وضعنا nanovesicles متعددة الوظائف الجوهرية رواية تسمى porphysomes، والتي تعتمد على بنية مضان التبريد الذاتي وخصائص فريدة من نوعها حراري ضوئي؛، وبالتالي تعمل كعوامل قوية العلاج حراري ضوئي؛. صغنا porphysomes باستخدام الضغط العالي وقذف بهم التحقيق فعالية العلاج حراري ضوئي؛ في نموذج الورم طعم أجنبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دقيقة واحدة، ورم تذرية ضوحراري واحد وات الفرعية عن طريق Porphysomes، متعدد الوظائف الجوهرية Nanovesicles
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وضعنا مؤخرا porphysomes كما nanovesicles متعددة الوظائف في جوهرها. A الضيائي، pyropheophorbide α، تم مترافق إلى فوسفورية ومن ثم تجميعها الذاتي لمثل الحويصلية حويصلات كروية. ويرجع ذلك إلى كثافة عالية للغاية من البورفيرين في طبقة ثنائية-البورفيرين الدهون، ولدت porphysomes معاملات كبيرة الانقراض، التي تعتمد على بنية مضان التبريد الذاتي، وحراري ضوئي؛ فعالية ممتازة. في صياغة لدينا، وتوليفها porphysomes باستخدام البثق الضغط العالي، وعرض متوسط حجم الجسيمات نحو 120 نانومتر. حقن أربع وعشرين ساعة بعد الوريد من porphysomes، ودرجة الحرارة المحلية الورم ارتفعت من 30 درجة مئوية إلى 62 درجة مئوية بسرعة عند التعرض دقيقة واحدة من 750 ميغاواط (1.18 واط / سم 2)، 671 نانومتر أشعة الليزر. بعد التذرية الحرارية كاملة من الورم، وشكلت eschars تلتئم في غضون 2 أسابيع، في حين واصلت الأورام في مجموعات المراقبة للنمو وصلت إلى تعريف كل حمامالنقطة د في غضون 3 أسابيع. هذه البيانات تظهر كيف يمكن استخدامها كعلاج porphysomes حراري ضوئي؛ قوية (PTT) وكلاء.
المقدمة
Porphysomes هي nanovesicles متعددة الوظائف الرواية التي قمنا بتطويرها مؤخرا والتي هي قادرة على التصوير المتعدد الوسائط والعلاج 1. تتشكل من طبقات ثنائية أنها البورفيرين الذاتي تجميعها وتحتوي على كثافة عالية للغاية من البورفيرين (أكثر من 83، 000/porphysome الجسيمات)، والتي تولد معامل الانقراض كبيرة وفريدة من نوعها في النتائج التي تعتمد على بنية مضان التبريد الذاتي. Porphysomes دينا جيدة في الجسم الحي الدوائية وخصائص biodistribution: يعرضون دم نصف عمر 12 ساعة التالية إدارة منهجية، وسلبية تتراكم في الأورام طعم أجنبي مع 7.5٪ ID / ز في 24 ساعة بعد الحقن 2.
بنية فريدة من نوعها، والخصائص الفيزيائية جعل porphysome مرشح جيد للتصوير المتعدد الوسائط والعلاج الموجهة الصورة. في المقام الأول، التي تحتوي على البورفيرين، porphysomes هي مناسبة لجوهرها التصوير مضان من الأورام السرطانية على تراكم 1.بالإضافة إلى ذلك، كل البورفيرين لها موقع ثابت لمدة النظائر المشعة خالب، وبالتالي، porphysomes يمكن وصفها بسهولة مع النظائر المشعة مثل 64Cu للتصوير PET 3. علاوة على ذلك، وتبدد الطاقة الضوئية الممتصة حراريا تحت أشعة الليزر التعرض عندما porphysome بنية غير سليمة، لذلك porphysomes أيضا يحمل التصوير الضوئي فريدة وقدرات PTT. وقد تبين أن 24 ساعة بعد الحقن في الوريد من porphysomes، أشعة الليزر من ورم المتراكمة porphysome يسببها زيادة درجة الحرارة السريع والقوي حراري ضوئي؛ الورم الاجتثاث. أظهرت هذه القدرة هي التي porphysomes حراري ضوئي؛ كفاءة مع انقراض معامل عالية مثل جزيئات الذهب (AuNPs) 1. من ناحية أخرى، بالمقارنة مع غيرها من العوامل حراري ضوئي؛ غير العضوية، بما في ذلك AuNPs، تظهر porphysomes ميزة المعلقة في مجال السلامة الأحيائية نظرا لطبيعتها العضوية. Porphysomes هي قابلة للتحلل إنزيمي وحمل الحد الأدنى من السميه. nerves الحادذ في الفئران عن طريق الحقن بجرعات عالية مثل 1،000 ملغ / كغ 1. وعلاوة على ذلك، على غرار الجسيمات الشحمية، جوهر مائي كبير من porphysomes يمكن أن يكون سلبيا أو تحميلها بنشاط مع العوامل العلاجية أو التصوير. الخصائص البصرية وتوافق مع الحياة من porphysomes إثبات القدرة المتعدد الوسائط النانوية العضوية للتصوير biophotonic والعلاج.
في هذه الورقة، ونحن نقدم طريقة تركيب تقارن-pyropheophorbide الدهون، والتصنيع وطريقة توصيف porphysomes باستخدام البثق الضغط العالي. تتم في الجسم الحي PTT على الفئران وكذلك للتدليل على كفاءة تمكين porphysome PTT في الورم العلاج باستخدام طعم أجنبي تحت الجلد نموذج الورم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليف Pyropheophorbide الدهنية
- الجمع بين 200 ملمول pyropheophorbide (سبيرولينا باسيفيكا أعدت من الطحالب كما هو موضح سابقا؛. تشنغ وآخرون، Bioconj كيم، عام 2002، 13 -392) 4، 98.7 ملغ 16:00 lysophophatidylcholine (1-بالميتويل-2-هيدروكسي SN-glycero -3-phosphocholine، أفانتي القطبية الدهون # 855675)، 76.3 ملغ من EDC، 48.7 ملغ DMAP (4 - (dimethylamino) البيريدين) في 5 مل أميلين استقرت الكلوروفورم لنسبة 1:1:2:2 بايرو: الدهون: EDC : البرنامجي الخاص بإدارة البيانات.
- يحرك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 تحت الأرجون ساعة. تتبخر الكلوروفورم تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار مع التدفئة إلى 40 درجة مئوية. يتم إنتاج خليط من ايزومرات-بايرو الدهون (مرفق بايرو في المركز SN-1 أو SN-2).
- في resuspend-بايرو الدهون خليط ايزومير في 1 مم CaCl 2، 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8)، و 0.5٪ تريتون X-100 و 10٪ الميثانول في تركيز 5 ملغ / مل. إضافة A2 فسفوليباز (PLA2) من العسل سم النحل في0.1 ملغ / مل تركيز واحتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لهضم SN-1-بايرو الدهون، وإنتاج نقي SN-2-بايرو الدهون ايزومير.
- إضافة 2 وحدات تخزين إضافية من الكلوروفورم والميثانول 1.25 حجم، واستخراج، ومن ثم إزالة المذيب باستخدام التبخر الدوارة في خفض الضغط عند 40 درجة مئوية. resuspend والمنتج الانقسام في 1٪ MeOH في DCM وتنقية أكثر ديول صغيرة عمود السيليكا النقية لisomerically بايرو الدهنية.
2. إعداد Porphysomes
- حل pyropheophorbide الدهنية، distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-ميثوكسي (البولي ايثيلين جلايكول) (PEG-2000-PE) والكوليسترول في الكلوروفورم على حدة، وتسجيل تركيزات التوالي.
- إعداد porphysome فيلم الدهون في 12x75 ملم البورسليكات أنبوب اختبار مع وزن الدهون الكلي من 5 ملغ / أنبوب عن طريق الجمع بين 65٪ المولي البورفيرين الدهنية، فإن 5٪ المولي PEG-2000-PE و 30٪ المولي الكولسترول.
- تجفيف الدهون الأفلام تحت تيار من نيتروجنرال الغاز والسماح لهم المجففة مزيد تحت فراغ لمدة 1 ساعة. تخزين الأفلام الدهون في -20 درجة مئوية تحت الأرجون حتى الماء وقذف في المستقبل.
- إضافة 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) إلى كل الدهون أنبوب الفيلم. تجميد أنبوب الاختبار في النيتروجين السائل حتى تجمد تماما، ثم ذوبان الجليد أنبوب في 65 ° C حمام الماء حتى ذاب كل عينة. دوامة أنبوب ليصبح المجموع 30 ثانية (3X في 10 ثانية لكل منهما، مع 5 ثوانى إعادة التسخين في 65 ° C حمام الماء بين كل vortexing ل).
- تكرار تجميد ذوبان الجليد لمدة 5 دورات أو أكثر عند الحاجة إليها حتى يمكن ملاحظة أي مجاميع كبيرة في حل رطب. ترك تعليق porphysome على الجليد عند الانتهاء.
- تجميع الطارد الضغط العالي (10 مل) مع اثنين من المرشحات مكدسة 100 نانومتر البولي تثبيت فيها اتصال الطارد thermobarrel إلى شكل دائري thermostatted ل65 ° C تعميم حمام الماء، وربط النظام الطارد إلى خزان النيتروجين لبريه عاليةتأكد التوريد.
- نقل تعليق porphysome إلى غرفة الطارد باستخدام 9 بوصة نقل الزجاج ماصة. ضبط الضغط عن طريق تحويل الطلب على منظم خزان النتروجين حتى لوحظ قراءة ما بين 200 و 300 رطل لكل بوصة مربعة كما ضغط البثق الأولي. فتح صمام منظم الضغط تدريجيا حتى يتم تحقيق معدل تدفق porphysome كافية أو يتم التوصل إلى الحد الأقصى من 800 رطل لكل بوصة مربعة (5،440 كيلو باسكال) من الضغط.
- بعد مرور قذف الأولى كاملة، وإغلاق صمام التحكم في ضغط والافراج عن ضغط الطارد عن طريق فتح صمام تخفيف الضغط على رأس الطارد. إعادة ملء الطارد مع الحل porphysome مقذوف طازجة، وتكرار قذف لا يقل عن 10 مرات لضمان الحل النهائي هو مقذوف متجانسة.
- تحديد تركيز الحل النهائي porphysome من خلال قياس امتصاص عينة مخففة في الميثانول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية فيس مطياف. حساب تركيز باستخدام الطرافة المعادلة التاليةح معامل الانقراض من 97،000 M -1 سم -1 في 410 نانومتر لpyropheophorbide الدهنية.
- قياس حجم التوزيع النهائي للporphysomes باستخدام مالفيرن Zetasizer ZS90 التي تشتت الضوء الحيوي. تمييع الحل porphysome في برنامج تلفزيوني وتنفيذ ثلاثة قياسات مع 15 أشواط لكل لنتائج المتوسط.
- تحديد تبريد مضان من porphysome بمقارنة الانبعاثات مضان من porphysome مروي (1 ملم في برنامج تلفزيوني) وporphysome غير مروي (1 ملم في 1٪ تريتون X-100) باستخدام الطيفي. اتخاذ الأطياف قبل وبعد المنظفات وأضاف (Tirton X-100)، وتطبيع إشارة القراءة إلى أقصى مضان. تعيين الإثارة لتكون 410 نانومتر، وانبعاث نطاق الطول الموجي لتكون 600-800 نانومتر.
- إبقاء porphysomes الحل تحت الأرجون في 4 درجات مئوية حتى استخدامها في المستقبل، وحمايته من الضوء و الألومنيومالنفط.
3. إعداد نموذج الحيوان طعم أجنبي
- ثقافة الخلايا في RPMI KB-1640 (مع 10٪ FBS)، والحفاظ على الخلايا في 5٪ CO 2 والجو رطب في 37 درجة مئوية.
- خلايا الحصاد KB باستخدام معيار تقنية زراعة الخلايا. الحفاظ على تعليق خلية (20،000 خلية / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الجليد لمدة التخزين على المدى القصير حتى وقت الحقن.
- إعداد KB xenografts على الفئران عارية. يتم شراؤها الفئران عارية من مختبرات نهر تشارلز عندما يكونون 20 ز (الفئة # CRL: NU (NCR) Foxn1 نو، 6-7 أسابيع من العمر)، نظرا نظاما غذائيا عاديا والفراش (مختبرات هارلان؛ الحميه: المشع LM-485، # 7912؛ الفراش: الفراش كوز الذرة، ¼ "، # 7097). تعقيم جميع الأدوات التعامل مع الحيوانات (حقنة، ملقط، وسادة الحيوانات) قبل التجارب. تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane وت / ت في 100٪ الناقل للغاز الأوكسجين. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل المؤسسة (جامعة الصحة نيtwork شمال في هذه الحالة) رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
- حقن الخلايا السرطانية علقت في برنامج تلفزيوني تحت الجلد إلى الجهة اليمنى من الفئران. الفئران جاهزة للاستخدام بعد 10 يوما عندما يصل الورم قطرها 4-5 مم وسماكة 2-3 ملم.
4. في الجسم الحي العلاج ضوحراري
- حقن porphysomes (التي تحتوي على 750 نانومول بايرو في حجم 200 ميكرولتر) عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل. إجراء أشعة ليزر 24 ساعة بعد الحقن من porphysomes.
- في هذا القسم، وإجراء جميع الإجراءات في غرفة سلامة الليزر المغلقة. ارتداء نظارات السلامة الليزر خلال أشعة الليزر.
- إعداد أجهزة أشعة الليزر. عقد ألياف الليزر والناشر من قبل المشبك على الوقوف. تعيين قوة الليزر على مستوى منخفض وبدوره على الليزر. ضبط ارتفاع الألياف الليزر لتحقيق مساحة تشعيع 9 ملم في القطر (DPSS ليزر، LaserGlow تكنولوجيز، تورنتو، كندا)، معايرة قوة الليزر إلى 750 ميغاواط (1.18 واط / سم 2) باستخدام ا ف بOWER متر ثم إيقاف تشغيل الليزر لتحضير الحيوانات.
- تخدير الحيوانات مع 2٪ isoflurane وت / ت في 100٪ الناقل للغاز الأكسجين من خلال مخروط الأنف لا الكسح واضحا من isoflurane ويشكل خطرا على صحة الإنسان للخطر). تأكد من أن الحيوان هو تخدير عميقة بما فيه الكفاية عن طريق إجراء قرصة أخمص القدمين أو الأصابع مع ملقط لالكفوف الخلفيتين الحيوان. الحيوانات مستعدون لأشعة الليزر عندما تكون غير قادر على الاستجابة لهذا الإجراء.
- مراقبة درجة حرارة الورم عن طريق كاميرا الأشعة تحت الحمراء الحرارية (Mikroshot، LUMASENSE تكنولوجيز). تضع الكاميرا على مقربة من الورم، والتركيز جيدا وتأخذ صورة PTT قبل وكذلك صورة بيضاء الضوء العادي قبل بدء تشعيع PTT.
- بدوره على الليزر مرة أخرى، وزيادة الطاقة إلى 750 ميغاواط ضوء. وضع الورم في وسط شعاع الليزر للحصول على الورم تغطيتها بالكامل، وبدء توقيت التشعيع. تأخذ صورة الورم درجة الحرارة كل 5 ثوانى لالعلاج بالليزر دقيقة واحدة. إيقاف تشغيل الليزر في 1 دقيقة. الحادي والمرجع إمدادات الغاز من 2٪ isoflurane و، والانتظار حتى يتعافى الحيوان من تخدير وضعه مرة أخرى إلى القفص.
- الحفاظ على الفئران في غرفة الحيوان سوائية الحرارة تحت 0:12 ساعة دورة الظلام والضوء وفقا لبروتوكولات الحيوان التي وافقت عليها شبكة الصحة جامعة. حقن البوبرينورفين (0.05 ملغم / كغم، تحت الجلد مرتين يوميا لمدة أسبوع بعد أشعة الليزر للحد من الألم الناجم عن ندبة. كل يومين، وقياس قطر الورم باستخدام الفرجار والتقاط صورة. حساب حجم الورم باستخدام المعادلة التالية: V = π / 6 · · لب 2، حيث هو قطر طويل، وب هو واحد قصير.
- تضحية الحيوانات من خلال وضعها في غرفة CO 2 عند القطر طويلة من الورم تصل إلى 10 ملم، كما هو نقطة النهاية المحددة في المختبر لدينا. أداء خلع عنق الرحم بعد العلاج CO2. رسم منحنى البقاء على قيد الحياة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ومترافق Pyropheophorbide إلى فوسفورية كما مونومر الدهون مستقرة (الشكل 1A) وتجميع الذاتي تقارن لتشكيل porphysomes بواسطة الغشاء طريقة البثق باستخدام الطارد الضغط العالي. فإنه عادة ما يكون من الصعب بثق تعليق porphysome الدهنية خلال 3 دورات الأولى من قذف مع معدل تدفق بطيء نسبيا. كما تتكرر أكثر للسحب، ومعدل تدفق الحل مقذوف يزيد تدريجيا، ويمكن الضغط انخفض قليلا إذا لزم الأمر. حجم Porphysome، والتركيز، وكفاءة التبريد ثلاثة الخصائص الهامة لتوصيف جزيئات الحق بعد قذف. Porp...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في تطوير التكنولوجيات تسليم المخدرات، النانوية متعددة الوظائف ويجري حاليا تحقيقات واسعة لتتبع دقيق لسيارة تسليم المخدرات مع الحفاظ على حمولة المخدرات عالية. وقد وضعت الليبوزومات محملة البورفيرين لخصائص الدوائية أفضل وتسليم أكثر كفاءة من الإدارة المباشرة للالبورفيرين، ولكن العقبات موجودة، بما في ذلك مبلغ محدود التحميل من البورفيرين وإعادة توزيع السريع للالبورفيرين من الجسيمات الشحمية لبروتينات البلازما 5،6. وعلى النقيض من نظم تسليم الليبوسومال التقليدية، حيث يتم إدراج ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الأميرة مارغريت مستشفى، والوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث كندا، والمعهد الكندي للبحوث الصحية، والمؤسسة الكندية للابتكار، وجوي وتوبي تانينباوم / البرازيلي الكرة الرئيس في البروستاتا أبحاث السرطان، و منح من مؤسسة أبحاث جامعة ولاية نيويورك والدعم بدء التشغيل من جامعة بافالو.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المبخر الدوار | Thermo-Savant | SPD131DDA | |
| Votex | Scientific Industries | SI-0236 | رقم الموديل: G560 |
| الطارد عالي الضغط | LIPEX، Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 مل الطارد الحراري |
| دوامات الحمام الساخن (جهاز دوران بالحرارة) | البولي | العلمية SC100-S5P | |
| Avanti Polar Lipids | 610005 | حجم المسام 100 نانومتر ، وقطر الغشاء 19 مم | |
| Zetasizer | Malvern Instruments | ZS90 | |
| UV / مقياس الطيف | المرئي Varian Australia | كاري 50 Bio UV / مقياس | |
| الطيف الفلوري | HORIBA Scientific | FluoroMax-4 | |
| الفحص المجهري الإلكتروني (TEM) | هيتاشي | H-7000 | |
| حاضنة ثقافة الخلية | SANYO | MCO-18AIC | |
| مقياس الطاقة | Thorlabs | PM100D | مع جهاز استشعار S142C |
| 671nm تقنيات الليزر | LaserGlow | LRS-0671_PFN-02000-05 | S / N: 10097270 |
| ميزان حرارة بالأشعة تحت الحمراء | Mikroshot ، LUMASENSE Technologies | 9102409 نظارات | |
| واقية من الليزر نظارات العين | الواقية بالليزر تقنيات LaserGlow | AGF6602XX | الكثافة البصرية: 1.5+ عند 630-700 نانومتر |
المراجع
- Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).
- Lovell, J. F., et al. Enzymatic regioselection for the synthesis and biodegradation of porphysome nanovesicles. Angew Chem Int Ed Engl. 51, 2429-2433 (2012).
- Liu, T. W., MacDonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically Copper-64-Labeled Organic Nanoparticles as Radiotracers. Angewandte Chemie. , (2012).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2, 477-487 (2005).
- Jin, C. S., Zheng, G. Liposomal nanostructures for photosensitizer delivery. Lasers Surg Med. 43, 734-748 (2011).
- Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochim Biophys Acta. 557, 9-23 (1979).
- Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., Brandl, M. Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics. Int J Pharm. 223, 55-68 (2001).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: technologies and analytical applications. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 1, 801-832 (2008).
- Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., Blanchard, G. J. Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore. Langmuir. 23, 11677-11683 (2007).
- Liu, D., Huang, L. Size Homogeneity of a Liposome Preparation is Crucial for Liposome Biodistribution In Vivo. Journal of Liposome Research. 2, 57-66 (1992).
- Zhang, Y., Lovell, J. F. Porphyrins as Theranostic Agents from Prehistoric to Modern Times. Theranostics. 2, 905-915 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
