مقالة منهجية

التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

DOI:

10.3791/50489

⸱

يونيو 13, 2013

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين 1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني 6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية 8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية 1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور 594 مترافق؛ I21413؛ إينفيتروجن؛ 1:100 تمييع) يمكن أن يتصاعد وشقة الشبكية تسليط الضوء على البنية الكلية للسفن، ولكن من دون عرض التصور من الشعيرات الدموية والأغشية الطابق السفلي وpericytes . ولوحظ من قبلFriedenwald أن السفن يمكن إبراز بواسطة تلطيخ مسطحة يتصاعد من شبكية العين مع الدوري حمض شيف (PAS) أو الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ 10. ومع ذلك، كان تلطيخ غير محددة إلى السفن وسلطت الضوء على الأنسجة غير والأوعية الدموية وكذلك، مما يجعل من الصعب التفريق بين الأوعية. في 1960s، وضعت كوجان وكوابارا تقنية هضم التربسين التي جعلت من السهل تصور الأوعية الدموية في شبكية العين عن طريق هضم مكونات اوعائي من شبكية العين 1. منذ ذلك الوقت، أصبح التربسين هضم طريقة المعيار الذهبي في تحليل الأوعية الدموية للشبكية العين 2-5. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن تقنيات بديلة أخرى لعزل الأوعية الدموية وقد وصفت. وقد استخدمت استخدام تحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية والسماح الدراسات البيوكيميائية في الأنسجة 11،12، ولكن لم يتم استخدامه الإجراء كوسيلة الأولية للدراسة تشريحية. لقد كان الأسلوب Print الأنسجةتستخدم لعزل قطاعات واسعة من الأوعية الدموية الدقيقة ويسمح للقدرة لدراسة الهندسة المعمارية تيار كهربي من الأوعية الدموية 13. من الناحية النظرية، ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة التغيرات التشريحية، كما نوعية السفن عالية. ومع ذلك، أنها قادرة على عزل أجزاء من شبكة الأوعية الدموية بأكملها فقط. على الرغم من أن هذه الأساليب لا يمكن أن تحل محل التربسين هضم، فمن المهم أن نلاحظ أن لديهم مزايا وعيوب مختلفة ومكملة في هذا الصدد.

طريقة هضم التربسين يمثل تحديا تقنيا ويصعب تنفيذ باستمرار 6،7. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن التربسين هضم من الصعب خصوصا على نموذج الفأر، ولا سيما إذا كان أحد يرغب في الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الشاملة للشبكية العين 6،7. وتشمل التحديات (1) الإفراط في الهضم من شبكية العين الذي يسبب خسارة كل من الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير والأوعية الدموية، (2) وكيل الهضم، وتتطلبتشريح الميكانيكية واسعة النطاق والتي يمكن أن تؤدي بدورها إلى التلف من السرير السفينة، (3) فصل الفقيرة من الأنسجة غير والأوعية الدموية من الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. وقد أبرزت العديد من المخطوطات لهذه التحديات، ولكن قدمت بلا بروتوكول مفصلة ومتسقة للتغلب عليها 14،15. وهذه المخطوطة تقديم منهجية خطوة بخطوة تفاصيل تقنية لتنفيذ التربسين هضم في شبكية العين الماوس والفئران مع نصائح محددة بشأن التعامل مع خطوات صعبة بشكل خاص. يتم عرض لمحة التخطيطي في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الشبكية

  1. استأصل العين الماوس. باستخدام يد واحدة، فتح الجفون بحيث العين مرئيا. مع من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ملقط المنحني (صعودا تواجه المنحني)، والضغط على الجوانب الأعلى والأدنى من المدار حتى يبرز العالم. إغلاق بلطف ملقط في الجانب الخلفي من العين ورفع في حركة مستمرة لاستأصل العين.
  2. إصلاح العين مع 10٪ محايدة مخزنة الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
  3. مكان العين في حل PBS في طبق بتري الصغيرة.
  4. تشريح خارج شبكية العين بعناية تحت المجهر، مع الحرص على تجنب إحداث الدموع كبيرة. إجراء الخفض الأولي في القرنية مع مقص تشريح. ثم، في حين الضغط على منطقة قطع مع ملقط على التوالي، واستخدام مقص لقطع على طول الحدود بين القرنية والصلبة إزالة القرنية. باستخدام ملقط غرامة المنحنية والمستقيمة، بعناية قشر الصلبة والمشيمية بعيدا عن الشبكية نحو العصب البصري. هذه الخطوة يتطلب الصبر كمايمكن بسرعة الافراج عن الشبكية يؤدي إلى الدموع. إزالة العدسة والقزحية أي الزائد والحطام من شبكية العين 16.

2. يغسل الماء

  1. مكان شبكية العين في صحن 24 أيضا، وتغطي مع الماء (حوالي 500 ميكرولتر وتصفيتها مع ما لا يقل عن مرشح ميكرون 45).
  2. تغيير الماء كل 30 دقيقة، 1 ساعة، 4-5 مرات على الأقل.
  3. ترك بين عشية وضحاها في الماء مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة: الخطوات غسل مهمة جدا لأنها تساعد فصل طبقات الشبكية العصبية من الأوعية الدموية.

3. التربسين دايجست

  1. إزالة المياه وشبكية العين احتضان في محلول 3٪ التربسين (Difco 1:250) في 0.1 م تريس العازلة (درجة الحموضة 7.8) عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف للا. اكتمال التربسين هضم عندما تبدأ الأنسجة التي تظهر عليها علامات التفكك (حوالي 1.5 ساعة).
    ملاحظة: تجنب المصافحة السريعوهذا يمكن أن يتلف الأوعية الدموية.
  2. بعناية، ماصة من التربسين إلى منفصلة جيدا باستخدام المجهر لتجنب لمس شبكية العين. هذا التربسين الزائدة يمكن استخدامها في وقت لاحق، عند التعامل مع السفن تحت المجهر، في الخطوة 4.3.

4. فصل الأوعية الدموية

  1. إضافة الماء المصفى إلى شبكية العين. ثم، محاولة لتقشر الغشاء الداخلي يحد بالملقط، وذلك باستخدام مقص إذا لزم الأمر. يهز مع الإثارة خفيفة لمدة 5 دقائق. بعناية، ماصة خارج الماء تحت المجهر لتجنب إتلاف شبكية العين.
  2. كرر يغسل الماء (لمدة 5 دقائق لكل منهما) للمساعدة في الافراج عن شبكة من الأوعية من الأنسجة الشبكية ملتصقة. يتم الانتهاء من يغسل الماء عندما يكون هناك قليل من دون الحطام المتبقي في الماء بعد الغسيل.
  3. وهناك حاجة إلى التلاعب حذرا تحت المجهر تشريح الآن إلى مزيد من تحرير شبكة من الأوعية. وفيما يلي العديد من التقنيات المفيدة، التي يمكن استخدامها في تسلسل أو دائرة الهجرة والجنسيةividually لتحقيق النتيجة المرجوة على أساس تفضيل التقنية:
    1. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة بعناية الماء صعودا وهبوطا المتاخمة للسفن، تهب المياه في الأوعية، مما تسبب في الإثارة لطيف.
    2. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة التربسين صعودا وهبوطا للمساعدة في الجدران معطف من ماصة. ثم، ماصة بعناية شبكة السفينة بأكمله صعودا وهبوطا مرة واحدة للمساعدة في كسر الأنسجة غير والأوعية الدموية.
      ملاحظة: يمكن توسيط طرف ماصة في العصب البصري بدلا من حواف شبكة الأوعية الدموية أيضا منع الأوعية الدموية من الالتصاق إلى الحافة.
    3. رفع بلطف الأوعية الدموية مع ملقط غرامة للخروج من الماء لطرد عناصر غير والأوعية الدموية.
    4. إذا لم يعمل الخطوات المذكورة أعلاه، إضافة التربسين إلى الشبكية للمساعدة في تحطيم الأنسجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق. ثم، وإزالة التربسين وكرر الخطوات من 4،1-4،3.

ملاحظة: تأكد من معطف جميع الصكوك التي سوف تأتي في اتصال مع السفن في التربسين (مثل ماصة، ملقط). وهذا سوف يساعد على تجنب التصاق من الأوعية الدموية إلى المعدات.

5. تصور الأوعية الدموية

  1. وضع قطرة من الماء على شريحة نظيفة. باستخدام ماصة ميكرولتر 200 أو ملقط، نقل السفن هضمها في الماء. تأكد من تكشفت الأوعية الدموية مسطحة جبل. والتوتر السطحي للماء يساعد على تتكشف شبكة الأوعية الدموية الآن شفاف. إذا لم تتكشف الأنسجة، وإضافة كميات إضافية من الماء ويهز بلطف الشريحة لتسهيل تتكشف.
  2. إزالة المياه الزائدة ببطء شديد من قبل pipetting أو باستخدام منشفة ورقية.
  3. تسمح الشرائح لتجف تماما.
  4. وصمة عار الشرائح عبر البروتوكول المناسب إما مع PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E وصمة عار.
    ملاحظة: PAS / الهيماتوكسيلين مفيد لتحديد جدار الوعاء الدموي والنوى الخلوية؛ H & E مفيد لدemonstration من RBC كذلك.
  5. يذوى وجبل (Permount تصاعد متوسطة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المنتج النهائي من إجراء الناجح هو جبل المسطح من شبكة كاملة من الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس، مع الحفاظ على العمارة، ملطخة إما PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E، كما هو موضح في الشكلين 2-4. تمايز واضح من الخلايا البطانية وpericytes يمكن أن ينظر إليه كما هو مبين في الشكل (3). في شبكية العين، ونوى الخلايا البطانية بيضاوية أو ممدود وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. نواة خلية حوطية صغيرة، كروية، وصمة عار المكتظة وعموما لديه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النماذج الحيوانية الوراثية شيوعا من أمراض العيون. وتقدم هذه الورقة توجيهات بشأن كيفية تنفيذ الإجراء بفعالية وباستمرار في عيون الماوس.

وهناك العديد من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1-EY019951 (AAF)، جمعية إلينوي للوقاية من العمى (JCC، AAF)، والأموال غير المقيد إلى قسم العيون من البحوث للوقاية من العمى (RPB)، NY وRPB الطبية زمالة طالب المنحة (JCC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

EQUIPMENT< / قوي > أي

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> الكواشف < / قوي >
10٪ فورمالين محايدمخزن فيشر ScientificSF100-4
التربسين (1: 250)Amresco0458-50Gاصنع 3٪ تريبسين في 0.1 متر قاعدة تريس
تريزماسيجماT1503-1KGقم بإنشاء 0.1 متر عازلة تريس (درجة الحموضة 7.8 @ 37 درجة ؛ ج)
TRIZMASigmaT3253-500G
زجاجة فراغ معقمة SteritopMilliporeSCGPS05REإنشاء مياه
تشريح المجهرمجهر يسمح بالتصور الجيد لشبكية العين كاف. (10x كافية مع مسافة عمل 24 مم)
مقص مستقيمأدوات العلوم الدقيقة15024-10حافة القطع: 8 مم ؛ قطر الحافة: 0.2 مم ؛ ملقط مستقيم 10 سم
(إينوكس)Dumont # 511252-20طرف Biologie ؛ 0.05 × 0.02 مم ؛ 11 سم
Forcepts منحني (Dumostar)Dumont # 711297-10طرف Biologie ؛ 0.07 × 0.04 مم ؛ 11.5 سم
Dubnoff Metabolic Shaker IncubatorPrecision ScientificBDG59442Shaker اختياري
24 بئرFalcon353047
Microscope SlidesVWR82027-132
مفلترة < td colspan = "4" >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة