يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

ملخص

تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا ^{2 +،} sphingomyelinase والعوامل الأخرى على إصلاح غشاء البلازما.

الملخص

إصابة غشاء البلازما هو الحدث بشكل متكرر، والجروح يتعين إصلاحه بسرعة لضمان البقاء على قيد الحياة الخلوية. تدفق كا ^{2 +} هو حدث يشير المفتاح الذي يقوم بتشغيل إصلاح الجروح الميكانيكية على غشاء البلازما داخل ~ 30 ثانية. وكشفت الدراسات الحديثة أن خلايا الثدييات أيضا ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع المسام تشكيل السموم في كا ^{2 +} التي تعتمد على عملية ينطوي على إيماس من sphingomyelinase حمض انزيم الليزوزومية تليها المسام الإلتقام. هنا، نحن تصف المنهجية المستخدمة لإثبات أن إعادة عزل الخلايا permeabilized من قبل O السم ستربتوليزين هو أيضا سريع وتعتمد على كا ^{2 +} تدفق. تصميم مقايسة يسمح تزامن هذا الحدث الضرر وقياس الحركية الدقيقة للقدرة الخلايا على استعادة سلامة غشاء البلازما عن طريق التصوير وقياس مدى الذي الصبغة liphophilic FM1-43 تصل إلى أغشية الخلايا. هذا المرض فحص الحيةس يسمح بتقييم الحساسة من قدرة خارجيا أضاف العوامل القابلة للذوبان مثل sphingomyelinase لمنع تدفق FM1-43، مما يعكس قدرة الخلايا على إصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم. يسمح هذا الاختبار لنا لإظهار للمرة الأولى التي sphingomyelinase يعمل المصب من كا ^{2 +} إيماس التي تعتمد، منذ بالإضافة خارج الخلية من الانزيم يعزز إعادة عزل الخلايا permeabilized في غياب كا ^{2 +.}

المقدمة

وقد كان من المعروف لعدة عقود أن إصلاح غشاء البلازما بعد الإصابة الميكانيكية هو ^1،2 كا ^{2 +} التي تعتمد عملية. وأظهرت الدراسات فيما بعد أن كا ^{2 +} تدفق من خلال الجرح يطلق عملية نشطة من إيماس من الحويصلات داخل الخلايا في موقع الإصابة، وهو مطلوب لإعادة عزل ^3،4. تم استخدام معدل فقدان صبغة الفلورسنت تحميلها في سيتوبلازم الخلايا لتقييم سرعة إصلاح، وخلص إلى أن اكتمل إعادة عزل داخل <30 ثانية بعد الإصابة ^5. واقترحت في البداية نموذجين لشرح متطلبات إيماس في إصلاح غشاء البلازما: 1) نموذج "التصحيح"، مما يوحي بأن كا ^{2 +} تدفق من خلال الآفة يؤدي الانصهار في البداية مثلي النمط من الحويصلات داخل الخلايا، وتشكيل كبير "التصحيح" التي من شأنها أن ثم تطبيقها على غشاء البلازما لختم الجرح ⁶ و 2) نموذج خفض التوتر، الذي اقترح أن غشاء عديد بواسطة كا ^{2 +} إيماس التي تعتمد في محيط الجرح من شأنه أن يقلل التوتر غشاء البلازما، وتسهيل إعادة إغلاق طبقة ثنائية ^7. وقد تعزز دور كا ^{2 +} إيماس أثار في البلازما إصلاح غشاء مزيدا من الدراسات التي تبين أن الجسيمات الحالة تحتوي على جزيء كا ^{2 +} الاستشعار، synaptotagmin السابع، مما يسهل إيماس والبلازما إصلاح غشاء الخلايا المصابة في ^8،9،10،11 .

ومع ذلك، فقد أشارت الأدلة الإضافية التي إيماس وحده لم يكن كافيا لتعزيز إصلاح غشاء البلازما. بالإضافة إلى الدموع الميكانيكية على غشاء البلازما، وهو شكل المتكرر للإصابة الخلية هو permeabilization بواسطة السموم تشكيل المسام التي تنتجها البكتيريا ^12،13 أو ^14،15 الخلايا المناعية. على عكس الدموع الميكانيكية والبروتينات المكونة للمسام إدراج نفسها على غشاء البلازما تشكيل مستقرة، المسام مبطنة البروتين الذي لا يمكن أن يتم إغلاقه ببساطة عن طريق تطبيق غشاء "التصحيح" أو احمرارجي التوتر الغشاء. يثير الاهتمام والفضول، وكشفت الدراسات أن خلايا الثدييات لديها آلية فعالة لإصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع البروتينات التي تشكل المسام، وهذه العملية تتطلب أيضا وجود خارج الخلية كا ^{2 + 12.} أثارت هذه النتيجة مسألة ما إذا كان إزالة الغشاء مسام من سطح الخلية أيضا عملية سريعة، كما لوحظ مع الجروح الميكانيكية ^5. من المستغرب، كشفت الدراسات التي أجريناها مؤخرا أن إعادة عزل الخلايا permeabilized مع السموم تشكيل المسام لها خصائص مشابهة جدا لإصلاح الجروح الميكانيكية: تتطلب عملية خارج الخلية كا ^{2 +،} وتكتمل في غضون 30 ثانية ~. التحقيق هذه العملية في مزيد من التفاصيل، علمنا مؤخرا أنه بالإضافة إلى كا ^{2 +} إيماس تنظيما من الجسيمات الحالة، ينطوي إصلاح غشاء البلازما شكل السريع لالإلتقام، والتي يتم تشغيلها من قبل الإفراج عن انزيم الليزوزومية sphingomyelinase حمض (ASM) وضروري ليس فقط لعشرإزالة (ه) من المسام عبر الغشاء، ولكن أيضا لإصلاح الجروح الميكانيكية ^16.

لتحديد حركية إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، في المختبر لدينا نحن تكييفها منهجية التصوير الحية التي كانت تستخدم في السابق لتقييم إعادة إغلاق ألياف العضلات المعزولة بجروح الليزر ^17. يعتمد هذا الاختبار على خصائص صبغ محبة للدهون FM1-43، والتي intercalates ثابت في النشرة الخارجي من طبقات ثنائية الدهون وزيادة في كثافة مضان. عندما تعطل البلازما طبقة ثنائية الغشاء مكاسب صبغ خارج الخلية أغشية الخلايا الوصول إلى، وتوفير الفحص الحساسة للكشف عن إصابة غشاء البلازما وإصلاح ^{18،16،19،20.} للتكيف مع هذا الاختبار لتقييم إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، ونحن الخلايا ما قبل المحتضنة في 4 درجات مئوية مع السم البكتيري ستربتوليزين O (سلوفاكيا)، الذي يربط لغشاء الكولسترول ^21. خلية متزامنويمكن بعد permeabilization أن يتحقق بسهولة عن طريق نقل الخلايا من الجليد لتدفئة المتوسطة في مرحلة المجهر ساخنة، والتي ينشط oligomerization والتغيير في التشكل الذي يؤدي إلى تشكيل المسام عبر الغشاء. ميزة هذا النهج، على المقايسات التي تم نشرها مسبقا باستخدام الليزر جرح، غير أن عددا أكبر من الخلايا يمكن تحليلها في وقت واحد في حقل المجهرية، وتوفير أفضل أخذ العينات من السكان الخلية. نظرا للتشابه بين الآلية عملية إعادة عزل الخلايا ينظر بعد الإصابة الميكانيكية وpermeabilization مع السموم تشكيل المسام، مقايسة وصفنا هنا يوفر طريقة مرنة للغاية وقوية لتشريح العوامل التي تدخل في عملية الأساسية للإصلاح غشاء البلازما. كمثال على ذلك، وتبين لنا أنه من الممكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الخطوات كا ^{2 +} التي تعتمد ومستقلة عن عملية الإصلاح.

البروتوكول

1. النسخي إسكات ASM

1. البذور 1.5 × 10 ⁵ خلايا هيلا في 2 مل من وسائط النمو DMEM (DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ بنسلفانيا-بكتيريا) على الأطباق 35 ملم أسفل الزجاج (ماتيك) و احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
2. في اليوم التالي، نضح قبالة سائط النمو واستبدالها 2 مل DMEM انخفاض مصل المتوسطة (DMEM مع 4٪ FBS)، لا يقل عن 1 ساعة قبل إضافة الخليط ترنسفكأيشن سيرنا.
3. إعداد 4 أنابيب لسيرنا خليط بنسبة ضئيلة ترنسفكأيشن. في أنابيب A و C، إضافة 250 ميكرولتر Optimem خفض المصل و 4 ميكرولتر Lipofectamine RNAiMax، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب B، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من التحكم في المحتوى GC المتوسطة بنسبة ضئيلة (التحكم سيرنا)، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب D، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من SMPD1 بنسبة ضئيلة (siASM)، في 35 مم طبق رس يتم transfected. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4. الجمع بين أنابيب A و B لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن للتحكم سيرنا، وأنابيب C و D لASM سيرنا. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
5. إضافة عنصر تحكم سيرنا وسيرنا ASM مخاليط رد فعل ترنسفكأيشن ببطء، قطرة قطرة، في أطباق 35 ملم الزجاج السفلي منها واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO _2. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، نضح بلطف وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائط النمو DMEM الطازجة. لكفاءة ضربة قاضية ASM، الأطباق ينبغي حضنت أخرى في 37 درجة مئوية / 5٪ CO ₂ لمدة 31 ساعة (ما مجموعه 55 ساعة) قبل التصوير الحي.

2. إعداد الكواشف لايف المجهر

1. يعد حل المؤتلف تشكيل المسام السم ستربتوليزين O (سلوفاكيا) بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X الباردة دون كا ^{2 + 2 +} والمغنيسيوم. وسلوفاكيا المستخدمة في هذه المقايسات هو constitutivelذ متحولة السيستين النشطة التي لا يتطلب الحد من وكلاء للنشاط، شريطة التفضل الدكتور رود Tweten، جامعة ولاية أوكلاهوما. وأعرب عن السم في E. القولونية BL21 DE3 وتنقيته في ظل ظروف الأم، كما هو موضح سابقا ^16.
2. إعداد محلول المخزون FM1-43: في resuspend FM1-43 مسحوق مجفف بالتجميد في DMSO لإيجاد حل 25 ملم.
3. إعداد الحل ج: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة مع كا ^{2 +} إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر (وهناك حاجة إلى 1.5 مل لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد لحين الحاجة إليها.
4. إعداد الحل B: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة دون كا ^{2 +} و 10 ملي EGTA (كا ^{2 +} خالية من DMEM) إلى التركيز النهائي من 4 ميكرومتر (1.5 مل المطلوبة لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد حتى الحاجة.
5. قبل دافئ (37 درجة مئوية) 1 مل aliquots من الحل والحل A B في أنابيب إيبندورف.
6. الحفاظ على حلول الجليد من DMEM مع كا ^{2 +،} C و^{2 +} خالية من DMEM.

3. التصوير خلية حية من FM1-43 تدفق في سلوفاكيا المعالجة وغير المعالجة الخلايا

1. ملء متوسطة الحجم حاوية معدنية الضحلة مع الثلج المجروش، عكس ذلك في وعاء زجاجي كبير مع الثلج، والجليد إضافة إضافية ولم يتبق سوى السطح السفلي من الحاويات المعدنية المكشوفة. وضع منشفة ورقية مبللة في القاع المعدن يتعرض للسماح لنقل حتى الحرارية.
2. تأخذ واحدة تحكم سيرنا المعاملة طبق ماتيك (نموذج 1) ووضعه على منشفة ورقية رطبة باردة. نضح بلطف من جميع وسائل الإعلام وغسل 3X مع البرد كا ^{2 +} خالية من DMEM. بعد غسل الماضي، ونضح من جميع وسائل الإعلام في الطبق.
3. لصورة الخلايا المرتبطة FM1-43 في الخلايا مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 1) في وجود كا ^{2 +،} إضافة 180 ميكرولتر من الحل الباردة B إلى ساترة الزجاج وسط الطبق 35 ملم أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقيقة على الجليد (الجدول 1).
4. وضع الطبق ماتيك على مرحلة المجهر متحد البؤر تسخينها إلى 37 درجة مئوية، وغرفة مجهزة البيئية (التي تحافظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون مستويات _2). العثور على مجال الخلايا التي سيتم تصويرها يبحث من خلال 1.3 الهدف 40X NA (نيكون). إذا كانت متوفرة، بدوره على PerfectFocus أو جهاز مماثل لتصحيح الانحراف الحراري.
5. إضافة 1 مل من prewarmed الحل A بلطف إلى جانب 35 ملم صحن واستبدال غطاء غرفة البيئية (الجدول 1).
6. الحصول على صور لمدة 4 دقائق في 1 الإطار كل 3 ثانية باستخدام برامج التصوير المناسبة (Volocity في نظام الغزل متحد البؤر المجهري القرص UltraView فوكس بيركن إلمر). ويتم إنجاز الإثارة من FM1-43 مع خط ليزر 488 نانومتر باستخدام فلتر مزدوج اللون مع تمريرة الفرقة 488 نانومتر، ويتحقق من خلال التمييز الانبعاثات استخدام فلتر 527 (W55) الانبعاثات. يتم تعيين مستويات الطاقة ليزر وحساسية الكاميرا لتحقيق التعرض صورة 100 ميللي ثانية.
7. كرر الخطوات من 3،2-3،6 لكشف FM1-43 في التحكم في الخلايا سيرنا المعاملة مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 2) في غياب كا ^{2 +،} إلا أنه في الخطوة 3.5 B الحل ينبغي أن تضاف (الجدول 1).
8. لقياس تدفق FM1-43 في الخلايا تحكم سيرنا المعاملة أصيب سلوفاكيا إما في وجود (نموذج 3) أو عدم وجود كا ^{2 +} (نموذج 4)، إضافة 180 ميكرولتر من محلول B الباردة التي تحتوي على سلوفاكيا لساترة الزجاج وسط 35 ملم صحن أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد كما في الخطوة 3.3. كرر الخطوات من 3.2 خلال 3.6؛ ضبط مضيفا الحل إما A أو B في الحل خطوة 3.5 (الجدول 1).
9. لتحديد دور ASM في البلازما إصلاح الغشاء، كرر الخطوات من 3،2-3،6 باستخدام الخلايا المعالجة سيرنا ASM لجميع الظروف (عينات 5-8) (الجدول 1).
10. لتحديد دور sphingomyelinase المؤتلف خارج الخلية (SM) علىحركية إصلاح غشاء البلازما (التي تعكسها وتثبيط في FM1-43 التدفق) (عينات 9-10)، يضاف SM (0-50 μU) إما الحل أو الحل A B في الخطوة 3.5 ثم تضاف إلى الخلايا خلال الخلية الحية التصوير في إجمالي حجم 1 مل (الجدول 1).

4. الكمي للFM1-43 تدفق إلى خلايا

1. بعد أن تم الحصول على الأفلام، وقياس كثافة مضان الخلايا من FM1-43 باستخدام برمجيات تحليل الصور (Volocity جناح، PERKINELMER). رسم المنطقة من اهتمام في المنطقة عصاري خلوي من كل خلية في الميدان وتطبيق أدوات البرمجيات لتحديد متوسط ​​FM1-43 كثافة مضان في جميع إطارات من الفيديو.
2. لضبط الاختلافات في الأولي FM1-43 تلطيخ، يتم التعبير عن البيانات لكل الفيديو وأضعاف الزيادة في كثافة مضان بمرور الوقت، وخططوا لكل حالة مختلفة. الزيادة أضعاف في مضان من كل فرد في timepointيتم احتساب الخليوي كما F _T / F _0، حيث F _T هو مضان يعني في timepoint محددة، وF ₀ هو مضان يعني في ر = 0 (الأرقام 1-2).

النتائج

تركيزات منخفضة من البكتيريا البلازما sphingomyelinase (SM) الانقاذ إصلاح الغشاء في الخلايا المنضب في sphingomyelinase حمض الليزوزومية.

باستخدام FM1-43 فحص التصوير، وأظهرنا سابقا أن الخلايا ناقصة لASM انزيم الليزوزومية وتعرضت لاصابة في سلوفاكيا وجود كا ^{2 +} يكون هو انقاذ عيب غشاء البلازما بإضافة خارج الخلية من الانزيم الإنسان المؤتلف ^19. منذ ASM الليزوزومية البشري لديه درجة الحموضة المثلى المنخفض...

المناقشة

اعتمدت الدراسات السابقة على الإصابة الميكانيكية وإصلاح غشاء البلازما على آليات متنوعة من الخلايا جرح، بدءا من إسقاط الخرز الزجاجي، micropipetting، القص، خدش أو كشط. كانت قراءات من كل هذه المقايسات النوعية بدلا من الكمية، ولم تعطي معلومات دقيقة عن حركية آلية إصلاح. تم قياس قدرة الخلايا على ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد هذه الأشكال من الإصابة من جراء وجود أو عدم وجود استشفاف تضاف إلى السائل خارج الخلية في السيتوبلازم، اختراق غشاء كتيمة الأصباغ، وفقدان الإنزيمات عصاري خلوي ومستويا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Reagent < / strong>HeLa
229 خط الخلية	ATCC	CCL2-1
DMEM ارتفاع الجلوكوز	Invitrogen	11965
DMEM ارتفاع الجلوكوز بدون الكالسيوم	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem مصل مخفضة	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
التحكم في محتوى GC المتوسط RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
مصل الأبقار الجنيني الجوزاء	الحيوية	المعطلة بالحرارة 100-106
Sphingomyelinase من Bacillus cereus< / em>	Sigma	S7651
أطباق قاع زجاجية مقاس 35 مم	MatTek	P35G-0-14
<قوي>المواد< / قوي>
مجهر مقلوب	نيكون	كسوف Ti
كاميرا	Hamamatsu الضوئيات	C9100-50
مجهر قرص دوارة متحد البؤر	PerkinElmer	UltraViewVoX
تحليل البرامج برنامج	PerkinElmer	Volocity Suite
بيئية	أجهزة علم الأمراض	غرفة نظام LiveCell

المنتجات غرفة