مقالة منهجية

تقرير من الأحماض الدهنية المسموح وتركيزات ذيفان الكوليرا عن طريق خلايا الإنسان الظهارية في الأمعاء وBALB / ج الضامة ماوس

DOI:

10.3791/50491

⸱

مايو 30, 2013

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kingsborough Community College, 2Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 3New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شرعنا في تحديد التركيزات المسموح من ثلاثة أحماض الدهنية (الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك) وبكتيريا الكوليرا التي لم تؤثر سلبا بشكل ملحوظ وبقاء الخلية بواسطة solubilizing الأحماض الدهنية والسموم واستخدامها في المقايسات بقاء الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد كان دور إيجابي من الأحماض الدهنية في الوقاية والتخفيف من الأمراض غير الإنسان والإنسان والاستمرار في أن تكون موثقة على نطاق واسع. وتشمل هذه الأدوار التأثيرات على الأمراض المعدية وغير المعدية بما في ذلك الوقاية من التهاب وكذلك حصانة للأمراض المعدية. الكوليرا هو مرض معوية حادة تسببها بكتيريا ضمة الكوليرا. ويحدث ذلك في الدول النامية، وإذا تركت دون علاج، يمكن أن يؤدي إلى الموت. بينما لقاحات الكوليرا موجودة، فهي ليست دائما فعالة وهناك حاجة إلى أساليب وقائية أخرى. شرعنا في تحديد التركيزات المسموح من ثلاثة أحماض الدهنية (الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك) وبكتيريا الكوليرا باستخدام الماوس BALB / C الضامة والخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية، على التوالي. نحن solubilized الأحماض الدهنية أعلاه وتستخدم المقايسات تكاثر الخلايا لتحديد نطاقات تركيز وتركيزات معينة من الأحماض الدهنية التي توجدر تضر الإنسان المعوية بقاء الخلية الظهارية. نحن solubilized توكسين الكوليرا واستخدامه في فحص لتحديد نطاقات تركيز وتركيزات محددة من بكتيريا الكوليرا التي لا تقلل إحصائيا بقاء الخلية في BALB / C الضامة.

وجدنا تركيزات الأحماض الدهنية الأمثل أن تكون بين 1-5 نانوغرام / ميكرولتر، وذلك لذيفان الكوليرا أن يكون <30 نانوغرام لكل معاملة. هذه البيانات قد تساعد الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى إيجاد دور المخاطية الواقية للالأحماض الدهنية في الوقاية أو التخفيف من الالتهابات الكوليرا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت الفوائد الصحية للأحماض الدهنية، مثل الأوليك، اللينوليك والأحماض اللينولينيك والاستمرار في أن تكون موثقة. على سبيل المثال، يساعد حمض الأوليك تسهيل تغلغل المخدرات محبة للدهون في الجسم 1،2، ويقلل من الإصابة بأمراض القلب التاجية بنسبة 24٪ عند استبداله للأحماض الدهنية المشبعة 3، ويستخدم لعلاج الأمراض الأيضية مثل Adrenoleukodystrophy (4) الذي هو العاشر مرتبطة اضطراب وراثي في ​​استقلاب الأحماض الدهنية. . بينما هو مقدمة ضرورية لحمض الأراكيدونيك في الثدييات، وحمض اللينوليك (على عكس حمض الأوليك) لا توليفها من قبل الهيئة، ويجب الحصول عليها من خلال مصادر خارجية مثل كتبها استهلاك بذور الكتان عرض 5 الدراسات العديد من الآثار الصحية المفيدة للحمض اللينوليك مثل: خصائص مضادة للشيخوخة للبشرة؛ 6 خصائص مضادة للالتهابات، 7 انخفاض انتشار القولون والمستقيم والبروستاتا خلايا سرطان؛ 8 والقدرة على محاربة السمنة وتعزيز سو صحة القلب والأوعية الدموية. 9 حمض اللينولينيك يلعب دورا في الحد من التهاب اللثة، الثرموبوكسان 10 وتحوير والحيوي بروستاسيكلين 11

آربيتا 12 درس تأثير الأحماض الدهنية الصفراء والكوليسترول في V. التعبير الكوليرا 'S من عوامل الفوعة والحركة. وأشار ياماساكي 13 أن استخراج الميثانول من الفلفل الأحمر الحار، والمركبات المستخرجة طبيعيا أخرى، يمكن أن يحتمل أن ينخفض ​​إنتاج سموم الكوليرا. فمن المتصور أن تنظر في استخدام المنتجات الغذائية التي هي غنية في الأحماض الدهنية أعلاه (مثل بذور الكتان) في الوقاية والتخفيف من الأمراض المعدية مثل الكوليرا من خلال توفير حصانة. أجرينا تحقيقات لذوبان الأحماض الدهنية وتحديد، وذلك باستخدام المقايسات تكاثر الخلايا، والحد الأقصى لتركيز الأحماض الدهنية أن الخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية يمكن أن يتسامح بدون آثار ضارة على CEجدوى ليرة لبنانية. افترضنا أن الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك توفير تأثير مفيد على بقاء الخلية بتركيزات أقل، ولكن هذا في تركيزات أعلى أنها سوف تكون سامة للخلايا. نحن أيضا solubilized السم الكوليرا وتحديد الحد الأقصى لتركيز السم الكوليرا الذي BALB / C الضامة الماوس يمكن أن يتسامح دون حدوث انخفاض كبير في بقاء الخلية. نحن نفترض تأثير السامة للبكتيريا الكوليرا على بقاء الخلية حتى على مستوى منخفض جدا. طريقة solubilizing السم الكوليرا واستخدامه لتحديد الحد الأقصى لمقدار السم أن الخلايا يمكن أن يتسامح دون حدوث انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة ويوفر ميزة للدراسات المستقبلية. على سبيل المثال، وهو مزيج من المنهجيات أعلاه يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت الأحماض الدهنية توفر الخلايا مع حصانة ضد الالتهابات الكوليرا. إلى حد علمنا، لم يتم استكشاف هذه المنهجية العقلانية و.

نحن ديscuss كيف يمكن استخدام البيانات الأولية لدينا في التحقيقات في وقت لاحق لتحديد ما إذا الأوليك والأحماض اللينوليك واللينولينيك توفر الخلايا مع حصانة ضد الإصابة بالكوليرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الأنسجة

  1. استخدام الضامة العضلة المصحف (الفئران BALB / ج) وفيما يتعلق بتحديد بكتيريا الكوليرا. الثقافة في البداية كل من م. خلايا العضلة بعد تعليمات البائع.
  2. نشر BALB / ج خلايا الفئران في متوسطة Dulbecco في التعديل النسر مع L-الجلوتامين مع الانتهاء من 10٪ مصل بقري جنيني، والانتهاء من 1٪ مضاد حيوي / مضاد فطري أو RPMI وسائل الإعلام قاعدة 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني، 5٪ L-الجلوتامين، و1 ٪ مضاد حيوي / مضاد فطري كاشف.
  3. زراعة خلايا في 75 سم 2 قوارير كورنينج مع قبعات تنفيس عند 37 درجة مئوية، و 95٪ هواء و 5٪ CO 2.
  4. إحضار الخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية في غضون 24 ساعة من الولادة وفقا للتعليمات الشركة المصنعة لتحديد قرارات الأحماض الدهنية.
  5. نشر خلايا الظهارة المعوية الإنسان في 75 سم 2 قوارير كورنينج مع قبعات تنفيس في وسائل الإعلام HybriCare الانتهاء مع FBS 10٪ و 30 نانوغرام / مل EGF الإنسان في 37 درجة مئوية. لا تستخدم المضادات الحيويةالكواشف / مضاد فطري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  6. تقسيم جميع الخلايا (1:3) في حوالي 70٪ confluency.
  7. تجميد وإحضار جميع الخلايا في جميع أنحاء الدراسة باستخدام بروتوكولات تجميد القياسية.
  8. ملاحظة: للحصول على تقرير أكبر تركيز نطاق من الأحماض الدهنية، استخدام أسرع نموا، وأسهل للحفاظ على، الضامة الماوس في البداية. لغرامة نطاق الدهنية حمض تحديد التركيز، واستخدام الخلايا الظهارية البشرية. استخدام الماوس الضامة لجميع العلاجات توكسين الكوليرا (انظر المناقشة).

2. الأحماض الدهنية والعلاج ذيفان الكوليرا

  1. نقل الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك من شركة تقدم أمبولات زجاجية لقوارير زجاجية معقمة.
  2. نقل كل الأحماض الدهنية إلى منفصلة إيبندورف أنبوب تعقيم وتذوب لأول مرة في الإيثانول بنسبة 100٪ في التخفيف من 01:06، وبعد ذلك في المتوسط ​​1640 وسائل الاعلام غير مكتملة لتركيز النهائي من 10 ميكروغرام / ميكرولتر.
  3. دوامة كل حل وTRANSFإيه إلى قارورة زجاجية للتخزين في الفريزر (-20 ° C).
  4. لوحة الخلايا في 2،500 خلايا / جيد في 96 جيدا لوحات زراعة الأنسجة.
  5. إضافة وسائل الإعلام كاملة المناسبة لجعل إجمالي حجم جيدا إلى 200 ميكرولتر لعلاج الخلايا مع الأحماض الدهنية في إعداد المقايسات لMTT.
  6. بعد فترة الانتشار على مدار 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة.
  7. إضافة تركيزات مناسبة من كل الأحماض الدهنية لفحصها إلى الآبار (انظر النتائج). إضافة وسائط كاملة ليصبح العدد الإجمالي للمجلدات جيدا إلى 200 ميكرولتر.
  8. احتضان لوحات المعالجة لمدة 24 ساعة قبل البدء في فحص MTT.
  9. حل ذيفان الكوليرا في برنامج تلفزيوني في تركيز 1 ملغ / مل وقسامة الحل في cryovials وتخزين cryovials في 2-8 درجة مئوية.
  10. للعلاج بالخلايا، يخفف من السموم 1:100 في أي برنامج تلفزيوني تعقيمها (7.4 درجة الحموضة) أو غير مكتملة DMEM لتركيز العمل النهائية من 1 نانوغرام / ميكرولتر.
  11. لعلاج الخلايا مع توكسين الكوليرا فيإعداد لفحوصات MTT، لوحة الخلايا كما هو موضح أعلاه.
  12. بعد فترة الانتشار على مدار 24 ساعة، إضافة تركيزات مناسبة من ذيفان الكوليرا (لتركيزات لدينا، انظر النتائج) لفحصها إلى الآبار وفقا للإجراءات المستخدمة في التطبيقات الأحماض الدهنية (أعلاه).
  13. احتضان لوحات المعالجة لمدة 24 ساعة قبل البدء في فحص MTT.
  14. ك (ج إيجابية في جميع أنحاء الورق) الإيجابية والسيطرة السلبية (ج السلبي)، لكل من الأحماض الدهنية وعلاجات بكتيريا الكوليرا، والخلايا احتضان مع المتوسطة كاملة والايثانول 70٪، على التوالي.
  15. لجميع العينات والعلاجات استخدام الحد الأدنى من ثلاثة مكررات (ن = 3)، مع أكثر مكررات لالضوابط الإيجابية (ن = 6 في هذه الدراسة).

3. MTT الفحص

  1. جعل محلول المخزون MTT إلى تركيز من 2.5 ملغ / مل.
  2. إزالة الحل في كل بئر من لوحة جيدا 96 لفحصها واستبدالها مع 200 ميكرولتر من الحل الطازجة وسائل الإعلام كاملة.
  3. إعلاند 10 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري إلى كل بئر.
  4. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة.
  5. تجاهل الحل وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 0.04 M في الأيزوبروبانول إلى كل بئر.
  6. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
  7. نقل الحل من كل بئر إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
  8. الطرد المركزي في XG 20،000، في درجة حرارة الغرفة، لمدة 1 دقيقة، أو حتى تم تشكيل لبيليه.
  9. نقل بين 20-40 ميكرولتر من كل عينة إلى قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
  10. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد تركيز الأمثل من الأحماض الدهنية

يتم تعريف تركيز الأمثل للأحماض الدهنية والحد الأقصى للتركيز على نمو الخلايا التي هي مماثلة لأو يفوق عدد الخلايا السيطرة، مع تقلبات منخفضة نسبيا في النتائج. لتحديد تركيز الأمثل للالأوليك، وعولج اللينوليك واللينولينيك خلايا الأحماض في البداية مع تركيزات من كل الأحماض الدهنية متفاوتة بزيادات كبيرة في وقت لاحق مع دفعات صغيرة. ويبين الشكل (1) وبقاء خلايا صورت بوصفها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اقتراح من تركيز الأحماض الدهنية والسمية الكوليرا

في حين أن الآلية الدقيقة لكيفية الأحماض الدهنية تعزيز مناعة المخاطية غير معروف، وقد حاول العديد من الدراسات للتحقيق آثارها المفيدة. وتهدف دراستنا إلى تقديم منهجية لتحديد الحد الأقصى لتركيز الأحماض الدهنية أن الخلايا يمكن أن يتسامح فضلا عن التركيز الأقصى للذيفان الكوليرا أن الخلايا يمكن أن يتسامح دون تأثير كبير على بقاء الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واضعو هذه الدراسة ليس لديهم مصلحة مالية من نتائج هذه الدراسة. تم توفير التمويل لهذه الدراسة إلى FT من جامعة كين، ولكن FT حاليا موظف في Kingsborough كلية المجتمع.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بولا كوبوس والدكتور إفروس فاسيليو للمساعدة مختبر وتوفير الضامة الماوس، على التوالي. ونشكر أيضا لدينا مختبر مدير ريتشارد Criasia للتوجيه والمساعدة في المواد. وأخيرا، فإن الكتاب أشكر Ramanpreet كاور للمساعدة في إنتاج الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>خلايا / كاشف < / قوي>
< م > mus musculus < / em > البلاعمATCC ATCCRAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's MediumATCC30-2002
L-glutamineATCC30-2115
مصل الأبقار الجنيني Bio-westS0250
مضاد حيوي / هيكلون مضاد للفطريات SV3007901
الخلايا الظهارية المعوية البشرية ATCCATTC CCL-241
HybriCare media ATCC46-X
حمض الأوليكسيجما ألدريتشO1008
حمض اللينوليكسيجما ألدريتشL-1376
حمض اللينولينيكسيجما ألدريتشL-2376
سم الكوليراسيجما ألدريتشC8052
Equipment< / strong>
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates BDBiosciences351172
مقياس الطيف الضوئي مع برنامج Dynex Revelations 4.22Dynex91000101

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
  2. Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
  3. Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
  4. Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
  5. Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
  6. Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30(2009).
  7. Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
  8. Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
  9. Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
  10. Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
  11. Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
  12. Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
  13. Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
  14. WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
  15. Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
  16. Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MTT

مقالات ذات صلة