طرق لإجراء الصلبان في الهلبانة البلدي، نظام نموذج جديد للأعشاب

ملخص

قمنا بتطوير منهجية لأداء الصلبان في VIRIDIS الهلبانة (S. البلدي). ينطوي على طريقة التقليم باقه ورد قبل العلاج الماء الساخن لقتل حبوب اللقاح قابلة للحياة. يتم تنفيذ الصلبان التالية نظام النمو تسيطر عليها بشكل جيد، ويؤدي عادة في الانتعاش من 1-7 عبر التلقيح بذرة / ثانية لكل باقه ورد.

الملخص

الهلبانة البلدي هو نظام نموذجي الناشئة لC ₄ الأعشاب. يرتبط ارتباطا وثيقا إلى تغذية الطاقة الحيوية التبن الأسهم ومحصول الحبوب ذيل الثعلب الدخن. في الآونة الأخيرة، الجينوم 510 ميغابايت من الدخن ذيل الثعلب، S. ITALICA، وقد التسلسل ^1،2 و25X تغطية تسلسل الجينوم للS. النسبية الأعشاب الضارة VIRIDIS قيد التقدم. S. VIRIDIS لديها عدد من الخصائص التي تجعل من نموذج نظام الوراثية يحتمل ممتازة بما في ذلك الوقت جيل السريع، مكانة صغيرة، ومتطلبات النمو بسيطة، وإنتاج البذور وافرة ³ والنظم التي وضعت لكلا عابرة ومستقرة التحول ^4. ومع ذلك، فإن علم الوراثة من S. VIRIDIS هو غير مستكشفة إلى حد كبير، في جزء منه، وذلك بسبب عدم وجود طرق مفصلة لأداء الصلبان. حتى الآن، لم يتخذ بروتوكول قياسي من شأنها أن تسمح الإنتاج السريع للبذور من الصلبان التي تسيطر عليها.

وبريه بروتوكولented هنا هو الأمثل لأداء الصلبان الجينية في S. VIRIDIS، الانضمام A10.1. لقد استخدمنا المعالجة الحرارية بسيطة مع الماء الدافئ لخصاء بعد تشذيب باقه ورد للاحتفاظ 20-30 زهيرات ووضع العلامات من الزهور للقضاء على البذور الناتجة من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بعد اختبار سلسلة من المعالجات الحرارية في درجات حرارة متفاوتة ومتساهلة مدة غمس، أنشأنا درجة الحرارة المثلى والنطاق الزمني من 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة. باستخدام هذا الأسلوب، ما لا يقل عن 15 الصلبان يمكن أن يقوم بها عامل واحد في اليوم وبمتوسط ​​3-5 ذرية هجين الأباعد في الدالية يمكن استردادها. لذلك، في المتوسط ​​45-75 ذرية هجين الأباعد يمكن أن تنتج من قبل شخص واحد في يوم واحد. وتنفيذ واسعة من هذه التقنية تسهيل وضع السكان السلالة النقية المؤتلف من S. VIRIDIS X S. VIRIDIS أو S. VIRIDIS X S. ITALICA، تعيين الطفرات من خلال الجزء الأكبر ذاتهاتحليل gregant وخلق المسوخ العليا للتحليل الجيني.

المقدمة

S. VIRIDIS هو NADP-ME النوع الفرعي C ₄ العشب ترتبط ارتباطا وثيقا تغذية الطاقة الحيوية التبن الأسهم (NAD-ME النوع الفرعي)، محصول الحبوب ذيل الثعلب الدخن، والحشائش الزراعية غينيا العشب ^5. الجينوم 510 ميغابايت من شكل المزروعة الهلبانة، S. ITALICA، وقد تم مؤخرا التسلسل ^1،2 و25X تغطية تسلسل الجينوم من النسبية الأعشاب الضارة، S. VIRIDIS، هو في التقدم (غير منشورة). S. VIRIDIS لديها عدد من الخصائص التي تجعل من نموذج نظام الوراثية يحتمل ممتازة بما في ذلك الوقت جيل السريع، مكانة صغيرة، ومتطلبات النمو بسيطة، وإنتاج البذور وافرة ^3. الأهم من ذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب لكلا التحول عابرة ومستقرة من S. VIRIDIS التي توفر الفرصة لخلق النباتات المعدلة وراثيا ^4. ومع ذلك، عقبة رئيسية في تطوير الأدوات الوراثية للS. VIRIDIS هو recalc لهاitrance إلى التهجين. حتى الآن، وقد تم نشر أي بروتوكول قياسي من شأنها أن تسمح الإنتاج السريع للبذور من الصلبان التي تسيطر عليها.

الصلبان الجينية في S. عادة ما يتم تنفيذها من قبل ITALICA خصاء من خلال إزالة المتك من الزهور ^6،7،8 أو من خلال المعالجة الحرارية من الزهور من الآباء والأمهات الإناث ^9-11. بعد هذه العلاجات، المتك أو عناقيد من الأزهار غير المعالجة / الآباء الذكور ومتآكل بلطف الوصمات ضد الإفراج عن حبوب اللقاح. في خصاء، تتم إزالة المتك باستخدام ملقط غرامة على الفور بعد فتح floret غاضب والعضو الذكري هو بداية لexsert، ولكن لم تسلط بعد اللقاح ^6-8. من بين التحديات التي تواجه هذا الأسلوب الأخير هو صعوبة في أداء خصاء في فترة زمنية ضيقة بين فتح وتسليط حبوب اللقاح من زهرة. ومدة فتح وإغلاق زهرة واحدة تختلف تبعا لحالة الانضمام والبيئية، ويمكن أن تتراوح بين 7 دقائق <سوب> 6-2،5 ساعة في ¹² S. ITALICA. منذ سفك حبوب اللقاح كما يحدث exsert المتك من floret غاضب، تحتاج المتك إلى إزالتها بعناية وبسرعة، وبالتالي، فمن الصعب تجنب التلوث بسبب التلقيح الذاتي. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم تنفيذ pollinations مباشرة بعد خصاء، وعدد من الصلبان التي يمكن القيام بها للشخص الواحد / في اليوم الواحد محدودة.

كطريقة بديلة، عناقيد ناضجة يمكن مغموسة في الماء الدافئ لتسخين القتل تطوير حبوب اللقاح ^{9،10،13،14} مع الاستفادة من أداء الصلبان على عدد كبير من عناقيد. ومع ذلك، فإن درجة الحرارة ومدة المعالجة الحرارية تختلف على نطاق واسع من التجارب المختلفة (على سبيل المثال 47 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ¹⁴ و 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ^10). علاوة على ذلك، لم تنشر تحليلات منهجية على فعالية الإخصاء بوساطة الحرارة. وبالتالي، وهو معيار وطريقة بسيطة لأداء الصلبان الجينية في S. الخامسالقزحية من شأنه أن يعجل بشكل كبير تنمية الموارد الوراثية وإنشاء S. VIRIDIS كنظام نموذج داخل المجتمع البحثي.

نفيدكم تطوير وتعظيم الاستفادة من بروتوكول قياسي لأداء الصلبان الجينية في S. VIRIDIS. تزرع النباتات في بيئات تسيطر عليها لمزامنة تنمية زهرة وزيادة استنساخ الإجراء. يتم تنفيذ الصلبان باستخدام S. المعدلة وراثيا خط VIRIDIS كما ذكر الوالد الذي يحتوي على الجين مراسل المكتب المركزي للاحصاءات ⁴ لتسهيل التعرف على الصلبان ناجحة الجينية التي تسيطر عليها. هو الدافع وراء التحوير من قبل المكتب المركزي للاحصاءات اليوبيكويتين المروج الأرز والتي تمكن من التهديف بذور F1 فورا بعد الحصاد، وبالتالي يوفر الفحص النوعي من السهل تحديد كفاءة خصاء والتلقيح. لقد استخدمنا المعالجة الحرارية بسيطة مع الماء الدافئ لخصاء يرافقه وضع العلامات من الزهور التي كانت emasculaتيد للقضاء على البذور الناتجة من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بعد اختبار سلسلة من المعالجات الحرارية في درجات حرارة متفاوتة ومتساهلة مدة غمس في الماء الدافئ، وأنشأنا درجة الحرارة والوقت الأمثل فترات من 48 درجة مئوية 3-6 دقيقة. تم العثور على علاج البرد قبل الفجر لتعزيز anthesis متزامن في كل من الآباء والأمهات من أجل تسهيل عبر التلقيح. ناقشنا أيضا الخطوات الرئيسية في البروتوكول وتطبيقها في المستقبل من هذا الأسلوب لانضمام الهلبانة الأخرى.

البروتوكول

1. نمو S. VIRIDIS

1. تهيئة الظروف غرفة النمو إلى 31 ° C/22 ° C (يوم / ليلة)، و 12 ساعة ساعة light/12 الظلام والرطوبة النسبية 50٪ مع العلاج ما قبل فجر 15 ° C 8:30 حتي 09:00 AM. (الشكل 1). في ظل هذه الظروف، S. VIRIDIS A10.1 يستغرق حوالي 21-22 يوما من بذر البذور إلى anthesis.
2. ملء الشقق (4 × 9 خلايا) مع مترو ميكس 360 وإزالة خلية واحدة لسقي.
3. ضباب المياه برفق على سطح التربة.
4. زرع البذور على سطح التربة، وبذرة واحدة لكل خلية.
5. تغطية البذور بطبقة من التربة (حوالي 0.5 سم)
6. ضباب سطح التربة والمياه الشقق من القاع. إبقاء سقي من أسفل بعد البذر.
7. وسوف يكون لاستخدام كل عبر الذي سيتم تنفيذه على الأقل ثلاث محطات كآباء والإناث تسع محطات استخدامها كآباء الذكور. وينبغي ترنحت بذر البذور كما سوف جميع النباتات لا زهرة في نفس اليوم. sowi البذورينصح نانوغرام في كل يوم على مدى فترة ثلاثة ايام.
8. ري النباتات 1-2 مرات في اليوم، والذي يعتمد على حجم النباتات وحالة التربة. المياه الزائدة في التربة ليست مواتية للنمو الأمثل للنباتات، وربما يؤدي إلى نمو الفطريات في التربة وتلف الأنسجة ورقة.
9. تسميد النباتات مرتين في الأسبوع، وذلك باستخدام جاك 15-16-17 بتركيز 100 جزء في المليون.

2. التشذيب وصفها من قبل الإخصاء باقه ورد - يوم 1

1. في فترة ما بعد الظهر أو في المساء قبل التلقيح، نقل النباتات من غرفة إلى مختبر النمو (درجة الحرارة (T): 24.06 درجة مئوية ± 0.13 درجة مئوية والرطوبة النسبية (RH) 21.79٪ ± 1.15٪).
2. حدد وجود عناقيد الابتدائية 1 زهرة إلى 1/3 من الزهور على الدالية التي أزهرت بالفعل.
3. في هذه الدراسة يتم تحديد المجالات الأربعة ضمن باقه ورد على النحو التالي (الشكل 2A؛ طرف والمتوسطة البعيدة والمتوسطة والقريبة القاعدة).
4. من الناحية المثالية، تختارونهعصام باقه ورد مع 1-5 الزهور التي أزهرت، وقطع غيض من باقه ورد (النهاية البعيدة)، وإزالة كل الزهور في الأقسام الوسطى وقاعدة الداني باستخدام مقص الربيع أو ملقط غرامة.
5. إذا كان لديه باقه ورد عن 1/10 الى 1/5 من الزهور التي أزهرت، وقطع طرف وتقليم الزهور من قاعدة باقه ورد والاحتفاظ بها فقط القسم السفلي من منتصف القاصي والقسم العلوي من منتصف الداني لمزيد من التشذيب.
6. إذا كان لديه باقه ورد حوالي 1/4 الى 1/2 من الزهور التي أزهرت، وقطع الجزء الأوسط القاصي والإبقاء على الجزء الأوسط الداني لمزيد من التشذيب فقط.
7. استخدام مقص جراحي لتقليم شعيرات طفيفة.
8. إزالة كل الزهور التي أزهرت وجميع الزهور غير الناضجة وترك ما يقرب من 20-30 الزهور / الدالية التي يتم توزيعها بالتساوي في المنطقة (الشكل 3). ممارسة الحرص على الإبقاء على شعيرات في المنطقة التي سيتم التلقيح من أجل حماية زهيرات من ضرر الحرارة ممكن.لكل السنيبلات، تحتفظ العلوي floret غاضب الأكثر نضجا. فإن معظم العلوي floret غاضب لديهم احتمال أعلى من anthesis في وقت التلقيح (الشكل 2B).
9. بمناسبة جانب واحد من كل زهرة مع علامة دائمة الحمراء وتسجيل عدد من زهيرات على باقه ورد (الشكل 2B).
10. العلم باقه ورد مع المعلومات التالية: تاريخ خصاء، ومدة ودرجة الحرارة التي يتم تنفيذ خصاء بها.
11. مرة واحدة يتم قطع باقه ورد، وإزالة جميع الفلاحين من كل مصنع لضمان إعادة تخصيص المزيد من الموارد لتطوير باقه ورد الرئيسي.

3. خصاء مع المياه الدافئة غمس - يوم 1

1. تعيين حمام مائي إلى 48 درجة مئوية ± 0.1 درجة مئوية لعلاج الحرارة.
2. ينحني برفق عناقيد قلص وتوضع في الماء الدافئ عند 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة. توخي الحذر عدم كسر ساق باقه ورد.
3. حوالي 3-4 عناقيد يمكن أن تراجع توجيذر في وقت واحد، مع الحفاظ على مساحة كافية بين عناقيد لتوزيع موحد للحرارة. فمن الضروري أن يغرق باقه ورد كامل في الماء الدافئ خلال المعالجة الحرارية. ورقة العلم (ورقة subtending باقه ورد التي توفر المواد المغذية إلى باقه ورد) يجب أن لا تتلامس مع الماء الدافئ لمنع وقوع أضرار الحرارة إلى الأنسجة ورقة.
4. مرة واحدة يتم تنفيذ خصاء لمدة المرجوة، وإزالة عناقيد من حمام الماء وبلطف التخلص من المياه من باقه ورد.
5. وضع كيس مخصصة الخبز الصغير مثقبة لتغطية كامل باقه ورد عاجزة وضمان الحصول عليها مع تطور التعادل. أكياس الخبز الصغيرة مثقوبة ويمكن تخصيصها وفقا لحجم باقه ورد (تدرج في الفيديو).
6. وضع النباتات مرة أخرى في غرفة النمو حتى اليوم التالي.

4. معبر / التلقيح بعد الإخصاء - يوم 2 ويوم 3

1. في الساعة 9:00 صباحا في يوم 2 ويوم 3، نقل الإناث (عاجزة) والقانون النموذجي للتحكيمه الآباء من غرفة إلى مختبر النمو (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) لأداء الصلبان.
2. مراقبة وإضافة نقطة حمراء أخرى إلى الزهور التي تتفتح أزهرت أو باستخدام علامة دائمة الحمراء. تسجيل عدد من الزهور أزهرت في الدالية.
3. تسجيل تاريخ التلقيح واسم الوالد الذكور على كلمة دلالية لتتبع ما يتم تنفيذها الصلبان.
4. مراقبة وقت الذروة من anthesis في الآباء الذكور. في ظل ظروف لدينا غرفة (الشكل 1) الزهور على عناقيد من الوالد الذكور تبدأ افتتاح متزامن في جميع أنحاء 10:10. من وقت الافتتاح من الزهور، وسوف exsertion كاملة من المتك وإطلاق حبوب اللقاح تحدث بعد 20 دقيقة.
5. مرحلة مثالية للتلقيح هي المرحلة التي يتم تحريرها حبوب اللقاح من الوالد الذكور. سوف الزهور يغلق بعد 20 دقيقة من إطلاق حبوب اللقاح. وبالتالي، فإن مدة لanthesis حوالي 40 دقيقة من وقت افتتاح تدفقالمتطلبات البيئية. لون التغييرات حبوب اللقاح من الأبيض المصفر إلى البني على مدى فترة من حوالي 30 دقيقة بعد إغلاق زهرة.
6. بدء التلقيح فورا بمجرد المتك أبيض مصفر واضحة على الزهور من الوالد الذكور. يتم تنفيذ Pollinations في يوم 2 ويوم 3 باستخدام أحد الأساليب الثلاثة:
   1. باقه ورد إلى باقه ورد التلقيح: باستخدام أحد باقه ورد منفصلة مثل الذكور، وفرك بلطف باقه ورد مع باقه ورد عاجزة لتسهيل التلقيح وتجاهل باقه ورد ذكر لتجنب التلوث. تكرار عملية التلقيح حتى يتم التلقيح كل باقه ورد عاجزة بنسبة 2-3 عناقيد.
   2. العضو الذكري، إلى وصمة العار التلقيح: باستخدام ملقط اختيار زهرة تتفتح التي المتك مع الأبيض المصفر أو اختيار المتك وجسديا تلمس صمة زهرة على الوالد الإناث. استخدام زهرة واحدة من الوالد الذكور لتلقيح زهرة واحدة على باقه ورد عاجزة. تكرار التلقيح عrocess حتى كل وصمة عار على باقه ورد عاجزة تم التلقيح بواسطة عدد قليل (حوالي 2-3) الزهور / المتك. وسوف يرتدي قناع المكبرة تقديم رؤية أفضل لأداء التلقيح.
   3. بين pollinations من الآباء الذكور مختلفة، وتراجع ملقط في الايثانول 95٪ تليها المسح مع Kimwipes لتجنب التلوث بسبب المرحل من حبوب اللقاح بين الصلبان المختلفة.
   4. باقه ورد ملزم: بعد خصاء، حدد 3-4 عناقيد على الأصل الذكور التي سوف تزدهر في اليوم التالي. ربط لهم مع باقه ورد عاجزة الوالد الإناث باستخدام تويست التعادل. وضع باقه ورد عاجزة أقل قليلا من باقه ورد من الأم الذكور. وضع كيس عازل على عناقيد وتأمين حقيبة في القاعدة مع مشبك الورق. هذا قد يكتمل في يوم 2 مرة واحدة في عناقيد من الوالد الذكور بدء anthesis.
   5. خلال الوقت تتفتح في الصباح من يوم 2 ويوم 3، ونفض الغبار أو يهز الكيس عازل للالتسهيلاتالتلقيح إيتات. الاستمرار في نفض الغبار أو يهز عناقيد كل 15 دقيقة طوال كامل مدة anthesis في الصباح (بين 9:00 صباحا 11: 00 AM). إزالة عناقيد الأم الذكر بعد التلقيح وتسمية الجانب الآخر من الزهور أزهرت على باقه ورد عاجزة. تسجيل عدد من الزهور أزهرت على باقه ورد من كل من الوالدين الإناث.
7. مرة واحدة تم إجراء التلقيح، ضع حقيبة مخصصة الخبز الصغير مثقبة لتغطية باقه ورد من الأم للإناث وتأمين في القاعدة باستخدام تطور التعادل بعد التلقيح حتى حصاد البذور.

5. حصاد البذور

1. بذور الحصاد بعد 2 أسابيع (14-16 يوما) من يوم التلقيح. وضع علامة في نفس كيس من البذور. البذور التي تحمل علامات حمراء على كلا الجانبين تمثل البذور التي نتجت عن الصليب الوراثية للرقابة. ومن المتوقع أن تكون هذه السلاله هجين الأباعد.
2. تجاهل أي البذور بدون علامات حمراء لأنها تمثلبذور الزهور التي تنتج عن ضعت حديثا بعد خصاء. سوف البذور مع علامات حمراء على جانب واحد فقط من المرجح تمثل البذور الناتجة من التلقيح الذاتي لأنها لم تزهر في الوقت الذي أجريت الصلبان التي تسيطر عليها.
3. البذور الجافة في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام في مجفف البذور. البذور المجففة مخزن في المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) أو في غرفة البذور (T: 4.0 ° C ± 1.0 درجة مئوية، RH: 20٪ ± 1٪).

النتائج

في هذه الدراسة، استخدمنا S. التسلسل VIRIDIS الانضمام A10.1 كأصل الإناث، وS. المعدلة وراثيا خط VIRIDIS (أيضا A10.1) التي تحتوي على الجين مراسل المكتب المركزي للاحصاءات ⁴ كما ذكر الوالد لجميع pollinations. تم استخدام النظام النمو الأمثل لمزامنة المزهرة كما هو مبين في الشكل 1. اختبرناها عدة مجموعات من درجة حرارة ووقت المعالجة الحرارية للخصي وأشار إلى أن حوالي 40-80٪ من الزهور على الاحتفاظ باقه ورد عاجزة أزهرت في ^الثاني يوم 2 بينما أزهرت الباقي في اليوم ^الثالث 3 (الشكل 2). ومع ذلك، إذا كانت المعالجة الحرارية شديدة جدا، للحصول على مثال، 49 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، وعدد قليل جدا أو معدومة الزهور أزهرت في ^الثاني يوم 2. تم إجراء تلاقح في ^{الثاني و2} أو 3 يوم ^الثالث بعد خصاء، والتي كانت تعتمد على وقت الذروة من anthesis من الآباء الذكور.

كان observإد أن الزهور الشباب استمر لتطوير بعد خصاء، ونضجت والتلقيح الذاتي pollinations بعد 3-6 أيام للرقابة. بعد 7-10 أيام آخر التلقيح، والزهور التي هي بيضاء اللون واضحة على باقه ورد. وغير مخصبة هذه الزهور البيضاء إما بسبب ضرر الحرارة أو ضعف التلقيح. في نفس الوقت، والزهور التي تم التلقيح بنجاح البدء في تحمل بذور الظلام وبدء تحطيم بعد 14 يوما. بذور الظلام مع علامات حمراء المقطوع ^بتاريخ اليوم 14 بعد التلقيح يمكن تمييزها بوضوح من البذور بدون علامات الحمراء التي كانت لا تزال خضراء، ولم تتحطم. إذا تأخر الحصاد، وanthecium من البذور مع وبدون علامات حمراء على حد سواء بدوره الظلام، مما يجعل من الصعب التمييز بسرعة البذور مع علامات حمراء في برك المقطوع.

لتحسين أجريت بروتوكول المعبر عدة تجارب المعالجة الحرارية على النحو الموجز في الجدول 1. في المتوسطتم انتشال 0-10 بذور / باقه ورد من مختلف التجارب المعالجة الحرارية. بعد الحصاد، والبذور المجففة في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام في مجفف البذور تليها إزالة anthecium باستخدام مزيل anthecium. بعد إزالة anthecium، كانت ملطخة بذور F1 المفترضة مع المكتب المركزي للاحصاءات حل تلطيخ، وآله هجين الأباعد ملطخة اللون الأزرق في 1-2 ساعة (الشكل 2F). بناء على هذه النتائج، فإننا نوصي المعالجة الحرارية من 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة. وعلاوة على ذلك، فإننا نوصي بأن الصلبان أن يؤديها على حد سواء يوم 2 ويوم 3 التالية خصاء.

لدراسة فعالية هذه التقنية في أداء الصلبان مع الانضمام الهلبانة الأخرى أو الأنواع، والصلبان بين S. VIRIDIS A10.1 وثمانية متنوعة S. الانضمام VIRIDIS واحدة S. أجريت pumila الانضمام. على الرغم يوما لالمزهرة المتنوعة بين الانضمام وجدنا أن الزهور من كل ثمانية S. الانضمام VIRIDIS واحدة S.pumila الانضمام يبدأ الافتتاح بين 10:00 حتي 11:00 مع وقت الذروة الافتتاح في 10:20 حتي 11:00 بعد العلاج البارد قبل الفجر. هذا يشير إلى أن علاج البرد قبل الفجر يمكن تطبيقها على الانضمام الهلبانة متنوعة. تم استخدام المعالجة الحرارية من 48 درجة مئوية لمدة 5-6 دقيقة إلى إضعاف S. VIRIDIS A10.1 الذي كان يستخدم كأصل الإناث لجميع الصلبان التي يؤدونها. نحن تعافى من واحد إلى 12 البذور من الصلبان بين A10.1 وثلاثة من S. متنوعة الانضمام البلدي وستة البذور من كرة عرضية واحدة بين S. VIRIDIS A10.1 واحد S. pumila الانضمام. ومع ذلك، في هذا الوقت أننا لم تحدد إذا أدت هذه البذور من testcross ناجحة أو كانت نتيجة لتلوث الذاتي. بغض النظر، وتشير هذه النتائج الأولية أن ظروف النمو تستخدم لS. VIRIDIS A10.1 يمكن استخدامها لتوليد الصلبان مع متنوعة S. الانضمام البلدي وربما أنواع أخرى من الهلبانة.

درجة الحرارة الحرارة علاج (° C) الوقت الحرارة علاج (دقيقة) # الصلبان ج. # من الزهور بعد تقليم يوم من التلقيح (بعد يوم emasc) ج. # بذور (الأحمر) / باقه ورد (يعني) ج. جوس٪ (+) / بذور (الأحمر) ج. بذور # HYB (جوس +) دقيقة # HYB البذور بذور HYB ماكس # 47 10 2 27 2nd اليوم 0 0 0 0 0 48 3 3 36 2nd اليوم 5 60 3 1 5 4 3 25 يوم 3 10 50 5 3 7 5 8 25 2nd اليوم 5 60 3 1 6 6 3 25 2nd اليوم 4 75 3 0 4 7 4 24 2nd اليوم 3 33 1 0 4 7 1 25 يوم 3 4 75 3 N / A N /A 49 1 3 23 2nd اليوم 5 25 1 0 2 2 7 26 2nd اليوم 8 25 2 0 4 3 5 22 2nd اليوم 0 0 0 0 1 4 4 25 2nd اليوم 0 0 0 0 0

الجدول 1. تعظيم الاستفادة من المعالجة الحرارية للخصاء. نتائج تغيير كل من درجة الحرارة والوقت من المعالجة الحرارية. أجريت Pollinations واحد (2 ^{الثانية} يوم) أو يومين (3 اليوم ^{الثالث)} التالية خصاء وoutcrosses ناجحة لياليمحفور مع المكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ

الشكل 1. وتظهر الأمثل ظروف النمو مع غرفة قبل الفجر علاج البرد. درجة الحرارة وفترات زمنية للنمو الأمثل والتزامن من إنتاج الزهور. تظهر الأسهم الخضراء والحمراء النافذة الأمثل لأداء الصلبان وخصاء، على التوالي.

الشكل 2. إعداد باقه ورد لمعبر والمكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ من ذرية هجين الأباعد. (A) A باقه ورد من الهلبانة البلدي A10.1 قبل التشذيب، والتي تبين ما يقرب من 1/10 من الزهور فتح. ويرد الأقسام الأربعة والاتجاهية في تطور anthesis على طول الدالية. (ج) باقه ورد عاجزة بعد إزالة شعيرات. (د) باقه ورد عاجزة في يوم 2 بعد خصاء، والتي تبين الزهور التي تتفتح (صورة التي مأخوذة في الساعة 10:30 ص). (E) وباقه ورد من الأم الذكور (المعدلة وراثيا الهلبانة البلدي خط A10.1 يحمل β غلوكورونيداز (المكتب المركزي للاحصاءات) مراسل الجينات) التي تتفتح بعد العلاج قبل الفجر (صورة التي مأخوذة في الساعة 10:30 ص). A من خلال البريد، والحانات نطاق = 1 مم. (F) المزعومين ذرية هجين الأباعد بعد تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات لمدة 2 ساعة تليها distaining في 70٪ (V / V) الايثانول. بذور اثنين من الناحية اليمنى هي الضوابط السلبية والإيجابية، على التوالي.

الرقم 3. تدفق الرسم البياني للبروتوكول تمثيل التخطيطي من مالخطوات ajor المشاركة في أداء S. VIRIDIS الصلبان.

المناقشة

أهمية العلاج قبل الفجر

للحصول على وتيرة عالية من ذرية هجين الأباعد فمن الضروري أن يكون anthesis متزامن للغاية من الآباء الذكور والإناث. في البداية، ونحن تدوير الأنظمة درجة الحرارة والضوء (31 ° C/22 ° C، اليوم / ليلة) واستخدمت S. VIRIDIS الانضمام A10.1 لجميع pollinations. في ظل هذه الظروف، فإن معظم الزهور فتح في الصباح الباكر قبل ارتفاع درجات الحرارة إلى 31 درجة مئوية، على الرغم من بعض الزهور مفتوحة بشكل عشوائي بين الساعة 8:00 AM-8: 00 AM. دراسات سابقة في S. ITALICA تشير إلى أن الوقت من اليوم، والموقع والموسم تسهم في الاختلاف في anthesis ^7،15،16. سيليس وآخرون. احظت أن ⁶ anthesis كان مرتبطا مع التغيرات السريعة في درجات الحرارة والرطوبة، ولكن ليس مع انخفاض درجة الحرارة والرطوبة العالية، في حد ذاته، كما اختتمت في الدراسات السابقة ^7،15. لذلك، قمنا بتوظيف قبل الفجر علاج البرد من 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (من الساعة 8:30 AM-9: 00 ص) إلى تقليدالشرط قبل الفجر الطبيعية. هذا العلاج البارد قبل الفجر ساعد في مزامنة anthesis في الوالدين. لاحظنا أنه على الرغم من تحديد غرفة لمستويات الرطوبة النسبية 50٪، وزيادة الرطوبة النسبية داخل الغرفة إلى مستوى فوق 70٪ كما انخفضت درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 15 درجة مئوية، واستمرت في البقاء فوق 70٪ حتى درجة حرارة وارتفعت تدريجيا إلى 31 درجة مئوية بعد 9:30 صباحا. في الساعة 9:00 صباحا، عاجزة الآباء الإناث ويتم جلب النباتات من الأم الذكور إلى المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪). الزهور من الآباء الذكور بدء الافتتاح حوالي 10:10، ويمكن إجراء التلقيح الساعة 10:30 AM-11: 00 PM. وترد قائمة مفصلة لجميع الكواشف والمعدات في الجدول 2.

أهمية إعداد باقه ورد لخصاء

في ظل الظروف الغرفة في هذه الدراسة (الشكل 1)، ومدة تتفتح باقه ورد الأولية تراوحت2-3 أيام. عادة، والزهور التي تقع في منتصف البعيدة من الإزهار (الشكل 2A) أولا فتح وفتح قريب وبشكل أقصى يسبق. العدد المثالي من الزهور إلى الإبقاء على باقه ورد هو 20-30. وينبغي اتخاذ الحذر أثناء إزالة الزهور غير ناضجة بحيث يتم الاحتفاظ فقط الزهور متطورة (في أعلى زهرة أو أكبر على السنيبلات ^17). وضع العلامات مع علامة حمراء على كلا الجانبين من الزهور يساعد على تمييز كفاءة ذرية هجين الأباعد المفترضة من البذور من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن يترك شعيرات على عناقيد قبل خصاء لحماية زهيرات من ضرر الحرارة واسعة، ولكن كخيار، ويمكن إزالتها بعد خصاء باستخدام مقص الربيع من أجل تسهيل عملية التلقيح، وخصوصا عندما ملزمة لباقه ورد ويستخدم تقنية (أرقام 2C و 2D).

الأمثل لدرجة الحرارةمدة العلاج د لمعالجة المياه الدافئة

الأساس لخصاء من خلال غمس الماء الدافئ هو أن حبوب اللقاح هو أكثر حساسية للحرارة من سطح بغيض. ومع ذلك، فإن مدة ودرجة حرارة المعالجة الحرارية قد تختلف بين الأنواع الهلبانة والانضمام. بشكل عام، فإن درجة حرارة أعلى مع وقت العلاج أقصر أو انخفاض درجة الحرارة مع الوقت العلاج يعد لها نفس التأثير على خصاء. وقد أفيد أن المعالجة الحرارية من 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو ¹⁰ 47 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ¹⁴ المقدمة S. لم يحدد ITALICA حبوب اللقاح غير قابلة للحياة، ولكن كفاءة هذه العلاجات. وقد وضعنا لدينا بروتوكول التالية فرضية أنه في ظل درجة حرارة الوجه الأمثل، ومدة العلاج، وحبوب اللقاح من كل الزهور على الاحتفاظ سوف الوالد الإناث تكون غير قابلة للحياة في حين الوصمات ستبقى تقبلا. ومع ذلك، بعد مقارنة وتحليل آثار العديد من درجات الحرارة وفترات العلاج (الجدول 1)، وجدنا أن حساسية إلى المعالجة الحرارية تختلف بين الزهور الإبقاء على كل الدالية، وبالتالي فإنه من الصعب للقضاء على البذور الناتجة من التلقيح الذاتي تماما. نستنتج أن كفاءة إنتاج ذرية هجين الأباعد هو أعظم عندما يتم تنفيذ العلاجات في 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة في S. VIRIDIS الانضمام A10.1.

وقت الذروة من anthesis وتلاقح

عندما تصل إلى النضج والزهور على وشك فتح، المتك هي بيضاء صفراء اللون ويسفك حبوب اللقاح في أقرب وقت exsert المتك من الزهور ^8. المتك تتحول تدريجيا البني بعد إلقاء حبوب اللقاح حيث تبدأ الزهور إغلاقه. بمجرد الافراج عنهم، والجدوى من حبوب اللقاح غير معروف. لذا، فمن الأهمية بمكان أن استخدام حبوب اللقاح من الزهور فتح أو فتح حديثا على الأصل الذكور في أقرب وقت ممكن. في ظل ظروف لدينا غرفة (الشكل 1)، فإن غالبية ابحث عن المزيدالتمرير من الآباء الذكور تبدأ في فتح الساعة 10:10 صباحا والزهور فتحت تسليط حبوب اللقاح الساعة 10:30 PM. وبالتالي، فإن من المرغوب فيه نافذة لأداء التلقيح هو 10:30 حتي 11:00. تبقى الوصمات خارج glumes بعد الزهور وثيقة وتقبلا قد يكون لحبوب اللقاح. وقد لوحظ هذا في السابق، وأكد في S. ITALICA أن الوصمات هي تقبلا لمدة 48 ساعة بعد الافتتاح سيليس زهرة وآخرون. ^6، ولذلك فمن المهم أن حقيبة عناقيد التالية المعالجة الحرارية وبعد أداء الصلبان التي تسيطر عليها. كما نوقش أعلاه، نوصي pollinations الأداء على حد سواء يوم 2 ويوم 3 بعد خصاء.

طرق للتلقيح

قارنا كفاءة ثلاث تقنيات التلقيح. إذا تتفتح الزهور لا يحد، باقه ورد إلى باقه ورد التلقيح هو الأسلوب الأكثر فعالية وسوف تسفر عن عدد أكبر من ذرية هجين الأباعد. إذا عناقيد تتفتح تحد، تردد أعلى من سوسيتم إنتاج ذرية utcross عندما يتم استخدام الأسلوب العضو الذكري إلى وصمة العار. لقد حصلنا على ذرية هجين الأباعد من الطريقتين بنجاح. وقد استخدم أسلوب "عناقيد ملزمة" في عبور S. ITALICA ⁶ لكننا وجدنا هذا الأسلوب ليكون الأسلوب الأقل كفاءة باعتبارها نافذة الوقت لحبوب اللقاح سفك الوالد الذكور قصيرة. علاوة على ذلك، هناك أقل من السيطرة على التلقيح وشعيرات على S. قد عناقيد VIRIDIS أيضا تعيق حركة حبوب اللقاح على سطح بغيض.

حصاد البذور، والتجفيف والتخزين

بعد الحصاد، وينبغي أن يجفف في البذور 30-33 درجة مئوية لمدة 2 ايام. Anthecium يجب إزالة لتلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، إذا لزم الأمر. يجب أن يتم تخزين البذور في مكان بارد وجاف (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) للتخزين على المدى القصير (أقل من سنتين) أو في غرفة البذور (T: 4.0 10 ° C ± 1.0 درجة مئوية، RH: 20٪ ± 1٪) للتخزين على المدى الطويل.ظروف التخزين السيئة قد تؤدي إلى انخفاض معدلات بقاء ^8. وقد لاحظنا أن معدل إنبات S. VIRIDIS A10.1 ما يقرب من 5٪ عندما زرعت بعد 4 أيام الحصاد، ولكن يمكن زيادتها إلى 90-96٪ بعد التخزين في المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) ل110 يتبع أيام ما بعد الحصاد من قبل الطبقات لمدة ثلاثة أيام في -80 درجة مئوية إلى كسر سكون البذور. لالطبقية في -80 درجة مئوية، والبذور الجافة يمكن وضعها في وعاء محكم (مثل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة أو مغلف عملة في كيس من البلاستيك مختوم) والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمدة 3 أيام قبل الزراعة. بعد 16 شهرا من التخزين في المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪)، لا يزال من الممكن الحصول على نسبة الإنبات من 90-95٪. بالإضافة إلى ذلك، لكسر السكون، والبذور يمكن أن تجفف في 30-33 درجة مئوية لمدة 2 أيام بعد الحصاد، وقدمت بعد ذلك التقسيم الطبقي لمدة ثلاثة أيام في -80 درجة مئوية تليها إزالةanthecium قبل الزراعة. بعد هذه العلاجات، ويمكن تحقيق معدلات إنبات البذور لمدة تصل إلى 33٪.

المزايا والقيود والتعديلات الممكنة

هنا نقدم البروتوكول القياسي الأول لأداء الصلبان في S. VIRIDIS A10.1 باستخدام المعالجة الحرارية للخصاء. وعلى النقيض من خصاء المادية، وهذا البروتوكول هو أقل الغازية وسهلة نسبيا للوضع في المختبر. وعادة ما يستغرق حوالي 15 دقيقة لتقليم باقه ورد واحد وحوالي 15 عناقيد ويمكن خفض وعبرت / شخص / يوم. على افتراض ما معدله 3-5 هجين الأباعد ذرية / الدالية يمكن استردادها في ظل ظروف الأمثل، ما مجموعه 45-75 ذرية هجين الأباعد يمكن أن تنتج من قبل شخص واحد في يوم واحد. علاوة على ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها على الصلبان في الأنواع الأخرى الهلبانة، على الرغم من التحسينات الإضافية سوف تكون على الأرجح. إذا كان مساحة محدودة غرفة النمو، والنباتات يمكن زراعتها في البيت الأخضر أو ​​دوائر النمو دون trea قبل الفجرtment حتى يخرج باقه ورد قبل أن يتم نقلها إلى غرفة الظروف الأمثل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مقص ، ربيع	World Precision Instruments، Inc	14126
ملقط ، لوازم SPI مصقولة من Dumostar Biology		TD5BP-XD
مقص جراحي	FST (أدوات العلوم الدقيقة)	14005-12
أكياس خبز مقرمشة من مادة البولي بروبيلين الشفافة 6 × 28 بوصة	http://www.pjpmarketplace.com< / a>	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
مترو ميكس 360	هوميرت إنترناشيونال	10-0356-1
جاك 15-16-17	هوميرت إنترناشيونال	07-5925-1
كيمويبس	في دبليو آر إنترناشيونال	34120
دائمة من Sharpie Ultra Fine Point ، Red	Staples	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband المكبر ، تكبير 3.5x ، 4 بوصات البعد البؤري	Amazon	DA-10 ، B0015IP380
12 بوصة 24/7 التعبئة والتغليف آلة ختم الحرارة اليدوية النبضية آلة ختم الحرارة بولي الختم الحرة	قبضة Amazon	N / A
حمام مائي	VWR نموذج علمي	: 1166
BDW المشي في غرفة نمو النبات	Conviron	BDW 40