مقالة منهجية

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

DOI:

10.3791/50548

⸱

أغسطس 31, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Douglas Instruments

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص عشوائي microseed مصفوفة (rMMS) هو أسلوب بلورة البروتين في البلورات التي تضاف إلى البذور شاشات عشوائي. عن طريق زيادة احتمال أن بلورات سوف تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من مرحلة رسم تخطيطي بروتين، وغالبا ما يتم الحصول عليها يؤدي تبلور اضافية، ويمكن زيادة جودة البلورات المنتجة، ويتم توفير امدادات جيدة من بلورات لتجارب جمع البيانات وتمرغ. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS التي يمكن تطبيقها إما الجلوس أو قطرة قطرة شنقا التجارب نشر بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 96 جيدا أو شكل علبة 24 أيضا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من التطبيق الأولي من خلال Perutz، Kendrew وزملاء العمل في تحديد هياكل الهيموجلوبين والميوجلوبين، إلى إنتاجية عالية خطوط الأنابيب الحديثة الآلي للاتحادات الجينوميات الهيكلي، والجزيئات البلورات بالأشعة السينية قد أتاحت لنا لمحة هيكلية غير مسبوقة في عالم البروتين . لا تزال هذه التقنية المنهج التجريبي الأكثر انطباقا على نطاق واسع أن يسمح للرؤية مباشرة من بنية البروتين في الذرية، أو بالقرب القرار الذري (أي في حدود 1-3). ومن الشروط الأساسية لحيود الأشعة السينية ليتم تطبيقها على البروتين هو أنه يجب أولا أن تبلور، وهذا هو مرحلة من مراحل العملية التي لا تزال أعظم خطوة الحد من معدل واحد في تحديد هيكل بالطرق الحيود 1 و 2. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا لعملية بلورة البروتين، وتحسينات كبيرة في نوعية وتوافر شاشات التبلور،الصواني، والتكنولوجيات ذات الصلة، فإنه لا يزال من المستحيل التنبؤ بشكل موثوق من احتمال نجاح تبلور 3. ويمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية لتقييم ما إذا كان البروتين من الفائدة يعرض خصائص مواتية لالتنوي الكريستال والنمو، أي هو مطوية جيدا، متجانسة، monodisperse، وما إلى ذلك، ولكن هذه الأفكار في أي وسيلة توفر مؤشرا نهائيا التبلور الميل.

منذ فترة طويلة البذر يزعم أن يكون وسيلة ناجعة لتحسين عدد وحجم ونوعية بلورات القائمة أو المواد البلورية 4-7. ويستند هذا النهج على أساس أن شرط أن يدعم الكريستال التنوي قد لا تكون الأمثل لنمو البلورات اللاحقة والعكس بالعكس. عن طريق نقل المواد الأنوية من حالة إلى أخرى، يمكن للمرء أن محاولة فصل هذه العمليات بشكل فعال، وبالتالي إعطاء الوصول إلى الجديد، كما تبلور الفضاء غير مستكشفة بعد،ونتيجة لزيادة معدل النجاح العام من تجربة الفرز. وقد تم توثيق طرق أنشئت ل(ط) macroseeding، ونقل من بلورة واحدة في مجملها من شرط واحد إلى 8 آخر، (ب) بذر متتالية، ونقل المواد الأنوية، التي تم الحصول عليها بشكل عام من تطبيق الضغط باستخدام الاتجاه على سبيل المثال الخط الطولي القط على سطح بلورة القائمة، تليها مرور لاحقة من الخط الطولي من خلال انخفاض تبلور الجديدة 9، و (ج) "الكلاسيكية" microseeding، ونقل الكريستال "بذور"، التي تم إنشاؤها بواسطة الحصاد سحق بلورات (أو البلورية المواد)، في ظروف مماثلة لتلك التي أسفرت عن بذور 10. وخاصة كل ثلاثة من هذه الأساليب هي مضيعة للوقت وسوء تحجيم، وبالتأكيد بالمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع الحديث مناولة السائل الروبوتات التبلور. وقد ساهمت هذه العوامل، على مستوى بعض على الأقل، إلى الاعتقاد بأن البذورجي هو طريقة في أن يزوره فقط عندما فشلت المقاربات الأخرى لتؤتي ثمارها.

مصفوفة عشوائية microseeding (rMMS) هو الابتكار المنهجي الأخيرة الذي يجمع بين فوائد microseeding التقليدية مع تلك الفحص إنتاجية عالية وقابلية 11-13. يعتمد هذا النهج على توليد مخزون البذور، والمنتجة من المواد البلورية الأنوية، والتي يمكن aliquoted في / على كل sub-well/coverslip ضمن معيار 96-screen حالة التبلور. هذا الأسلوب ينطبق على كل من يجلس أو شنقا التجارب نشر انخفاض بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 24 جيدا أو شكل علبة 96 جيدا. وقد ثبت بالتجربة rMMS إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح التبلور، وإنتاج بلورات من قدر أكبر من الجودة والكمية حيود 11، 13، 14، ويمثل أداة مبتكرة في ترسانة البلورات 'النهج في سngoing الجهد نحو النجاح التبلور. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS وتوفير بيانات عينة توضح فعالية هذه التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاعتبارات الاستراتيجية

  1. واختيار بلورات البذور المستخدمة في التجارب microseeding تختلف اعتمادا على الهدف من التجربة. في بداية المشروع فإنه من المفيد أن تجد العديد من الفعالية تبلور التي يمكن أن توفر نقطة انطلاق بديلة لالكريستال الأمثل. rMMS يقلل كثيرا من الحاجة إلى وضوح الشمس الأمثل لبلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من المخطط المرحلة، أي في المنطقة حيث التالية اضطراب أو التنوي يعود النظام إلى التوازن. لذا نقترح استخدام rMMS بشكل روتيني في أقرب وقت يتم الحصول على بلورات الأولى (أو، بدقة أكبر، في أقرب وقت البلورات الأولى تتوقف عن النمو).
  2. للجولة الأولي من rMMS، ينبغي بذل مخزون البذور مع قدر المواد البلورية ممكن. إذا بئر واحدة فقط هي المتاحة التي تحتوي على بلورات، أو إذا كانت بلورات صغيرة، قد يكون من المفيد لاقامة التكرار متعددة منضرب الأصلي (بدون بذر) لزيادة المعروض من بلورات. إذا، ومع ذلك، يتم الحصول على العديد من مشاهدات مختلفة، بلورات البذور يمكن أن تحصد من عدة شروط ومختلطة معا.
  3. لتجنب مرحلة الانفصال، بلورات نمت في ظروف عالية من الملح وينبغي أن تحصد بشكل منفصل من بلورات نمت في ظروف عالية PEG. إذا يتم خلط بلورات من عدة آبار، وينبغي اختيار الحل الخزان الذي هو أقل احتمالا لإعطاء بلورات الملح للتعليق البذور. على سبيل المثال، ينبغي تجنب التركيزات العالية من الفوسفات والكبريتات والكالسيوم والمغنيسيوم.
  4. في وقت لاحق في مشروع قد يكون من المهم أن نبحث عن بلورات مع الخلايا وحدة مختلفة من أجل تحسين الحيود، وتجنب بلورات توأمة، والحصول على البلورات التي هي مناسبة للبروابط ملزمة. في هذه المرحلة فقط بلورات أكثر ملائمة (مثل تلك التي حيد الضوء أفضل) ينبغي أن تستخدم لجعل مخزون البذور. ويلزم الجولات المتكررة في بعض الأحيان من microseeding، حيث لا يوجد سوى "أفضل"وتستخدم بلورات لجعل مخزون البذور لجولة لاحقة. إذا كان ذلك ممكنا، و" "مرسب محايدة مثل PEG 3000 ينبغي أن تستخدم لتعليق بلورات البذور في تشجيع الاتصالات الكريستال الرواية وبلورة المجمعات التي قد تكون غير مستقرة في ارتفاع الملح حلول 12.
  5. تجارب microseeding الكلاسيكية، حيث يتم استخدام حالة تبلور واحد، وغالبا ما تكون مفيدة عقب تحديد حالة واعدة وخلال التحسين اللاحقة. فمن الضروري في كثير من الأحيان لتخفيف مخزون البذور من أجل الحصول على العدد المطلوب من بلورات من كل قطرة ماء. A "اندماجي" التجربة microseeding (حيث يتم إضافة سلسلة من مخزونات البذور لزيادة التخفيف إلى حالة تبلور) هو وسيلة سريعة للعثور على التخفيف الأمثل للمخزون البذور. يوصف هذا النهج أدناه.

2. إعداد مخزون البذور

  1. جعل التحقيق الزجاج مقربة من ماصة باستير الزجاج باستخدام لهب بنسن.
    1. تسخين ماصة بالقرب من منتصف حتى تصبح لينة، ثم إزالته بسرعة من اللهب واستدراجه للخروج عن طريق سحب وبصرف النظر عن الغايات. تهدف إلى سحب الزجاج لتصل إلى 0.25 ملم قطر أدناه.
    2. كسر الزجاج عند نقطة حيث حوالي 0.25 ملم لفترة وجيزة يغرق نهاية اقتحام اللهب. كرر هذا حتى نصف الكرة من الزجاج يبلغ قطرها ~ 0.75 مم يتكون في النهاية. هذا التحقيق هو مفيد لسحق المواد البلورية كما هو بحجم مناسب لضرب الأجسام الصلبة على نطاق و،01-1،0 مم وأنها لا تضر سطح البلاستيك من بلورة علبة الفرعية جيدا أو ساترة. تحقيقات الأكبر (~ 1.0 ملم) قد سحق بلورات صغيرة أكثر فعالية لأن محاصرون بلورات بين الزجاج والبلاستيك.
  2. وضع 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة على الجليد.
  3. فحص علبة بلورة مقررة سلفا باستخدام مجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال وتحديد أب واحد أو أكثرتكبده الآبار من علبة من خلالها حصاد المواد البلورية لتوليد مخزون البذور. أي مواد يمكن استخدامها بما في ذلك إبر رفيعة، spherulites، microcrystals وغير النظامية، وبلورات سيئة. ينبغي بذل مخزون البذور في أقرب وقت ممكن بعد وقف البلورات المتنامية، كما من المرجح أن تكون مرتبطة جزئيا عبر المواد القديمة، وبالتالي تقليل مدى ملاءمتها للاستخدام في التجارب البذر. إذا أي شك موجود حول ما إذا كانت المواد البلورية إلى أن تحصد هو الملح أو البروتين البئر يمكن تصور باستخدام المجهر مضان الأشعة فوق البنفسجية أو نظام التصوير قبل الافتتاح، أو ما قد يتعرضون للمواد البلورية لفي الموقع تحليل حيود الأشعة السينية في الدرج. عند استخدام بلورات السابق البروتين النهج سوف يتألق تحت أشعة فوق البنفسجية، وسوف تظهر بلورات الملح عديم اللون.
  4. فتح علبة بلورة اختيارها بشكل جيد. لمدة 96 جيدا يجلس الصواني انخفاض قطع طريق ورقة ختم البلاستيك العلوي حول اختيارها بشكل جيد باليودنانوغرام شفرة المشرط. لمدة 24 جيدا صواني معلقة قطرة إزالة ساترة باستخدام زوج من ملاقط. عكس ساترة ووضعه على سطح نظيف مستقرة. إزالة 50 ميكرولتر من الحل الخزان ونقل هذا السائل إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة ضمان أن يبقى أنبوب على الجليد طوال الوقت.
  5. بدقة سحق البلورات في subwell (96 علبة جيدا) أو ساترة (24 علبة جيدا) يسقط، وذلك باستخدام مسبار الزجاج أعدت في القسم 2.1، وعرض النتائج تحت المجهر. بلورات صغيرة قد يستغرق عدة دقائق لسحق تماما. هذه الخطوة يسمح للمجرب للتأكد من أن البلورات هي سهلة لسحق وبالتالي فهي ليست مرتبطة عبر، وأيضا أنها ليست بلورات الملح. بلورات الملح إنتاج بنقرة والمميزة التي يمكن يسمع ويرى عندما يتم سحقها. إذا كانت البلورات هي صعبة وصعبة لسحق محاولة للحصول على مواد أعذب واستخدامها.
  6. إزالة 5 ميكرولتر من الحل الخزان من بذور حبة أنبوب وراملحول ليعادل البئر الفرعية (يجلس التجربة قطرة)، أو ساترة (معلقة تجربة قطرة) التي تحتوي على المواد البلورية للحصاد. ماصة هذا الأمر السائل وهبوطا 5-6 مرات ل resuspend أكبر قدر من البئر الفرعية أو ساترة محتويات ممكن. العودة للتعليق على البذور أنبوب حبة وكرر هذه الخطوة مرتين أكثر من ذلك، ضمان قدر المواد البلورية يتم حصاد وقت ممكن.
  7. دوامة حبة البذور لمدة دقيقتين، ووقف كل 30 ثانية لتبريد أنبوب على الجليد.
  8. جعل سلسلة التخفيف، وتمييع مخزون البذور في محلول الخزان من قبل عامل من 4-10 في كل مرحلة. عادة، وسيتم الحصول على عدد كبير جدا من بلورات عند استخدام مخزون البذور غير مخفف، وذلك باستخدام مخزونات البذور مخففة للسيطرة على عدد من بلورات لكل بئر. في الجولة الأولى من rMMS، فمن المهم عدم تمييع الحل مخزون البذور، لأن كلما زاد تركيز البذور سيتم الحصول على المزيد من الزيارات التبلور.
  9. إذا لم يكن ليتم استخدامها immediately، ونقل البذور التعليق الأسهم والأوراق المالية البذور المخفف إلى -20 ° C، أو الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين. لمنع تكرار تجميد أذاب دورات، والذي قد يقلل من فعالية مخزون البذور، وتخزين هذه المواد في مأخوذة الحجم الصغير، أي 10-20 ميكرولتر. مرة واحدة المجمدة، ويجوز إبقاء مخزون البذور إلى أجل غير مسمى لحين الحاجة إليها.

3. إنشاء البلورة الصواني

  1. اعتمادا على مدى توافر المرافق وتبلور أفضليات المجرب، rMMS بلورة الفرز يمكن القيام بها باستخدام إما الصواني 24 أيضا توظيف شنقا طريقة الانتشار قطرة بخار، أو الصواني 96 جيدا باستخدام طريقة الجلوس قطرة بخار نشرها. يمكن تأسيس الصواني تبلور لrMMS إما باليد، وذلك باستخدام التعامل مع موزع الروبوتية السائل، أو مزيج من الاثنين.
  2. وهناك تجربة نموذجية rMMS إعداد باليد تشمل، 1.0 ميكرولتر حل البروتين، 1.0 ميكرولتر حالة التبلور، و0.5 ميكرولتر مخزون البذور. وهناك تجربة نموذجية إعداد باستخدام الروبوت التبلور تشمل حل البروتين 0.3 ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر حالة التبلور، و 0.1 ميكرولتر مخزون البذور.
  3. لإجراء الفحص في 24 rMMS جيدا شنقا الصواني قطرة، أولا، وذلك باستخدام ماصة دليل، ونقل 300 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في 10 مل شكل أنبوب واحد في كل بئر من 4 × 24 جيدا تبلور pregreased الصواني.
    1. نقل 1 ميكرولتر من كل شرط تبلور من كل 300 ميكرولتر الخزان على سطح ساترة البلاستيك المقابلة التي تم إزالتها على حد سواء الأمامية والخلفية شرائط دعم وقائي.
    2. إلى ميكرولتر 1 من كل شرط تبلور إضافة 1 ميكرولتر من محلول البروتين تليها 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور وضوح الشمس. عكس كل ساترة بحيث قطرة من السائل لأسفل والموقف أعلاه المناسبة أيضا.
    3. الصحافة أسفل على ساترة، ضغط sealiنانوغرام الشحوم وتشكيل ختم آمنة. مرة واحدة يتم وضع كل قطرات 96، ينبغي نقل علبة الى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة، عادة في حدود 4-18 درجة مئوية لمدة التخزين.
  4. لإجراء فحص rMMS في الجلوس 96 جيدا صواني قطرة أولا نقل 20-50 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في شكل عميق كتلة جيدا في كل المقابلة بشكل جيد من الدرج التبلور. هذه الخطوة نقل يمكن أداؤها باستخدام الروبوت التبلور، أو عن طريق التحويل اليدوي باستخدام ماصة 8 قنوات.
    1. نقل الخزان والبروتين والبذور الحلول الأسهم إلى قطرات من جهة أو مع الروبوت باستخدام وحدات التخزين بالتفصيل في 3.1. بعض الروبوتات التبلور المتاحة تجاريا عدم الاتصال الاستغناء، وأداء البذور نقل المخزون باستخدام مثل هذا النظام قد يؤدي إلى انسداد الأنابيب الاستغناء نصائح او المرتبطة بها. ترتيب صرفها هو متغير: بعض الروبوتات الاستغناء عن الحلول في وقت واحد. إذاهذا غير ممكن، الاستغناء البروتين أولا، ثم الخزان، ثم البذور الأسهم.
    2. إذا كان الاتصال الاستغناء الروبوت ليس نقل متوفرة بذور باستخدام حقنة الزجاج انخفاض حجم مزودة إبرة حادة. شطف إبرة بتمريرها من خلال حل الخزان ثم الاستغناء عن مخزون البذور في كل قطرة.
    3. ختم صينية باستخدام ورقة ختم شفافة ونقل إلى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة للتخزين.

4. التفتيش على بلورة الصواني

  1. تصور كل التجارب تبلور باستخدام المجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال. السابق يتيح عموما تحكم المستخدم أكبر على عمق الرؤية ودرجة التكبير من هذا الأخير، ولكن هو أكثر استهلاكا للوقت.
  2. تفتيش كل sub-well/coverslip في تسلسل وتسجيل أية أدلة على تشكيل الكريستال. يجب فحص التجارب مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة 5 أيام عقب إنشائها ون بعد ذلك مرة واحدة كل 7 أيام لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  3. غالبا ما يطلب من دورات متعددة من قبل rMMS يتم إنتاج بلورات الأمثل جودة الحيود.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(A) مثال لتجربة rMMS

للتدليل على فعالية rMMS فحص طبقنا هذا الأسلوب لبلورة الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض (HEWL) والكبد البقري الكاتلاز (BLC). كل من هذه الأنزيمات هي crystallizable بارز وهيكليا تتميز كذلك الأهداف 15 و 16. على هذا النحو على حد سواء تقديم اختبار المواضيع التي ممتازة لتوضيح تعزيز بلورة نسبة النجاح يمكن تحقيقه مع rMMS. أنشئت التجارب تبلور في 96 جيدا يجلس شكل علبة قطرة باستخدام الروبوتات التعامل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة التي وصفناها طريقة عامة لrMMS بلورة البروتين الفرز. لقد أثبتنا باستخدام اثنين من البروتينات اختبار بزيادة كبيرة في معدل نجاح تبلور باستخدام هذا الأسلوب. تحليل حيود باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS وأساليب غير rMMS-كشفت اختلاف بسيط في نوعية حيود بين بلورات نمت باستخدام إما الأسلوب، على الرغم من أن الكتاب السابق قد ذكرت أن بلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في التجارب rMMS 11، 13. HEWL وBLC قد أعطت نتائج شاذة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من BBSRC (BB/1006478/1). PRR هو المستفيد من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صواني تبلور الآبار MRC 96الأبعاد الجزيئية المحدودةMD11-00-100غير متوافق مع الأشعة فوق البنفسجية ، للشاشات التي أنشأها الروبوت
ClearView صفائح الختمMolecular Dimensions LtdMD6-01S
ليزوزيم بيض الدجاجالأبيض Sigma-AldrichL6876~ 95٪ نقاء
كبد البقر كاتيلازسيجما ألدريتشC9322 95٪ نقاء
XylanaseHampton ResearchHR7-104
Thaumatin من Thaumatococcus danielliiSigma-AldrichT7630
Thermolysin من Bacillus thermoproteolyticus rokkoSigma-AldrichP1512
JCSG-plus شاشة HT-96Molecular Dimensions LtdMD1-40للشاشات التي أنشأها الروبوت
PACT premier HT-96 شاشةالأبعاد الجزيئية المحدودةMD1-36للشاشات التي أنشأها الروبوت
Morpheus HT-96 شاشةالأبعاد الجزيئية المحدودةMD1-47للشاشات التي أنشأها الروبوت
Crystal Ph & # 8211 ؛ نظام مناولة السوائل نيكسArt Robbins Instruments602-0001-10
مجموعة حبة البذورهامبتون ريسيرشHR2-320
مجهر ستيريوLeicaM165C
شفرات مشرطSigma-AldrichS2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 & ل ماصةStarlabS7100-0125
ErgoOne 2-20 & mu ؛ ل ماصةStarlabS7100-0221
ErgoOne 100-1000 & mu ؛ ل ماصةStarlabS7100-1000
JCSG-plus شاشةالأبعاد الجزيئية المحدودةMD1-37للشاشات التي تم إنشاؤها يدويا
PACT premierMolecular Dimensions LtdMD1-29للشاشات التي تم إنشاؤها يدويا
شاشة MorpheusMolecular Dimensions LtdMD1-46للشاشات التي تم إنشاؤها بواسطة
ملاقطيدوية Sigma-AldrichT5415-1EA
أغطية CrystalClene 18 ممالأبعاد الجزيئية المحدودةMD4-17
2 مل زجاج ماصات باستورسيجما ألدريتشZ722669
خلاط دوامةفيشر ساينتفيك02-215-360
24 بئر علبة تبلور XRLأبعاد جزيئية محدودةMD3-11للشاشات التي تم إنشاؤها يدويا
30٪ (وزن / حجم) PEG 8000 ، 0.2 م كبريتات الأمونيوم ، 0.1 م كاكوديلات الصوديوم درجة الحموضة 6.5
20٪ (وزن / حجم) PEG 8000 ، 0.2 م أسيتات المغنيسيوم ، 0.1 م كاكوديلات الصوديوم درجة الحموضة 6.5
20٪ (وزن / حجم) PEG 6000 ، 100 ملي مولار حمض الستريك الرقم الهيدروجيني 5.0
مجهر شاشة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
  2. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  3. Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
  4. Bergfors, T. Seeds to crystals. J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
  6. Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
  7. Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
  8. Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
  9. Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
  10. Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
  11. D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
  12. Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
  13. Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
  14. Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
  15. Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
  16. Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة