الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من السلف العضلية واعدة المرشحين لاستراتيجيات العلاج بالخلايا لعلاج خلل العضلات. يصف هذا البروتوكول الزرع والقياسات الوظيفية المطلوبة لتقييم النغر والتمايز بين الخلايا الميوانجيوائية المشتقة من iPSC (نوع من السلف العضلي) في نماذج الماوس لتجديد العضلات الحاد والمزمن.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تكون iPSCs المشتقة من المريض مصدرا لا يقدر بثمن للخلايا لبروتوكولات العلاج الذاتي في المستقبل. يمكن إنشاء الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC والمشبهة بالخلايا المتوسطة المشتقة من البيريسيت (الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC) من iPSC المستمدة من الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC من الخلايا الجذعية/السلفية: IDEMs) من iPSCs الناتجة عن المرضى المتضررين من أشكال مختلفة من ضمور العضلات. يمكن تصحيح IDEMs الخاصة بالمرضى وراثيا باستراتيجيات مختلفة(مثل ناقلات العدسية ، الكروموسومات الاصطناعية البشرية) وتعزيزها في إمكانات التمايز الميوجينية عند الإفراط في التعبير عن منظم تكوين الميو دي. ثم يتم تقييم هذه الإمكانية الميوجينية في المختبر مع مقايسات تمايز محددة وتحليلها عن طريق الفلورة المناعية. يتم تقييم الإمكانات التجديدية ل IDEMs بشكل أكبر في الجسم الحي، عند زرع العضل وداخل الشرايين في نموذجين تمثيليين للفأرة يعرضان تجديد العضلات الحاد والمزمن. ثم يتم تأكيد مساهمة IDEMs في العضلات الهيكلية المضيفة من خلال اختبارات وظيفية مختلفة في الفئران المزروعة. على وجه الخصوص ، تتم دراسة تحسين القدرة الحركية للحيوانات مع اختبارات جهاز المشي. ثم يتم تقييم زراعة الخلايا والتمايز من خلال عدد من التقييمات النسيجية والمناعة على العضلات المزروعة. وعموما، تصف هذه الورقة المقايسات والأدوات المستخدمة حاليا لتقييم قدرة التمايز ل IDEMs، مع التركيز على أساليب الزرع ومقاييس النتائج اللاحقة لتحليل فعالية زرع الخلايا.
المقدمة
Mesoangioblasts (MABs) هي سلف العضلات المرتبطة بالسفينة المستمدة من مجموعة فرعية من pericytes1-3. الميزة الرئيسية للMABs على السلف العضلات الكنسي مثل خلايا الأقمار الصناعية4 يكمن في قدرتها على عبور جدار السفينة عند تسليمها داخل الشرايين، وبالتالي المساهمة في تجديد العضلات الهيكل العظمي في بروتوكولات العلاج الخلوي. وقد تم تقييم هذه الميزة وأكد في كل من نماذج مورين والأنياب من ضمور العضلات1,5,6. وقد بنت هذه الدراسات قبل السريرية الأسس لأول مرة في الرجل المرحلة الأولى / الثانية التجارب السريرية على أساس زرع داخل الشرايين من MABs المانحة HLA متطابقة في الأطفال الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين (EudraCT رقم 2011-000176-33; يجري حاليا في مستشفى سان رافائيل في ميلانو, إيطاليا). واحدة من العقبات الرئيسية لنهج العلاج بالخلايا، حيث هناك حاجة إلى مليارات الخلايا لعلاج عضلة الجسم بأكمله، هو إمكانات الانتشار محدودة من "المنتج الطبي" (الخلايا). وعلاوة على ذلك فقد ثبت مؤخرا أنه ليس من الممكن الحصول على MABs من المرضى المتضررين من بعض أشكال العسر العضلي، كما يحدث في ضمور العضلات حزام الأطراف 2D (LGMD2D؛ أوميم #608099)7.
للتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا إنشاء بروتوكول اشتقاق الخلايا الجذعية/ السلف الشبيهة ب MAB من الإنسان و الموراين iPSCs7. يولد هذا الإجراء مجموعات خلايا قابلة للتوسيع بسهولة مع توقيع جين الأوعية الدموية والنمط الظاهري المناعي مشابهة إلى حد كبير لMABs المشتقة من العضلات الكبار. عند التعبير عن العامل التنظيمي العضلي MyoD ، يخضع كل من murine و IDEMs البشري (على التوالي MIDEMs و HIDEMs) لتمايز عضلات الهيكل العظمي النهائي. لتحقيق هذا الهدف يمكن أن يتم نقل IDEMs مع ناقلات قادرة على دفع التعبير عن الميو دي، إما التأسيسية أو بطريقة لا يمكن التوصل إليها8-10. يتم استخدام ناقل العدسية التي تحتوي على الميو دي cDNA تنصهر مع مستقبلات هرمون الاستروجين (MyoD-ER) ، مما يسمح نقلها النووية على tamoxifen (التماثلية الاستروجين) الإدارة11. هذه الاستراتيجية تؤدي إلى تشكيل الميوتوب متعدد النوى الإفراط في النوى، مع كفاءة عالية7. وتجدر الإشارة إلى أن IDEMs غير أصلية ، ويمكن أن تجرف وتفرق داخل عضلات المضيف عند زرعها ويمكن تصحيحها وراثيا باستخدام ناقلات مختلفة(مثل الفيروسات العدسية أو الكروموسومات الاصطناعية البشرية) ، مما يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية تلقائية في المستقبل. وقد وصف اشتقاق وتوصيف وزرع IDEMs في المنشور أعلاه7. تفصل ورقة البروتوكول هذه المقايسات التي أجريت لتقييم التمايز العضلي المختبري ل IDEMs وقياسات النتائج اللاحقة لاختبار فعالية زرعها في نماذج الماوس لتجديد العضلات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تقييم إمكانات الميوجينيك والتطوير
-
في المختبر: التمايز الناجم عن الميود
- توليد خط خلايا مستقر من IDEMs التي يتم نقلها مع ناقل الميو دي-ER العدسي القابل للانستقراء، مما يبطل تعدد العدوى (وزارة الداخلية؛ على سبيل المثال 1 و 5 و 50) باستخدام تلطيخ وصفها في 1.1.9 (MyHC) نتيجة لكفاءة الإجراء.
- معطف طبق 3.5 سم مع 1 مل من 1٪ Matrigel واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- غسل لوحة مرتين مع المتوسطة، البذور 1 ×10 5 ميو دي-ER نقل IDEMs في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم واحتضان في 37 درجة مئوية في المتوسط النمو.
- نتوقع أن الخلايا تصل إلى التقاء في يوم أو يومين ومن ثم إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين في المتوسط النمو (1جرعة سانت).
- بعد 24 ساعة، استبدال متوسط النمو مع وسيطة التمايز تستكمل مع 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين(2 الجرعة الثانية والأخيرة).
- استبدال نصف المتوسطة مع وسط التمايز الطازجة كل يومين.
- دراسة الثقافات لتشكيل myotube يوميا.
- بعد أسبوع واحد (5 أيام في المتوسط التمايز)، وغسل لوحات بلطف مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4 ٪ paraformaldehyde لمدة 5 دقائق في RT.
- إجراء تلطيخ immunofluorescence مع الأجسام المضادة ضد سلسلة الميوزين الثقيلة (MyHC) لتأكيد وجود myotubes. مضادة مع صبغة نووية(مثل Hoechst).
يتم تقييم كفاءة التمايز كنسبة مئوية من النوى داخل الخلايا الإيجابية MyHC: انتقل إلى الخطوة التالية إذا كانت الكفاءة >50٪.
-
في الجسم الحي: engraftment في نموذج لتجديد العضلات الحادة
لتقييم مساهمة MyoD-ER IDEMs في الجسم الحي لتجديد العضلات ، تم تصنيف الخلايا سابقا بشفرة متجهة للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي سيمكن من تتبعها داخل الأنسجة. ثم يتم حقن IDEMs MyoD-ER GFP في عضلات مورين الكبار، الذين أصيبوا سابقا مع سم الميوتوكين(مثل سم القلب). لتجنب الرفض المناعي ضد الزينوجينيك (مثل HIDEMs) أو الخلايا المتلاعب بها وراثيا / المصححة ، يلزم استخدام الفئران المثبطة للمناعة أو المناعة.- Pretreat الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من 3.5 ميكرولتر / غرام من 10 ملغ / مل تاموكسيفين (شكل liposoluble) 24 ساعة قبل زرع وخلايا pretreat إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين (شكل مائي) في وسط النمو بين عشية وضحاها قبل يوم زرع.
- إعطاء التخدير والتسكين إلى الماوس باتباع المبادئ التوجيهية المحددة التي تنظم العمليات الجراحية في منشأة الحيوان.
- حقن 25 ميكرولتر من 100 ميكرومتر من سم القلب (CTX؛ من ناجا موسمبيكا موسامبيكا؛ تنبيه: مادة ضارة محتملة) في عضلات الساق الأمامية (TA).
- 24 ساعة بعد علاج الحيوانات مع تاموكسيفين وCTX، فصل الخلايا عن طريق الجربس والعد.
- الطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق.
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني، والطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +مجانا برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 106 خلايا /30 ميكرولتر، والتي ستكون الحجم النهائي لكل حقنة.
- حقن 30 ميكرولتر من تعليق الخلية في العضلات المصابة سابقا باستخدام حقنة مع إبرة 29 أو 30 غرام. إيلاء اهتمام خاص أثناء إزالة الإبرة من العضلات. القيام بذلك ببطء، وتجنب تسرب تعليق الخلية من خلال مسار الإبرة. لا زرع TA contralateral واستخدامه كسيطرة، وحقن 30 ميكروغرام من Ca2 +- و Mg2 +خالية من برنامج تلفزيوني لتكرار ظروف واحدة زرعها.
- علاج الحيوانات مع تاموكسيفين لمدة ستة أيام إضافية وإعطاء مسكن(مثل Carprofen) لمدة يومين إضافيين.
- Explant العضلات من 14 يوما بعد زرع فصاعدا. معالجة وتحليل العينات كما هو مفصل في البروتوكولين 4 و 5.
2. زرع في نماذج الماوس من ضمور العضلات
يسمح هذا الفحص زرع تقييم مدى engraftment من IDEMs في نماذج الماوس من ضمور العضلات. ويمكن أيضا تقييم الحيوانات، التي عولجت على النحو التالي، من أجل التحسين الوظيفي للنمط الظاهري للمرض. يمكن إجراء الاختبارات الوظيفية بدءا من أسبوعين بعد الزرع. من أجل تعزيز engraftment النظر في أداء ممارسة المشي قبل النقل (كما هو موضح في البروتوكول 3) و / أو حقن الخلايا التسلسلية كل ثلاثة أسابيع ل3x (أي ما مجموعه 3 حقن / العضلات).
- زرع العضلي
- Pretreat الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من 3.5 ميكرولتر / غرام من 10 ملغ / مل تاموكسيفين (تركيبة قابلة للذوبان في الدهون) 24 ساعة قبل زرع وخلايا pretreat إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين (تركيبة مائي) في وسط النمو بين عشية وضحاها قبل يوم زرع.
- فصل عن طريق المحاولة، عد والطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق.
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +خالية من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بيليه في Ca2 +- وMg2 +-FREE PBS إلى تركيز 106 خلايا/30 ميكرولتر.
- إعطاء مسكن وتطهير جلد الحيوان (اختياري) مع povidone اليود أو الكلوريكسيدين القائم على مطهر. وهذا سوف يساعد أيضا على توطين الأمامية الساق (TA), gastrocnemius (GC), وfeoris quadriceps (QC; على وجه التحديد بينميديوس vastus) العضلات.
- حقن 30 ميكرولتر من تعليق الخلية في العضلات باستخدام حقنة مع إبرة 29 أو 30 غرام. لTA، إدراج 5 مم من الإبرة 2 مم تحت إدراج وتر قريب (اتجاه craniocaudal) مع ميل 15 درجة بالنسبة إلى الساق وحقن ببطء تعليق الخلية أثناء سحب الإبرة (تفريغ الحقنة مع 2 مم من الإبرة لا تزال داخل العضلات). بالنسبة للشهادة العامة ومراقبة الجودة ، كرر نفس الإجراء المفصل عن TA ، مع الفرق الرئيسي هو إدخال caudocranial للإبرة 2 مم فوق التقاطع العضلي لوتر أخيل ل GC و 2 مم فوق وتر القاصي لمراقبة الجودة (ميل 15 درجة فيما يتعلق بعظم الفخذ). انتبه أثناء إزالة الإبرة من العضلات لتجنب انسكاب تعليق الخلية عبر مسار الإبرة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: في حالة انخفاض engraftment النظر في حقن الأحداث (1-2 أسابيع من العمر) الفئران7 مع 3 × 105 خلايا/10 ميكرولتر (لاحظ أنه في هذه الحالة تاموكسيفين يحتاج إلى أن تدار تحت الجلد).
- زرع داخل الشرايين
يسمح هذا الجزء من البروتوكول بتقييم قدرة الأجهزة المتوسطة والهايدامات على أن يتم تسليمها في الدورة الدموية الشريانية ، وعبور جدار السفينة والمساهمة في تجديد العضلات الهيكلية في العضلات المصب إلى موقع الحقن.- الحيوانات والخلايا المعالجة مسبقا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.1.1.
- فصل عن طريق المحاولة والتصفية مع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (لإزالة مجموعات من تعليق الخلية في حالة من غير المرجح أن التعرض بين عشية وضحاها لtamoxifen يمكن أن تدفع الانصهار وتشكيل الأنابيب من الخلايا المجاورة) العد والطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني ، أجهزة الطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بيليه في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني مع 0.2 الدولية
وحدات الهيبارين الصوديوم (اختياري) لتركيز الخلية النهائية من 106 خلايا/50 ميكرولتر. إضافة 10٪ براءة اختراع صبغة زرقاء (التركيز النهائي: 1.25 ملغ / مل في المالحة العادية أو Ca2 +- و Mg2 +-free PBS) إلى الحل من أجل تصور توزيع تعليق الخلية. - إعطاء التخدير والتسكين إلى الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية التي تنظم العمليات الجراحية في منشأة حيوانية مؤسسية محددة.
- حلق المنطقة الأربية (تعرف أيضا باسم مثلث الفخذ أو سكاربا) وتطهير الجلد باستخدام مطهر باليود أو الكلورهيكسيدين القائم على povidone.
- إجراء شق 5-7 ملم وترجمة حزمة الفخذ: الوريد والشريان والعصب (العصب يضع أفقيا إلى الشريان والوريد medially).
- إزالة اللفافة الضامة بلطف التي تغطي حزمة مع ملقط.
- فصل الوريد الفخذي والعصب من الشريان عن طريق إدخال بلطف غيض من ملقط (أو إبرة 30 غرام) في بينهما، وتكبير تدريجيا في حفرة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: الوريد الفخذي هش: انتبه إلى عدم قرصه مع ملقط أثناء انفصاله عن الشريان الفخذي. في حالة النزيف، واستنزاف الدم مع الشاش العقيم واستخدام الكي الدقيق لتسهيل hemostasis. - ارفع الشريان بطرف واحد من ملقط واشبك الشريان بالطرف الآخر.
- ثقب الشريان مع حقنة مجهزة إبرة 30G. حقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية المصب من المنطقة فرضت، بسرعة ضخ ما يقرب من 5 ميكرولتر / ثانية.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إعادة إنفاق الخلايا في الحقنة بعناية قبل الحقن: من الضروري تجنب هطول الأمطار على الخلايا وتشكيل فقاعة الهواء داخل الحقنة. قطر الشريان الفخذي أصغر قليلا من إبرة 30 غرام: يجب الحرص على عدم اقتطاع الشريان أثناء إدخال الإبرة. تسمح الصبغة الزرقاء براءة اختراع الاعتراف بفعالية الحقن: إذا حقن بشكل صحيح، فإن الطرف كله يتحول بسرعة الأزرق الفاتح. - إزالة الإبرة والملقط ببطء من الشريان لاستعادة مجرى الدم في الطرف.
- تطبيق الضغط مع الشاش العقيم لتجنب النزيف و / أو الكي على النحو المطلوب.
- خياطة الجرح ورصد الحيوانات حتى الشفاء من التخدير.
- إعطاء مسكن لمدة 3 أيام وفحص الجرح يوميا (في حالة العدوى الجرح مناقشة هذا الأمر مع موظفي مرفق الحيوان وإعطاء المضادات الحيوية على النحو المطلوب).
3. تدابير النتائج على الحيوانات العسر الزرع: اختبار حلقة مفرغة
بدءا من أسبوعين بعد زرع الخلايا ، من الممكن تقييم التحسين الوظيفي للقدرة الحركية للفئران المعالجة باختبارات جهاز المشي. يسمح هذا الاختبار بتقييم تحمل التمارين الرياضية / تحمل الفئران المعالجة. يعتبر الفأر مرهقا عندما يضع في منطقة الراحة لأكثر من 5 ثوان ، دون محاولة إعادة ربط جهاز المشي بعد سلسلة من 3 محفزات ميكانيكية متتالية (واحدة كل 5 ثوان). تبدأ قياسات خط الأساس قبل شهر تقريبا من العلاج وتستخدم لتقييم تحسن كل تم اختباره. يمكن أن يتبع هذا الاختبار اختبارات إضافية لمراقبة هشاشة الألياف ، وتحسين القوة ، والغراية ، وتمايز الخلايا المزروعة ، والتحسين المورفولوجي للعضلات المزروعة (انظر المناقشة).
- تأقلم الحيوانات (عادة ثلاث مجموعات: المعالجة، غير المعالجة، والتحكم البري من النوع/غير العسر) في التمرين قبل القياس الأول: تعيين جهاز المشي بسرعة 6 م/دقيقة لمدة 10 دقائق. كرر الإجراء كل يومين لمدة أسبوع واحد.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: سجل جميع القياسات في نفس الساعة من اليوم لتجنب التحيزات بسبب الدورات الإيقاعية. - ضع الحيوانات في جهاز المشي ، الذي تم إعداده سابقا بميل 10 درجة.
- بدوره على حلقة مفرغة، مع سرعة البدء من 6 م / دقيقة (توفير حافز ميكانيكي لطيف في حالة الحيوانات ليست على استعداد لبدء ممارسة).
- بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت وزيادة سرعة 2 م / دقيقة كل 2 دقيقة.
- بمجرد أن يرقد في منطقة الراحة لأكثر من 5 ثوان دون محاولة إعادة ربط جهاز المشي ، المسه برفق بعصا لتحفيز إعادة تشغيل التمرين (انظر أعلاه).
- تسجيل أداء (الوقت والمسافة) لكل.
- كرر القياسات أسبوعيا أو كل 10 أيام لمدة 3x على الأقل.
- كرر نفس الإجراء بعد الزرع.
- تحليل بيانات الأداء مقارنة قياس كل لأدائه الأساسي. نقترح رسم القيم في الرسم البياني كنسبة مئوية من متوسط القدرة الحركية بالنسبة لخط الأساس وتحليلها من خلال اختبار ANOVA أحادي أو ثنائي الاتجاه يليه اختبار ما بعد الاختبار المناسب لمقارنة المجموعات.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: استخدم ما لا يقل عن 5 حيوانات/مجموعات مطابقة للعمر والنمط الجيني والجنس وكرر القياسات لمدة 3x على الأقل بعد الزرع.
4. تقييم الحرمان من الخلايا والتمايز في العضلات المزروعة
يتم حصاد عضلات الزراعة والتحكم في الوقت المناسب (<2 يوما لتحليل الزرع على المدى القصير ، و 2-3 أسابيع لمنتصف المدة وشهر >1 للتحليل على المدى الطويل). إذا تم تسمية الخلايا المزروعة مع GFP ، يمكن تقييم الحرمان في العضلات المعزولة حديثا عن طريق الفلورسينس المباشر تحت منظار مجسم مجهز بالأشعة فوق البنفسجية.
- وضع وتوجيه على طول المحور العمودي العضلات المعزولة حديثا في العلكة tragachanth (6٪ ث / الخامس)
- يجفف العينات في ايتفتحان prechilled لمدة دقيقة واحدة، وتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل ووضعها على الفور في -80 درجة مئوية للتخزين.
- معالجة العينات مع cryostat للحصول على أقسام سميكة 7 ميكرومتر على الشرائح المستقطبة. عينة غالبية العضلات على الشرائح، وجمع ما يقرب من 8-10 الشرائح مع 30-40 أقسام / الشريحة. من المستحسن جمع سلسلة من المقاطع في أنبوب 1.5 مل لإجراء عمليات الفحص الجزيئي للبيولوجيا /الكيمياء الحيوية.
- تقييم رعي الخلايا مع تلطيخ immunofluorescent مختلفة، اعتمادا على الإعداد التجريبي. على سبيل المثال، في حالة زرع HIDEM في فئران Sgca-null/scid/bg، فإن أقسام البقع مع: أ) الأجسام المضادة ضد Lamin A/C للكشف عن نواة الخلايا البشرية المطعمة؛ (ب) الأجسام المضادة ضد Lamin A/C للكشف عن نواة الخلايا البشرية المطعمة؛ (ب) الأجسام المضادة ضد الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية ب) الأجسام المضادة ضد لامينين لتصور الهيكل العام للعضلات؛ و ج) الأجسام المضادة ضد Sgca للكشف عن استعادة المستمدة من المانحين من البروتين غائبة في الحيوان العسر.
- قياس كميا، وذلك باستخدام المجهر الفلوري، وعدد من نواة المانحة لكل قسم العضلات داخل وخارج ألياف العضلات وعدد من الألياف العضلية الهيكلية المشتقة من المانحة لكل قسم.
5. العضلات الأنسجة
تسمح التحليلات النسيجية بتقييم البنية المورفولوجية للعضلات المزروعة. ومن المتوقع تحسن معماري في هيكل الأنسجة نتيجة لنهج العلاج بالخلايا.
- إصلاح العضلات المعزولة حديثا مع 4٪ بارافورمالديهايد لمدة ساعة واحدة في 4 درجة مئوية.
- تجفيف العينات مع تدرج السكروز الصاعد(على سبيل المثال 7.5-15-30٪ ث / v).
- اترك العضلات بين عشية وضحاها في محلول السكروز الأعلى.
- تضمين العينات في الأنسجة تيك أكتوبر، ووضعها في isopentane prechilled حتى يصبح OCT الصلبة (تجنب الغمر الكامل للعينات)، وتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل ووضعها على الفور في -80 درجة مئوية للتخزين.
- معالجة العينات مع cryostat للحصول على أقسام سميكة 7 ميكرومتر كما هو موضح أعلاه.
- وصمة عار المقاطع مع الهيماتوكسيلين واليوسين أو ثلاثي الألوان ماسون وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة القياسية.
Hematoxylin و تلطيخ اليوزين تمكن حساب السمات المميزة لتجديد العضلات، مثل: أ) عدد من الألياف العضلية. ب) منطقة مقطعية؛ ج) عدد الألياف العضلية التي تحتوي على نواة مركزية. يستخدم ثلاثي الألوان في Masson لحساب المؤشر الليفي ، ويتم ذلك عن طريق طرح المساحة الإجمالية التي تشغلها ألياف الميوبر الهيكلية من المساحة الإجمالية للصورة: تعكس المنطقة الناتجة بشكل رئيسي تسلل الضام والدهون في العضلات. يمكن إجراء جميع التحليلات على الصور باستخدام برنامج ImageJ (NIH) مع أداة القياس والمكون الإضافي لمكونات الخلايا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تتبع النتائج التمثيلية المبلغ عنها المقايسات الرئيسية في المختبر/في الجسم الحي الموضحة في سير العمل في الشكل 1. 48 ساعة بعد 4OH-tamoxifen إدارة النوى ميود إيجابية يمكن التعرف عليها داخل IDEMs IDEMs ميود-ER المنقولة في الثقافة (الشكل 2A). ثم تندمج الخلايا وتفرق إلى ميوتوبات متعددة النوى(الشكل 2B). عندما زرع عضليا في نموذج مورين من إصابة العضلات الحادة, IDEMs تسهم في تجديد الأنسجة (الشكل 3). تم تقييم فعالية IDEMs في إعداد العلاج الجيني والخلايا لن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن توسيع iPSCs إلى أجل غير مسمى مع الحفاظ على إمكانات التجديد الذاتي وبالتالي يتم توجيهها للتمييز إلى مجموعة واسعة من أنساب الخلايا12. لهذا السبب وغيره من الأسباب التي تعتبر الخلايا الجذعية / السلف المشتقة من iPSC مصدرا واعدا للجينات الذاتية والعلاج بالخلايا النهج13. وقد أبلغ عمل نشر سابقا من المؤلفين عن جيل من السلف الموجينية الماوس والبشرية من iPSCs مع النمط الظاهري مماثلة لتلك التي من MABs المشتقة من بيريسيت (IDEMs) ومساهمتها الفعالة لتجديد العضلات في نموذج الماوس من ضمور العضلات7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
قدمت شركة F.S.T. طلب براءة اختراع دولي (رقم PCT/GB2013/050112) بما في ذلك جزء من الاستراتيجية الموضحة في هذه المقالة. حصل على تمويل من بروميتيك وDWC المحدودة لأبحاثه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جوليو كوسو ومارتينا راغازي والمختبر بأكمله على المناقشة والدعم المفيدين، وجيف تشامبرلين على تقديم ناقل ميو دي-إي. وقد أنجزت جميع التجارب التي شملت حية وفقا لجميع الوكالات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة واللوائح والمبادئ التوجيهية، والامتثال لها. ويدعم العمل في مختبر المؤلفين من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة، والجماعة الأوروبية 7 مشاريع الإطار Optistem وBiodesign ومشروع الأم دوشين الإيطالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
- MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) < / li>
- 5٪ مصل بقري الجنين (FBS) < / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li>
- 0.1 ملي مولار & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول < / li>
- 1٪ أحماض أمينية غير أساسية< / li>
- 5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية (bFGF) < / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / li> < / ul> بدلا من ذلك ، إذا لم تكن بعض الكواشف المذكورة أعلاه متوفرة ، فيمكن زراعة HIDEMs في:
- Iscove's Dulbecco المتوسط المعدل (IMDM) < / li>
- 10٪ FBS< / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li>
- 0.1 ملي مولار & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول < / li>
- 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) < / li>
- 1٪ ITS (الأنسولين / الترانسفيرين / السيلينيوم) < / li>
- 5 نانوغرام / مل إنساني bFGF< / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / ليث> <ليش>0.5 مو ؛ M أحماض الأوليك واللينوليك < / li>
- 1.5 & mu ؛ M Fe2+ (Fer-In-Sol)
- 0.12 & mu; M Fe3 + < / sup> (Ferlixit) < / li> < / ul> متوسط النمو:
- DMEM< / li>
- 20٪ FBS< / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / ليز> <ل>5 نانوغرام / مل bFGF< / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / ul> وسط التمايز:
- DMEM< / li>
- 2٪ مصل الحصان (HS) < / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li> < / ul>
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| REAGENTS < / strong> | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | ؛ |
| DMEM | سيجما | D5671 | |
| IMDM | سيجما | I3390 | ؛ |
| مصل الحصان | Euroclone | ECS0090L | |
| مصل الأبقار الجنيني | Lonza | DE14801F | |
| PBS خالي من الكالسيوم / المغنيسيوم | Lonza | BE17-516F | |
| L-الجلوتامين | سيجما | G7513 | ؛ |
| البنسيلين / الستربتوميسين | سيجما | P0781 | ؛ |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم) | جيبكو | 51500-056 | ؛ |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية | Sigma | M7145 | ؛ |
| Fer-In-Sol | ميد جونسون | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| حمض الأوليك | سيجما | 01257-10 ملغ | |
| حمض اللينوليك | سيجما | L5900-10 ملغ | ; |
| الإنسان bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| النمو - مخفضة Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | ؛ |
| التربسين | سيجما | T3924 | |
| هيبارين الصوديوم | ماين فارما | ||
| تريبان الأزرق | Sigma | T8154 | صبغة |
| زرقاء ضارة براءات الاختراع | Sigma | 19 ، 821-8 | ؛ |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| بارافورمالدهايد | TAAB | P001 | |
| تاموكسيفين | سيجما | T5648 | ؛ |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | ; |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | ضارة |
| بوفيدون اليود | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| إيزوبنثان | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| السكروز | VWR | 27,480,294 | |
| شرائح زجاجية مستقطبة | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| هيماتوكسيلين | سيجما | HHS32 | |
| ماسون ثلاثي الألوان | Bio-Optica | 04-010802 | |
| الفأر المضاد للميوسين السلسلة الثقيلة الأجسام المضادة | DSHB | MF20 | ؛ |
| الفأر المضاد للجسم المضاد لامين A / C | Novocastra | NLC-LAM-A / C | & NBSP ؛ |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| الأرانب المضادة للأجسام المضادة Laminin | Sigma | L9393 | ؛ |
| < قوي > مواد ومعدات < / قوي > | |||
| قابل للامتصاص خياطة مضادة للبكتيريا 4-0 | Ethicon | vcp310h | & nbsp ؛ |
| 30 جرام حقنة إبرة | BD | 324826 | |
| المشي | كولومبوس الآلة | ||
| مجهر | العقدي نيكون | SMZ800 | |
| المجهر المقلوب | Leica | DMIL LED | |
| وحدة Isoflurane | Harvad Apparatus | ||
| الألياف البصرية | Euromecs (هولندا) | EK1 | |
| وسادة التدفئة | Vet Tech | C17A1 | ؛ |
| مشارط | سوان مورتون | 11REF050 | |
| ملقط جراحي | علمية دقيقة | 5/45 | |
| درجة حرارة عالية | Bovie Medical | AA01 | ؛ |
| <قوي>تكوين الوسائط< / قوي> | |||
الجدول 1. قائمة الكواشف والمواد والمعدات والوسائط.< / strong>< / p> |
المراجع
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
