التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين 1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني 6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.
المقدمة
تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية 8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية 1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير الشبكية
- استأصل العين الماوس. باستخدام يد واحدة، فتح الجفون بحيث العين مرئيا. مع من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ملقط المنحني (صعودا تواجه المنحني)، والضغط على الجوانب الأعلى والأدنى من المدار حتى يبرز العالم. إغلاق بلطف ملقط في الجانب الخلفي من العين ورفع في حركة مستمرة لاستأصل العين.
- إصلاح العين مع 10٪ محايدة مخزنة الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
- مكان العين في حل PBS في طبق بتري الصغيرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
المنتج النهائي من إجراء الناجح هو جبل المسطح من شبكة كاملة من الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس، مع الحفاظ على العمارة، ملطخة إما PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E، كما هو موضح في الشكلين 2-4. تمايز واضح من الخلايا البطانية وpericytes يمكن أن ينظر إليه كما هو مبين في الشكل (3). في شبكية العين، ونوى الخلايا البطانية بيضاوية أو ممدود وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. نواة خلية حوطية صغيرة، كروية، وصمة عار المكتظة وعموما لديه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النماذج الحيوانية الوراثية شيوعا من أمراض العيون. وتقدم هذه الورقة توجيهات بشأن كيفية تنفيذ الإجراء بفعالية وباستمرار في عيون الماوس.
وهناك العديد من ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1-EY019951 (AAF)، جمعية إلينوي للوقاية من العمى (JCC، AAF)، والأموال غير المقيد إلى قسم العيون من البحوث للوقاية من العمى (RPB)، NY وRPB الطبية زمالة طالب المنحة (JCC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
EQUIPMENT< / قوي > أي
مفلترة < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي> الكواشف < / قوي > | |||
| 10٪ فورمالين محايد | مخزن فيشر Scientific | SF100-4 | |
| التربسين (1: 250) | Amresco | 0458-50G | اصنع 3٪ تريبسين في 0.1 متر قاعدة تريس |
| تريزما | سيجما | T1503-1KG | قم بإنشاء 0.1 متر عازلة تريس (درجة الحموضة 7.8 @ 37 درجة ؛ ج) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| زجاجة فراغ معقمة Steritop | Millipore | SCGPS05RE | إنشاء مياه |
| تشريح المجهر | مجهر يسمح بالتصور الجيد لشبكية العين كاف. (10x كافية مع مسافة عمل 24 مم) | ||
| مقص مستقيم | أدوات العلوم الدقيقة | 15024-10 | حافة القطع: 8 مم ؛ قطر الحافة: 0.2 مم ؛ ملقط مستقيم 10 سم |
| (إينوكس) | Dumont # 5 | 11252-20 | طرف Biologie ؛ 0.05 × 0.02 مم ؛ 11 سم |
| Forcepts منحني (Dumostar) | Dumont # 7 | 11297-10 | طرف Biologie ؛ 0.07 × 0.04 مم ؛ 11.5 سم |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker اختياري |
| 24 بئر | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
المراجع
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Gr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
