الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من السلف العضلية واعدة المرشحين لاستراتيجيات العلاج بالخلايا لعلاج خلل العضلات. يصف هذا البروتوكول الزرع والقياسات الوظيفية المطلوبة لتقييم النغر والتمايز بين الخلايا الميوانجيوائية المشتقة من iPSC (نوع من السلف العضلي) في نماذج الماوس لتجديد العضلات الحاد والمزمن.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تكون iPSCs المشتقة من المريض مصدرا لا يقدر بثمن للخلايا لبروتوكولات العلاج الذاتي في المستقبل. يمكن إنشاء الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC والمشبهة بالخلايا المتوسطة المشتقة من البيريسيت (الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC) من iPSC المستمدة من الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC من الخلايا الجذعية/السلفية: IDEMs) من iPSCs الناتجة عن المرضى المتضررين من أشكال مختلفة من ضمور العضلات. يمكن تصحيح IDEMs الخاصة بالمرضى وراثيا باستراتيجيات مختلفة(مثل ناقلات العدسية ، الكروموسومات الاصطناعية البشرية) وتعزيزها في إمكانات التمايز الميوجينية عند الإفراط في التعبير عن منظم تكوين الميو دي. ثم يتم تقييم هذه الإمكانية الميوجينية في المختبر مع مقايسات تمايز محددة وتحليلها عن طريق الفلورة المناعية. يتم تقييم الإمكانات التجديدية ل IDEMs بشكل أكبر في الجسم الحي، عند زرع العضل وداخل الشرايين في نموذجين تمثيليين للفأرة يعرضان تجديد العضلات الحاد والمزمن. ثم يتم تأكيد مساهمة IDEMs في العضلات الهيكلية المضيفة من خلال اختبارات وظيفية مختلفة في الفئران المزروعة. على وجه الخصوص ، تتم دراسة تحسين القدرة الحركية للحيوانات مع اختبارات جهاز المشي. ثم يتم تقييم زراعة الخلايا والتمايز من خلال عدد من التقييمات النسيجية والمناعة على العضلات المزروعة. وعموما، تصف هذه الورقة المقايسات والأدوات المستخدمة حاليا لتقييم قدرة التمايز ل IDEMs، مع التركيز على أساليب الزرع ومقاييس النتائج اللاحقة لتحليل فعالية زرع الخلايا.
المقدمة
Mesoangioblasts (MABs) هي سلف العضلات المرتبطة بالسفينة المستمدة من مجموعة فرعية من pericytes1-3. الميزة الرئيسية للMABs على السلف العضلات الكنسي مثل خلايا الأقمار الصناعية4 يكمن في قدرتها على عبور جدار السفينة عند تسليمها داخل الشرايين، وبالتالي المساهمة في تجديد العضلات الهيكل العظمي في بروتوكولات العلاج الخلوي. وقد تم تقييم هذه الميزة وأكد في كل من نماذج مورين والأنياب من ضمور العضلات1,5,6. وقد بنت هذه الدراسات قبل السريرية الأسس لأول مرة في الرجل المرحلة الأولى / الثانية التجارب السريرية على أساس زرع داخل الشرايين من MABs المانحة HLA متطابقة في الأطفال الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين (EudraCT رقم 2011-000176-33; يجري حاليا في مس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تقييم إمكانات الميوجينيك والتطوير
-
في المختبر: التمايز الناجم عن الميود
- توليد خط خلايا مستقر من IDEMs التي يتم نقلها مع ناقل الميو دي-ER العدسي القابل للانستقراء، مما يبطل تعدد العدوى (وزارة الداخلية؛ على سبيل المثال 1 و 5 و 50) باستخدام تلطيخ وصفها في 1.1.9 (MyHC) نتيجة لكفاءة الإجراء.
- معطف طبق 3.5 سم مع 1 مل من 1٪ Matrigel واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- غسل لوحة مرتين مع المتوسطة، البذور 1 ×10 5 ميو دي-ER نقل IDEMs في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم واحتضان في 37 درجة مئوية في المتوسط النمو.
- نتوقع أن الخلايا تصل إلى التقاء في يوم أو يومين ومن ثم إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين في ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تتبع النتائج التمثيلية المبلغ عنها المقايسات الرئيسية في المختبر/في الجسم الحي الموضحة في سير العمل في الشكل 1. 48 ساعة بعد 4OH-tamoxifen إدارة النوى ميود إيجابية يمكن التعرف عليها داخل IDEMs IDEMs ميود-ER المنقولة في الثقافة (الشكل 2A). ثم تندمج الخلايا وتفرق إلى ميوتوبات متعددة النوى(الشكل 2B). عندما زرع عضليا في نموذج مورين من إصابة العضلات الحادة, IDEMs تسهم في تجديد الأنسجة (الشكل 3). تم تقييم فعالية IDEMs في إعداد العلاج الجيني والخلايا لن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن توسيع iPSCs إلى أجل غير مسمى مع الحفاظ على إمكانات التجديد الذاتي وبالتالي يتم توجيهها للتمييز إلى مجموعة واسعة من أنساب الخلايا12. لهذا السبب وغيره من الأسباب التي تعتبر الخلايا الجذعية / السلف المشتقة من iPSC مصدرا واعدا للجينات الذاتية والعلاج بالخلايا النهج13. وقد أبلغ عمل نشر سابقا من المؤلفين عن جيل من السلف الموجينية الماوس والبشرية من iPSCs مع النمط الظاهري مماثلة لتلك التي من MABs المشتقة من بيريسيت (IDEMs) ومساهمتها الفعالة لتجديد العضلات في نموذج الماوس من ضمور العضلات7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
قدمت شركة F.S.T. طلب براءة اختراع دولي (رقم PCT/GB2013/050112) بما في ذلك جزء من الاستراتيجية الموضحة في هذه المقالة. حصل على تمويل من بروميتيك وDWC المحدودة لأبحاثه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جوليو كوسو ومارتينا راغازي والمختبر بأكمله على المناقشة والدعم المفيدين، وجيف تشامبرلين على تقديم ناقل ميو دي-إي. وقد أنجزت جميع التجارب التي شملت حية وفقا لجميع الوكالات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة واللوائح والمبادئ التوجيهية، والامتثال لها. ويدعم العمل في مختبر المؤلفين من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة، والجماعة الأوروبية 7 مشاريع الإطار Optistem وBiodesign ومشروع الأم دوشين الإيطالية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
- MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) < / li>
- 5٪ مصل بقري الجنين (FBS) < / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li>
- 0.1 ملي مولار & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول < / li>
- 1٪ أحماض أمينية غير أساسية< / li>
- 5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية (bFGF) < / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / li> < / ul> بدلا من ذلك ، إذا لم تكن بعض الكواشف المذكورة أعلاه متوفرة ، فيمكن زراعة HIDEMs في:
- Iscove's Dulbecco المتوسط المعدل (IMDM) < / li>
- 10٪ FBS< / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li>
- 0.1 ملي مولار & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول < / li>
- 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) < / li>
- 1٪ ITS (الأنسولين / الترانسفيرين / السيلينيوم) < / li>
- 5 نانوغرام / مل إنساني bFGF< / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / ليث> <ليش>0.5 مو ؛ M أحماض الأوليك واللينوليك < / li>
- 1.5 & mu ؛ M Fe2+ (Fer-In-Sol)
- 0.12 & mu; M Fe3 + < / sup> (Ferlixit) < / li> < / ul> متوسط النمو:
- DMEM< / li>
- 20٪ FBS< / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / ليز> <ل>5 نانوغرام / مل bFGF< / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / ul> وسط التمايز:
- DMEM< / li>
- 2٪ مصل الحصان (HS) < / li>
- 100 وحدة دولية مل البنسلين < / li>
- 100 مجم / مل ستربتومايسين < / li>
- 2 ملي مولار الجلوتامين < / li> < / ul>
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| REAGENTS < / strong> | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | ؛ |
| DMEM | سيجما | D5671 | |
| IMDM | سيجما | I3390 | ؛ |
| مصل الحصان | Euroclone | ECS0090L | |
| مصل الأبقار الجنيني | Lonza | DE14801F | |
| PBS خالي من الكالسيوم / المغنيسيوم | Lonza | BE17-516F | |
| L-الجلوتامين | سيجما | G7513 | ؛ |
| البنسيلين / الستربتوميسين | سيجما | P0781 | ؛ |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم) | جيبكو | 51500-056 | ؛ |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية | Sigma | M7145 | ؛ |
| Fer-In-Sol | ميد جونسون | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| حمض الأوليك | سيجما | 01257-10 ملغ | |
| حمض اللينوليك | سيجما | L5900-10 ملغ | ; |
| الإنسان bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| النمو - مخفضة Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | ؛ |
| التربسين | سيجما | T3924 | |
| هيبارين الصوديوم | ماين فارما | ||
| تريبان الأزرق | Sigma | T8154 | صبغة |
| زرقاء ضارة براءات الاختراع | Sigma | 19 ، 821-8 | ؛ |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| بارافورمالدهايد | TAAB | P001 | |
| تاموكسيفين | سيجما | T5648 | ؛ |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | ; |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | ضارة |
| بوفيدون اليود | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| إيزوبنثان | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| السكروز | VWR | 27,480,294 | |
| شرائح زجاجية مستقطبة | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| هيماتوكسيلين | سيجما | HHS32 | |
| ماسون ثلاثي الألوان | Bio-Optica | 04-010802 | |
| الفأر المضاد للميوسين السلسلة الثقيلة الأجسام المضادة | DSHB | MF20 | ؛ |
| الفأر المضاد للجسم المضاد لامين A / C | Novocastra | NLC-LAM-A / C | & NBSP ؛ |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| الأرانب المضادة للأجسام المضادة Laminin | Sigma | L9393 | ؛ |
| < قوي > مواد ومعدات < / قوي > | |||
| قابل للامتصاص خياطة مضادة للبكتيريا 4-0 | Ethicon | vcp310h | & nbsp ؛ |
| 30 جرام حقنة إبرة | BD | 324826 | |
| المشي | كولومبوس الآلة | ||
| مجهر | العقدي نيكون | SMZ800 | |
| المجهر المقلوب | Leica | DMIL LED | |
| وحدة Isoflurane | Harvad Apparatus | ||
| الألياف البصرية | Euromecs (هولندا) | EK1 | |
| وسادة التدفئة | Vet Tech | C17A1 | ؛ |
| مشارط | سوان مورتون | 11REF050 | |
| ملقط جراحي | علمية دقيقة | 5/45 | |
| درجة حرارة عالية | Bovie Medical | AA01 | ؛ |
| <قوي>تكوين الوسائط< / قوي> | |||
الجدول 1. قائمة الكواشف والمواد والمعدات والوسائط.< / strong>< / p> |
المراجع
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
