات البروتين-الببتيد

تقوم حسابات تقريب ألفة الارتباط (Approximate Binding Affinity) بحساب ألفة البروتين/الببتيد للرابط المصمم تجاه بقية المعقد. يمكن إجراء هذه الحسابات مباشرة بعد المرحلة الأولى، أو بعد إتمام حسابات خصوصية الطي (Fold Specificity).

انقر فوق "Sequence #" لاختيار التسلسل لبدء حساب تقريب ألفة الارتباط. سيتم توجيه المستخدم إلى صفحة "Select Sequence"، والتي تعرض قائمة بالتسلسلات المصممة إلى جانب ترتيبات اختيار التسلسل وتحديد الطي. يمكن اختيار تسلسل واحد فقط في كل مرة لحساب تقريب ألفة الارتباط، حيث أن هذه الحسابات تتطلب موارد حوسبية عالية جداً. وعند الانتهاء من تسلسل ما، يمكن للمستخدم اختيار تسلسل آخر لحساب تقريب ألفة الارتباط الخاص به، وتتم إضافة هذه النتيجة إلى النتيجة السابقة، مما يظهر تقريب ألفة الارتباط لجميع التسلسلات المكتملة. وبمجرد اختيار التسلسل وحفظه، يتم إعادة توجيه المستخدم إلى "Main Control Page".

انقر على "Begin Stage 2: Approximate Binding Affinity" لإرسال المهمة. عند الاكتمال، تُرسل النتائج إلى المستخدم عبر البريد الإلكتروني، والتي تتضمن مرفقاً يحتوي على رقم التسلسل، وتقارب الارتباط التقريبي، وقيم دوال التقسيم في Eq. 6. وبالنسبة لكل مهمة تقارب ارتباط تقريبي لاحقة، يحتوي هذا الملف على النتائج لجميع التسلسلات المكتملة. ويمكن أيضاً عرض النتائج الكاملة (من اختيار التسلسل، وخصوصية الطي، وتقارب الارتباط التقريبي) من خلال الدخول إلى "Main Control Page" الخاصة بالمهمة (الشكل 12).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

De Novo تصميم مثبطات الدخول لفيروس HIV-1

لقد استُخدم إطار عمل التصميم de novo المطبق في Protein WISDOM لتصميم ببتيدات مثبطة لعدة أنظمة علاجية مهمة (الجدولان 1 و 2). وأحد الأنظمة الجديرة بالذكر هو تصميم ببتيدات لتثبيط دخول HIV-1 إلى مستقبل الخلية المضيفة CD4، والذي استُخدم هنا كنظام نموذجي لإظهار الاستخدام العملي لواجهة Protein WISDOM. وقد صُممت الببتيدات لاستهداف الوحدة الفرعية عبر الغشائية gp41، والتي تعمل كجزء أساسي في اندماج ودخول HIV-1 إلى الخلايا التائية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتكون إطار تصميم البروتين دي نوفو من مرحلتين ، مرحلة اختيار التسلسل ومرحلة التحقق من الصحة. الإطار قوي بما يكفي للتعامل مع قوالب التصميم الصلبة والمرنة ، ويمكن تطبيقه على تصميم بروتين واحد أو تصميم بروتين معقد. تم تطبيق الإطار بنجاح على العديد من أنظمة البروتين مع تطبيقات لعشرات الأمراض. تم التحقق من صحة عدد من التصاميم تجريبيا ، مما يوفر أقوى مثبطات أو ناهضات لبعض البروتينات المكتشفة حتى الآن. هذا الإطار متاح الآن للمجتمع الأكاديمي عبر Protein WISDOM.

هناك ثلاث خطوات حاسمة في الطريقة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

CAF يقر بامتنان بالدعم المقدم من NSF ، NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) ، ووكالة حماية البيئة الأمريكية ، وكالة حماية البيئة (R 832721-010). تم جعل جزء من هذا البحث ممكنا بدعم حكومي من وزارة الدفاع ، مكتب البحث العلمي التابع للقوات الجوية. تعترف JS بامتنان بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (P50GM071508-06). يقر MLBP بامتنان بالدعم المقدم من زمالة خريج علوم وهندسة الدفاع الوطني (NDSEG) ، 32 CFR 168a. تعترف GAK بامتنان بالدعم المقدم من زمالة أبحاث الخريجين التابعة لمؤسسة العلوم الوطنية بموجب المنحة رقم DGE-1148900.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المراجع

  1. Drexler, K. Molecular engineering: An approach to the development of general capabilities for molecular manipulation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 78, 5275-5278 (1981).
  2. Pabo, C. Molecular technology: Designing proteins and peptides. Nature. 301, 200(1983).
  3. Floudas, C. A. Research challenges, opportunities and synergism in systems engineering and computational biology. AIChE J. 51, 1872-1884 (2005).
  4. Fung, H. K., Welsh, W. J., Floudas, C. A. Computational de novo peptide and protein design: Rigid templates versus flexible templates. Ind. Eng. Chem. Res. 47, 993-1001 (2008).
  5. Ponder, J., Richards, F. Tertiary templates for proteins. J. Mol. Biol. 193, 775-791 (1987).
  6. Dahiyat, B. I., Mayo, S. L. Protein design automation. Protein Sci. 5, 895-903 (1996).
  7. Dahiyat, B. I., Gordon, D. B., Mayo, S. L. Automated design of the surface positions of protein helices. Protein Sci. 6, 1333-1337 (1997).
  8. Su, A., Mayo, S. L. Coupling backbone flexibility and amino acid sequence selection in protein design. Protein Sci. 6, 1701-1707 (1997).
  9. Desjarlais, J., Handel, T. Side chain and backbone flexibility in protein core design. J. Mol. Biol. 290, 305-318 (1999).
  10. Farinas, E., Regan, L. The de novo design of a rubredoxin-like Fe site. Protein Sci. 7, 1939-1946 (1998).
  11. Harbury, P. B., Plecs, J. J., Tidor, B., Alber, T., Kim, P. S. High-resolution protein design with backbone freedom. Science. 282, 1462-1467 (1998).
  12. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design: I. In search of stability and specificity. J. Mol. Biol. 293, 1161-1181 (1999).
  13. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design. II. Plasticity in sequence space. J. Mol. Biol. 293, 1183-1193 (1999).
  14. Kuhlman, B., Dantae, G., Ireton, G., Verani, G., Stoddard, B., Baker, D. Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy. Science. 302, 1364-1368 (2003).
  15. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Integrated structural, computational and experimental approach for lead optimization: Design of compstatin variants with improved activity. J. Am. Chem. Soc. 125, 8422-8423 (2003).
  16. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Tsokos, C. G., Lambris, J. D. Design of peptide analogs with improved activity using a novel de novo protein design approach. Ind. Eng. Chem. Res. 43, 3817-3826 (2004).
  17. Fung, H. K., Floudas, C. A., Taylor, M. S., Zhang, L., Morikis, D. Toward full-sequence de novo protein design with flexible templates for human beta-defensin-2. Biophys. J. 94, 584-599 (2008).
  18. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A., López de Victoria, A., Morikis, D. New compstatin variants through two de novo protein design frameworks. Biophys. J. 98, 2337-2346 (2010).
  19. López de Victoria, A., Gorham, R. D. Jr A new generation of potent complement inhibitors of the compstatin family. Chem. Biol. Drug Des. 77, 431-440 (2011).
  20. Tamamis, P., López de Victoria, A. Molecular dynamics in drug design: New generations of compstatin analogs. Chem. Biol. Drug Des. 79, 703-718 (2012).
  21. Bellows-Peterson, M. L., Fung, H. K. De novo peptide design with c3a receptor agonist and antagonist activities: Theoretical predictions and experimental validation. J. Med. Chem. 55, 4159-4168 (2012).
  22. Bellows, M. L., Taylor, M. S. Discovery of entry inhibitors for HIV-1 via a new de novo protein design framework. Biophys. J. 99, 3445-3453 (2010).
  23. Sun, J. -J., Abdeljabbar, D. M., Clarke, N. L., Bellows, M. L., Floudas, C. A., Link, A. J. Reconstitution and engineering of apoptotic protein interactions on the bacterial cell surface. J. Mol. Biol. 394, 297-305 (2009).
  24. Smadbeck, J., Bellows-Peterson, M. L. De novo protein design and validation of histone methyltranferase inhibitors. , In Preparation (2013).
  25. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A. Molecular Systems Engineering, Process Systems Engineering. Adjiman, C. S., Galindo, A. 6, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 207-232 (2010).
  26. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. A novel high resolution Cα-Cα distance dependent force field based on a high quality decoy set. Proteins. 65, 726-741 (2006).
  27. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. Distance dependent centroid to centroid force fields using high resolution decoys. Proteins. 70, 950-970 (2008).
  28. Fung, H. K., Taylor, M. S., Floudas, C. A. Novel formulations for the sequence selection problem in de novo protein design with flexible templates. Optim. Method. Softw. 22, 51-71 (2007).
  29. Fung, H. K., Rao, S., Floudas, C. A., Prokopyev, O., Pardalos, P. M., Rendl, F. Computational comparison studies of quadratic assignment like formulations for the in silico sequence selection problem in de novo protein design. J. Comb. Optim. 10, 41-60 (2005).
  30. CPLEX. Using the CPLEX Callable Library. , ILOG, Inc. (1997).
  31. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Free energy calculations for peptides via deterministic global optimization. J. Chem. Phys. 110, 7491-7512 (1999).
  32. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Lambris, J. D. Predicting peptide structures using NMR data and deterministic global optimization. J. Comput. Chem. 20, 1354-1370 (1999).
  33. Klepeis, J. L., Schafroth, H. D., Westerberg, K. M., Floudas, C. A. Deterministic global optimization and ab initio approaches for the structure prediction of polypeptides, dynamics of protein folding and protein-protein interactions. Adv. Chem. Phys. 120, 265-457 (2002).
  34. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Ab initio prediction of helical segments of polypeptides. J. Comput. Chem. 23, 246-266 (2002).
  35. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Prediction of beta-sheet topology and disulfide bridges in polypeptides. J. Comput. Chem. 24, 191-208 (2003).
  36. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD: A combinatorial and global optimization framework for ab initio prediction of three-dimensional structures of proteins from the amino acid sequence. Biophys. J. 85, 2119-2146 (2003).
  37. Klepeis, J. L., Pieja, M. T., Floudas, C. A. A new class of hybrid global optimization algorithms for peptide structure prediction: Integrated hybrids. Comput. Phys. Commun. 151, 121-140 (2003).
  38. Klepeis, J., Pieja, M., Floudas, C. Hybrid global optimization algorithms for protein structure prediction : Alternating hybrids. Biophys. J. 84, 869-882 (2003).
  39. Klepeis, J. L., Floudas, C. Analysis and prediction of loop segments in protein structures. Comput. Chem. Eng. 29, 423-436 (2005).
  40. Mo¨nnigmann, M., Floudas, C. Protein loop structure prediction with flexible stem geometries. Proteins. 61, 748-762 (2005).
  41. McAllister, S. R., Mickus, B. E., Klepeis, J. L., Floudas, C. A. A novel approach for alpha-helical topology prediction in globular proteins: Generation of interhelical restraints. Proteins. 65, 930-952 (2006).
  42. Floudas, C. A., Fung, H. K., McAllister, S. R., Mönnigmann, M., Rajgaria, R. Advances in protein structure prediction and de novo protein design: A review. Chem. Eng. Sci. 61, 966-988 (2006).
  43. Subramani, A., Wei, Y., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD 2.0: An enhanced framework for protein structure prediction. AIChE J. 58, 1619-1637 (2012).
  44. Wei, Y., Thompson, J., Floudas, C. Concord: a consensus method for protein secondary structure prediction via mixed integer linear optimization. P. Roy. Soc. A-Math. Phy. 468, 831-850 (2011).
  45. Subramani, A., Floudas, C. β-sheet topology prediction with high precision and recall for β and mixed α/β proteins. PLoS One. 7, e32461(2012).
  46. Rajgaria, R., Wei, Y., Floudas, C. A. Contact prediction for beta and alpha-beta proteins using integer linear optimization and its impact on the first principles 3D structure prediction method ASTRO-FOLD. Proteins. 78, 1825-1846 (2010).
  47. Subramani, A., Floudas, C. A. Structure prediction of loops with fixed and flexible stems. J. Phys. Chem. B. 116, 6670-6682 (2012).
  48. Güntert, P., Mumenthaler, C., Wüthrich, K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J. Mol. Biol. 273, 283-298 (1997).
  49. Güntert, P. Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol. Biol. 278, 353-378 (2004).
  50. Ponder, J. TINKER, software tools for molecular design. , Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine. Louis, MO. (1998).
  51. Cornell, W. D., Cieplak, P. A 2nd generation forcefield for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. J. Am. Chem. Soc. 117, 5179-5197 (1995).
  52. Lilien, R. H., Stevens, B. W., Anderson, A. C., Donald, B. R. A novel ensemble-based scoring and search algorithm for protein redesign and its application to modify the substrate specificity of the gramicidin synthetase a phenylalanine adenylation enzyme. J. Comput. Biol. 12, 740-761 (2005).
  53. Lee, M. R., Baker, D., Kollman, P. A. 2.1 and 1.8 A°Cα RMSD structure predictions on two small proteins, HP-36 and S15. J. Am. Chem. Soc. 123, 1040-1046 (2001).
  54. Rohl, C. A., Baker, D. De novo determination of protein backbone structure from residual dipolar couplings using rosetta. J. Am. Chem. Soc. 124, 2723-2729 (2002).
  55. Rohl, C. A., Strauss, C. E. M., Misura, K. M. S., Baker, D. Protein structure prediction using rosetta. Methods Enzymol. 383, 66-93 (2004).
  56. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. Biclustering via optimal re-ordering of data matrices in systems biology: Rigorous methods and comparative studies. BMC Bioinformatics. 9 (458), (2008).
  57. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. A network flow model for biclustering via optimal re-ordering of data matrices. J Global Optimization. 47, 343-354 (2010).
  58. Daily, M. D., Masica, D., Sivasubramanian, A., Somarouthu, S., Gray, J. J. CAPRI rounds 3-5 reveal promising successes and future challenges for RosettaDock. Proteins. 60, 181-186 (2005).
  59. Gray, J. J., Moughon, S., et al. Protein-protein docking with simultaneous optimization of rigid-body displacement and side-chain conformations. J. Mol. Biol. 331, 281-299 (2003).
  60. Gray, J. J., Moughon, S. E., et al. Protein-protein docking predictions for the CAPRI experiment. Proteins. 52, 118-122 (2003).
  61. Kuhlman, B., Baker, D. Native protein sequences are close to optimal for their structures. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 97, 10383-10388 (2000).
  62. Jmol: an open-source java viewer for chemical structures in 3d. , Available from: http://www.jmol.org (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحكمة البروتين: A منضدة لل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.