يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي بروتينات متعددة المجالات التي ترميز كل من GTPase والمجالات كيناز والتي هي فسفرته في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الشاملة phophorylation الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأيضية وصفها من لوسين ريتش كرر تحركات 1 و 2 مع المشعة الفوسفات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة، بما في ذلك مجال كيناز سيرين ثريونين، وهو رأس من البروتينات المعقدة المجال (ROC)، لC-محطة المجال ROC (مجلس النواب)، ويسين الغنية ويكرر مثل ankyrin في N-محطة. أدوار الخلوية الدقيقة للLRRK1 وLRRK2 لم يتم بعد توضيح، ولكن LRRK1 وقد تورط في التيروزين كيناز مستقبلات إشارات 1،2، بينما هو متورط LRRK2 في التسبب في مرض باركنسون 3،4. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 البروتينات في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الفسفرة العام لهذه البروتينات في الخلايا 2. باختصار، الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد سوى عدد قليلوصفت بذلك بالإشعاع ساعة من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات. عبر العلامة تقارب (3xflag) يتم عزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لمراقبة الفسفرة من أي البروتين الأخرى التي يمكن التعبير عنها في الخلايا وعزلها مناعي.
المقدمة
يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs متعددة المجالات التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة. كل من البروتينات ترميز سلسلة GTPase أقرب إلى الأسرة من رأس GTPases (رأس من البروتينات المعقدة، أو ROC) فضلا عن C-محطة المجال ROC (مجلس النواب) وتصنيفها على نحو فعال على حد سواء البروتينات للبروتين الأسرة ROCO 5،6. N-محطة من جنبا إلى جنب مجال ROC-النواب، سواء البروتينات ترميز تكرار المجال يسين الغنية فضلا عن المجال مثل ankyrin، في حين LRRK2 فقط يشفر المدرع اضافية domein 6-8. C-محطة من ROC-النواب، سواء البروتينات مشاركة سيرين ثريونين كيناز-المجال أثناء LRRK2 فقط بترميز مجال WD40 في المنطقة C-محط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يستخدم هذا البروتوكول المشعة 32 ف المسمى الفوسفاتية لمتابعة الفسفرة الخلوية من LRRK2. من المهم أن نضع في الاعتبار أن جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية ينبغي أن يقوم باستخدام تدابير وقائية مناسبة للحد من التعرض للإشعاع المشعة للمشغل والبيئة. المركبات التي تحتوي على النظائر التي تنبعث منها الإشعاعات المؤينة يمكن أن تكون ضارة على صحة الإنسان والترخيص واللوائح الصارمة في عنصر تحكم المؤسسي والوطني مستوى استخدامها. وأجريت التجارب في هذا البروتوكول في أعقاب التدريب على استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر في الجامعة الكاثوليكية في لوفين (KU لوفين) وتمشيا مع المبادئ التوجيهية الممارسة المخبرية الجيدة التي تقدمها وزارة الصحة والسلا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من أجل مقارنة مستويات الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في الخلايا، الموسومة 3xflag LRRK1 وأعرب عن LRRK2 في الخلايا HEK293T 15. كانت الخلايا المستزرعة في 6 لوحات جيدة والمسمى مع 32 P وتحليلها كما هو موضح أعلاه في نص البروتوكول. الشكل 1 يبين نتائج ممثلة لوضع العلامات الأيضية من LRRK1 وLRRK2 في الخلايا HEK293T. لوحظ إدراج الفوسفات المشعة لكلا LRRK1 وLRRK2. على القياس الكمي لمستويات 32 P تطبيع مستويات البروتين مقاسا تحليل الكثافة من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الورقة بروتوكول الأساسية لمعايرة مستوى الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في خطوط الخلايا باستخدام وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية. الاستراتيجية الشاملة واضح ومباشر. الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد ساعات قليلة فقط من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات وصفت بذلك بالإشعاع. ثم ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون أيضا لمؤسسة فوكس J. مايكل دعم هذه الدراسة. نشكر مؤسسة أبحاث - فلاندرز FWO (مشروع FWO G.0666.09، وكبار الزمالة الباحث إلى فريق الرصد المشترك)، وIWT SBO/80020 المشروع العصبية الهدف، وجامعة لوفين الكاثوليكية (OT/08/052A وIOF-KP/07 / 001) لدعمهم. وأيد هذا البحث أيضا في جزء من صندوق Druwé-Eerdekens تدار من قبل مؤسسة الملك بودوان لفريق الرصد المشترك.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفوسفور -32 النويدات المشعة ، 1 مللي Ci ، عازلة ديسوديوم فوسفات في 1 مل ماء | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco &# 8217 ؛ s النسر المعدل المتوسط (D-MEM) (1X) ، سائل (نسبة عالية من الجلوكوز) | Invitrogen | 11971-025 | لا يحتوي هذا الوسيط على فوسفات |
| Flag M2 Affiinty gel | Sigma | A2220 | للحصول على منتج مكافئ يحتوي على هلام أحمر اللون (مفيد لتصور الخرزات بسهولة أكبر) ، استخدم القط. رقم F2426. |
| فلتر نشاف سميك للغاية | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
المراجع
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
