Method Article

لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

DOI:

10.3791/50487

⸱

September 16th, 2013

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توسيع الخلايا neuroprogenitor الإنسان (الشخصيات) في ظل الظروف المتكاثرة. وقد تختلف الشخصيات في الثقافات الخلايا العصبية الغنية في وجود مزيج من neurotrophins. تم الكشف عن علامات العصبية التي كتبها المناعي تلطيخ. لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية، وقد تختلف الشخصيات في PEN الشرائح الغشاء وتم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توسيع الخلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) معزولة عن دماغ الجنين البشري في ظل ظروف التكاثري في وجود عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) لتوفير امدادات وفيرة من الخلايا. وقد تختلف الشخصيات في وجود تركيبة جديدة من عامل نمو الأعصاب (NGF)، المشتقة من عامل التغذية العصبية في الدماغ (BDNF)، dibutyryl المخيم (DBC) وحمض الريتينويك على أطباق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin للحصول على الخلايا العصبية الغنية الثقافات. وتختلف الشخصيات أيضا في غياب neurotrophins، DBC وحمض الريتينويك وبحضور الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) لانتاج الثقافات نجمية الغنية. وتميزت الشخصيات المتباينة التي كتبها تلطيخ المناعي لوحة من علامات العصبية بما في ذلك NeuN، synapsin، أستيل، synaptophysin وGAP43. تم الكشف عن ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) وSTAT3، وعلامات نجمية، في 10-15٪ من الشخصيات المتباينة. لتسهيلخلية من نوع التوصيف الجزيئي محددة، تم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري لعزل الخلايا العصبية مثقف على البولي اثيلين naphthalate (PEN) الشرائح الغشاء. الطرق الموضحة في هذه الدراسة توفر أدوات قيمة لتعزيز فهمنا للآلية الجزيئية من تنكس عصبي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المعروف الخلايا العصبية مدى الحياة لتحدث في المنطقة subventricular من البطينين الوحشي وفي طبقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من البالغين أدمغة الثدييات 1. خلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) التي تنشأ من هذه المناطق هي خلايا متعددة القدرات التي يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes 2. لقد ولدت الشخصيات الفائدة بسبب قدرتها على أن زرع في المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون والتصلب الوحشي الضموري والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) 3. الدراسات مع الشخصيات ركزت عموما على هذه الزاوية زرع لكن إمكانات الخلايا العصبية المشتقة من مجلس الش....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توسيع الشخصيات البشرية (الشكل 1)

  1. إحياء الأسهم المجمدة من الشخصيات البشرية من دماغ الجنين (ونزا، Walkersville، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) والثقافة لهم في تعليق في T-75 قوارير كما neurospheres (الشكل 1A) في المتوسط ​​neurobasal تحتوي على ملاحق الانتشار، صندوق تعديل العولمة الأوروبي (10 نانوغرام / مل) و جمعية جيل المستقبل (10 نانوغرام / مل).
  2. بعد 3 أيام في الثقافة، ونقل neurospheres إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسيع الشخصيات (الشكل 1)

عندما يتم تقسيم neurospheres وصولا الى تعليق خلية واحدة بواسطة سحن، يحتاج غيض ماصة للمس الجزء السفلي من الأنبوب حتى لا يكون هناك بعض المقاومة عند pipetted تعليق صعودا وهبوطا. وعدد المرات التي من سحن تختلف بين الأفراد ويحتاج إلى أن يتقرر عن طريق التجربة والخطأ من خلال دراسة تعليق الخلية الناتجة تحت المجهر. فمن الأهمية بمكان لتوفير كثافة كافية من تعليق خلية لأن الانتشار سيكون .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا في هذه الدراسة نموذجا ثقافة الخلية العصبية غنية عن طريق تمايز الخلايا neuroprogenitor الإنسان تجديد الذات وطريقة لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية بواسطة الليزر التقاط تسليخ مجهري. وقد استخدمنا مزيج من نيسان الخليج، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك للتمايز الخلايا العصبية من الشخصيات. يستخدم DBC لتفعيل CREB، وهو عامل النسخ التي تعزز تكوين الخلايا العصبية 12. حمض الريتينويك يدفع خروج دورة الخلية، ويقلل من السكان الدبقية 13. الطريقة الموضحة في .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أي تضارب في المصالح لتعلن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل عن طريق منحة الاستحقاق مراجعة (NEUD-004-07F) من إدارة المحاربين القدامى (ليرة سورية).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الخلايا السلفية العصبية (NPCs) LonzaPT-2599
Neurocult NS-A الوسط القاعدي البشريتقنية الخلايا الجذعية5750
مكمل انتشار Neurocult NS-Aتقنية الخلايا الجذعية5753
مكمل التمايز العصبي NS-Aتقنية الخلايا الجذعية5754
B-27 مكمل غذائي (50x) Invitrogen17504-044
عامل نمو البشرة البشريتكنولوجيا الخلايا الجذعية2633
عامل نمو الخلايا الليفية SigmaF0291
خليةعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ 3897S
عامل نمو الأعصاب Invitrogen13257-019
Dibutyryl cyclic AMPSigmaD-0627
بولي إل ليسين سيجماP-5899
الفأر لامينين سيجماL-2020
حمض الريتينويكسيجماR-2625
STAT3 إشاراتالخلية9132
GFAP إشاراتالخلية3670
مختبرات نقلالأجسام المضادة612262
الجسم المضاد BDNFMilliporeAB1534SP
الأجسام المضادة أسيتيل الكولينستراز Santz cruzSc-11409
Synaptophysin الجسم المضادAbcamab18008-50
NeuN الجسم المضادChemiconMAB377
Synapsin الجسم المضادNovusNB300-104
مكافحة الفأر FITCجاكسون المناعة115-095-146
مختبرات
المضادة للأرانب Cy3جاكسون إيمونو711-165-152
مختبرات
BSASigmaA1653
Triton-X 100Acros21568-2500
Paraformaldehye Fisher4042
Coverslip (زلة غطاء دائرة كبيرة)Fisherbrand12-545-102
وسط تركيب (إطالة الذهب)InvitrogenP36930
غشاء القلمالأنظمة الحيوية التطبيقيةLCM0521
طقم تلطيخ القسم المجمد Histogene LCMالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0401
طقم تضخيم الحمض النووي الريبي RiboAmpالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0201
طقم عزل الحمض النووي الريبي Picopureالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0202
Capsureأغطية Macro LCMالأنظمة الحيويةالتطبيقية LCM0211
إشارات GAP43 الأبحاثالأبحاث

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionHuman Neuroprogenitor CellsNeuronal DifferentiationImmunofluorescent StainingNeuron Rich CulturePEN Membrane SlidesGene Expression AnalysisNeurotrophic Growth FactorsCell IsolationRNA Amplification

Related Articles