مقالة منهجية

لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

DOI:

10.3791/50487

⸱

سبتمبر 16, 2013

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توسيع الخلايا neuroprogenitor الإنسان (الشخصيات) في ظل الظروف المتكاثرة. وقد تختلف الشخصيات في الثقافات الخلايا العصبية الغنية في وجود مزيج من neurotrophins. تم الكشف عن علامات العصبية التي كتبها المناعي تلطيخ. لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية، وقد تختلف الشخصيات في PEN الشرائح الغشاء وتم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توسيع الخلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) معزولة عن دماغ الجنين البشري في ظل ظروف التكاثري في وجود عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) لتوفير امدادات وفيرة من الخلايا. وقد تختلف الشخصيات في وجود تركيبة جديدة من عامل نمو الأعصاب (NGF)، المشتقة من عامل التغذية العصبية في الدماغ (BDNF)، dibutyryl المخيم (DBC) وحمض الريتينويك على أطباق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin للحصول على الخلايا العصبية الغنية الثقافات. وتختلف الشخصيات أيضا في غياب neurotrophins، DBC وحمض الريتينويك وبحضور الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) لانتاج الثقافات نجمية الغنية. وتميزت الشخصيات المتباينة التي كتبها تلطيخ المناعي لوحة من علامات العصبية بما في ذلك NeuN، synapsin، أستيل، synaptophysin وGAP43. تم الكشف عن ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) وSTAT3، وعلامات نجمية، في 10-15٪ من الشخصيات المتباينة. لتسهيلخلية من نوع التوصيف الجزيئي محددة، تم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري لعزل الخلايا العصبية مثقف على البولي اثيلين naphthalate (PEN) الشرائح الغشاء. الطرق الموضحة في هذه الدراسة توفر أدوات قيمة لتعزيز فهمنا للآلية الجزيئية من تنكس عصبي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المعروف الخلايا العصبية مدى الحياة لتحدث في المنطقة subventricular من البطينين الوحشي وفي طبقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من البالغين أدمغة الثدييات 1. خلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) التي تنشأ من هذه المناطق هي خلايا متعددة القدرات التي يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes 2. لقد ولدت الشخصيات الفائدة بسبب قدرتها على أن زرع في المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون والتصلب الوحشي الضموري والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) 3. الدراسات مع الشخصيات ركزت عموما على هذه الزاوية زرع لكن إمكانات الخلايا العصبية المشتقة من مجلس الشعب كنموذج زراعة الخلايا لتحديد آلية تنكس عصبي لم تستغل بالكامل. وقد استخدمت الدراسات السابقة عموما الخلايا العصبية بعد الإنقسامية المعزولة من أنسجة الدماغ القوارض والتي تحتاج إلى أن تكون معزولة عن كل تجربة لأنها ليستتجديد الذات. على الرغم من خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك SH-SY5Y والخلايا SK-N-MC يمكن توسيعها، لم يكن لديهم خصائص الخلايا العصبية الأولية. الشخصيات البشرية، من ناحية أخرى، تقدم كل المزايا لأنها يمكن توسيعها لفقرات متعددة ويمكن أن تكون متباينة لتوليد السكان الخلية مع خصائص الخلايا العصبية الأولية 4،5. في الدراسة الحالية، ونحن تصف بروتوكول التمايز جديدة للحصول على السكان الخلايا العصبية الغنية متسقة من الشخصيات المتاحة تجاريا معزولة عن دماغ الجنين البشري. لأن هذه الثقافات لا تحتوي على نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية، ونحن بحاجة الى طرق إضافية لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية لتوصيف الجزيئي. القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM) هو أسلوب الرواية التي يبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا من قسم الأنسجة يمكن ملاحظتها بشكل انتقائي لتحليل التعبير الجيني 6. الدماغ هو نسيج غير متجانس يتكون من الخلايا العصبية، الدبقية وغيرها تاي الخليةعبوة. وقد استخدم LCM لتحديد الخلايا العصبية محددة التعبير الجيني يحلل 7-10. وقد أجرينا في السابق LCM من الخلايا العصبية قرن آمون من م (Tg2576) أقسام مخ الفأر لإظهار التعبير انخفض من دوري عنصر استجابة AMP البروتين ملزمة (CREB) وعامل التغذية العصبية تحديدا في الخلايا العصبية الحصين 11. في هذه الدراسة، ونحن تصف إجراءات لتوسيع الشخصيات البشرية، وتمايز الخلايا العصبية، وتلطيخ مناعي للعلامات العصبية وLCM لعزل الخلايا العصبية مثقف على الشرائح PEN الغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توسيع الشخصيات البشرية (الشكل 1)

  1. إحياء الأسهم المجمدة من الشخصيات البشرية من دماغ الجنين (ونزا، Walkersville، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) والثقافة لهم في تعليق في T-75 قوارير كما neurospheres (الشكل 1A) في المتوسط ​​neurobasal تحتوي على ملاحق الانتشار، صندوق تعديل العولمة الأوروبي (10 نانوغرام / مل) و جمعية جيل المستقبل (10 نانوغرام / مل).
  2. بعد 3 أيام في الثقافة، ونقل neurospheres إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل طاف تاركين وراءهم ~ 100 ميكرولتر المتوسطة فوق بيليه الخلية ونقل إلى أنبوب إيبندورف. A بيليه الخلية 100 ميكرولتر يكفي لانقسم الى 2 T-75 قوارير. إذا كانت أقل، والحد من عدد من قوارير كما تفشل الخلايا على التكاثر إذا neuroprogenitor تقسيم رقيقة.
  4. يسحن بيليه مع 200 ميكرولتر غيض 50X مع الحفاظ على غيض 200 ميكرولتر ضد الجزء السفلي من الأنبوب. تقسيم تعليق خلية بالتساوي الى قسمين وإضافتها إلى 2 T-75 قوارير (1-2 الانقسام)، واحدة للاصلالتوسع وآخر للتمايز.
  5. تواصل ثقافة الخلايا neuroprogenitor للتوسع (القارورة الأولى) عن طريق تغيير المتوسطة كل 4-5 أيام حتى تصل neurospheres حجمها الأصلي من 300-500 ميكرون. تغيير المتوسطة عن طريق الطرد المركزي (500 دورة في الدقيقة؛ 5 دقائق)، تجاهل المتوسطة القديمة والمتوسطة إضافة جديدة.

2. التفريق بين الشخصيات البشرية إلى ثقافة العصبية الغنية (الشكل 2)

  1. لتمايز الخلايا إلى الخلايا العصبية neuroprogenitor ثقافة غنية، ووضع ساترة واحد في كل بئر من لوحة 24 جيدا ومعطف مع 100 ميكروغرام / مل من بولي-L-يسين بإضافة 500 ميكرولتر في كل بئر. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. نضح-L-يسين بولي الحل وشطف لوحة مع الماء المعقم.
  3. المقبل، ومعطف الآبار من لوحة مع 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل laminin الماوس واحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني.
  4. بعد 4 أيام splittiنانوغرام الخلايا (الخطوة 1.4)، ونقل neurospheres صغيرة في قارورة وصفت "لتمايز" في الأطباق المغلفة في مناطق ذات كثافة من ~ 500 neurospheres لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
  5. بعد 6 ساعة، عندما نعلق neurospheres إلى الطبق، وإزالة المتوسطة الانتشار وإضافة متوسطة التمايز تتكون من المتوسطة neurobasal، B27 الملحق، NGF (20 نانوغرام / مل)، BDNF (10 نانوغرام / مل)، DBC (100 ملم)، وحمض الريتينويك (2 ميكرومتر).

3. المناعي تلون الشخصيات المتباينة (الشكل 3)

  1. التالي ثقافة الخلايا العصبية في neuroprogenitor متوسطة التمايز لمدة أسبوعين، يتم الحصول على الخلايا العصبية ثقافة غنية. شطف الخلايا العصبية مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة. مرة واحدة ثابتة، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. احتضان الخلايا مع العازلة permeabilization (5٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) في RT لمدة 60 دقيقة.
  3. احتضان الأطباق O / N عند 4 ° م طغ شاكر مع التركيبة التالية من بولكلونل والاجسام المضادة في 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني: NeuN (1:250) وsynapsin (1:250)؛ أسيتيل الكولين (1:500) وsynaptophysin (1:250)؛ BDNF (1 : 500) وGAP43 (1:250)؛ STAT3 (1:500) وGFAP (1:1،000).
  4. غسل coverslips ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان ثم لهم المضادة للأرنب CY3 والأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس-FITC في RT في الظلام لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل coverslips ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. وضع 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية، واخراج ساترة من الطبق الثقافة مع ملقط، ووضعه رأسا على عقب على المتوسطة المتزايدة. بلطف، ويمحو أي وسيط الزائدة تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر.
  6. فحص الخلايا العصبية في immunostained المجهر مضان.

4. لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية (الشكل 4)

  1. التفريق الشخصيات إلى ثقافة الخلايا العصبية الغنية على PEN الشريحة الغشاءق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin فقا للإجراءات وصفها لشكل 2.
  2. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة في ظل ظروف خالية ريبونوكلياز.
  3. وصمة عار على الثقافات باستخدام HistoGene وصمة عار (السماك الرامح) لتصور الخلايا.
  4. العثور على مجالات السكان العصبية نقية خالية من الخلايا النجمية باستخدام خارطة الطريق صورة الشريحة بأكملها مع نظام فيريتاس LCM. بمناسبة الخلايا العصبية باستخدام أدوات الرسم.
  5. القبض على أداء ليزر هذه المناطق باستخدام الدقة التي تسيطر عليها الكمبيوتر والأتمتة في عملية من خطوتين. أولا، يتم تشغيل الأشعة تحت الحمراء (الأشعة تحت الحمراء) في بقع متعددة مع إعداد قوة الليزر من 70 ميغاواط ونبض 2،500 μsec للحصول على الغشاء نعلق على الغطاء. المقبل، يتم رفعه منطقة تميزت باستخدام أداة القطع الأشعة فوق البنفسجية في إعداد مستوى منخفض من 10 بالسيارات.
  6. مزيج من هذه العمليات يلتقط انتقائي المناطق ملحوظ من الغشاء PEN على قبعات ماكرو CapSure LCM. عندما يتم رفع الغطاء، والغشاء مع نeurons تتمسك الغطاء.
  7. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من عينات LCM استخدام عدة العزلة PicoPure الحمض النووي الريبي (السماك الرامح) وعلاج مع الدناز.
  8. تضخيم الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام الحمض النووي الريبي RiboAMP عدة التضخيم التالية تعليمات من عدة.
  9. أداء الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR باستخدام TaqMan تحقيقات للكشف عن خيط عصبي الإنسان السلسلة الثقيلة (hNFHc).

الاختصارات:

م، ومرض الزهايمر؛ BDNF، المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية؛ CREB، دوري عنصر استجابة AMP بروتين ملزمة؛ DBC، Dibutyryl دوري امبير؛ صندوق تعديل العولمة الأوروبي، وعامل نمو البشرة؛ جمعية جيل المستقبل، وعامل نمو الخلايا الليفية؛ GFAP، ييفي الدبقية البروتين الحمضية؛ LCM، ليزر التقاط تسليخ مجهري؛ NGF، عامل نمو العصب؛ مجلس الشعب، neuroprogenitor الخلية؛ PEN، البولي إثيلين naphthalate.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسيع الشخصيات (الشكل 1)

عندما يتم تقسيم neurospheres وصولا الى تعليق خلية واحدة بواسطة سحن، يحتاج غيض ماصة للمس الجزء السفلي من الأنبوب حتى لا يكون هناك بعض المقاومة عند pipetted تعليق صعودا وهبوطا. وعدد المرات التي من سحن تختلف بين الأفراد ويحتاج إلى أن يتقرر عن طريق التجربة والخطأ من خلال دراسة تعليق الخلية الناتجة تحت المجهر. فمن الأهمية بمكان لتوفير كثافة كافية من تعليق خلية لأن الانتشار سيكون ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا في هذه الدراسة نموذجا ثقافة الخلية العصبية غنية عن طريق تمايز الخلايا neuroprogenitor الإنسان تجديد الذات وطريقة لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية بواسطة الليزر التقاط تسليخ مجهري. وقد استخدمنا مزيج من نيسان الخليج، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك للتمايز الخلايا العصبية من الشخصيات. يستخدم DBC لتفعيل CREB، وهو عامل النسخ التي تعزز تكوين الخلايا العصبية 12. حمض الريتينويك يدفع خروج دورة الخلية، ويقلل من السكان الدبقية 13. الطريقة الموضحة في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أي تضارب في المصالح لتعلن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل عن طريق منحة الاستحقاق مراجعة (NEUD-004-07F) من إدارة المحاربين القدامى (ليرة سورية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخلايا السلفية العصبية (NPCs) LonzaPT-2599
Neurocult NS-A الوسط القاعدي البشريتقنية الخلايا الجذعية5750
مكمل انتشار Neurocult NS-Aتقنية الخلايا الجذعية5753
مكمل التمايز العصبي NS-Aتقنية الخلايا الجذعية5754
B-27 مكمل غذائي (50x) Invitrogen17504-044
عامل نمو البشرة البشريتكنولوجيا الخلايا الجذعية2633
عامل نمو الخلايا الليفية SigmaF0291
خليةعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ 3897S
عامل نمو الأعصاب Invitrogen13257-019
Dibutyryl cyclic AMPSigmaD-0627
بولي إل ليسين سيجماP-5899
الفأر لامينين سيجماL-2020
حمض الريتينويكسيجماR-2625
STAT3 إشاراتالخلية9132
GFAP إشاراتالخلية3670
مختبرات نقلالأجسام المضادة612262
الجسم المضاد BDNFMilliporeAB1534SP
الأجسام المضادة أسيتيل الكولينستراز Santz cruzSc-11409
Synaptophysin الجسم المضادAbcamab18008-50
NeuN الجسم المضادChemiconMAB377
Synapsin الجسم المضادNovusNB300-104
مكافحة الفأر FITCجاكسون المناعة115-095-146
مختبرات
المضادة للأرانب Cy3جاكسون إيمونو711-165-152
مختبرات
BSASigmaA1653
Triton-X 100Acros21568-2500
Paraformaldehye Fisher4042
Coverslip (زلة غطاء دائرة كبيرة)Fisherbrand12-545-102
وسط تركيب (إطالة الذهب)InvitrogenP36930
غشاء القلمالأنظمة الحيوية التطبيقيةLCM0521
طقم تلطيخ القسم المجمد Histogene LCMالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0401
طقم تضخيم الحمض النووي الريبي RiboAmpالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0201
طقم عزل الحمض النووي الريبي Picopureالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0202
Capsureأغطية Macro LCMالأنظمة الحيويةالتطبيقية LCM0211
إشارات GAP43 الأبحاثالأبحاث

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neuronal DifferentiationImmunofluorescent StainingNeuron Rich CulturePEN Membrane SlidesGene Expression AnalysisNeurotrophic Growth FactorsCell IsolationRNA Amplification

مقالات ذات صلة